全 文 ：收稿日期:2011 － 11 － 11
基金项目:浙江省教育厅资助项目(Y200909605)
作者简介:李元圆(1981 －) ，男，讲师，博士，研究方向:天然药物活
性成分的研究。
既能减少不良反应的发生，又能达到协同治疗 AHF 的目
的，值得临床推广应用。
参考文献
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tion，management and in － hospital outcomes of patients admitted
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乔松素在大鼠体内外代谢产物的
UPLC － MS /MS鉴定
李元圆1，赵婷2，徐冲2，王峥涛2，3
(1．浙江省医学高等专科学校，浙江 杭州 310053;2． 上海中医药大学教育部中药标准化重点实验室，上海 201203;
3．上海中药标准化研究中心，上海 201203)
摘 要:目的:以超高效液相质谱联用法鉴定了乔松素在大鼠体内外的代谢产物。方法:分析乔松素经大鼠
肝微粒体体外代谢和大鼠口服给药后的胆汁、尿液、粪便中的代谢产物，以超高效液相质谱联用法分离鉴定代谢
产物。结果:在大鼠肝微粒体和胆汁、尿液、粪便中共检测到 5 个代谢产物，根据裂解规律及与标准品对照，鉴定
了其中 3 个代谢产物的结构，推测了另外 2 个代谢产物的结构。结论:通过大鼠体内外代谢产物的比较，发现乔
松素的代谢途径主要是羟基化和葡萄糖醛酸化。其原型和柚皮素是在体内的主要作用形式，在胃肠道及肝脏中
的葡萄糖醛酸化是其代谢失活的主要途径。
关键词:乔松素;代谢产物;UPLC － MS /MS
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)04 － 0752 － 04
UPLC －MS/MS Analysis on Metabolites of Pinocembrin in Vivo and in Vitro
LI Yuan-yuan1，ZHAO Ting2，XU Chong2，WANG Zheng-tao2，3
(1． Zhejiang Medical College，Hangzhou 310053，Zhejiang，China;
2． The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines，Institute of Chinese Materia
Medica，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China;
3． Shanghai R＆D Centre for Standardization of Chinese Medicines，Shanghai 201203，China)
Abstract:Objective:To characterize the metabolism of pinocembrin in rat liver microsome and in vivo． Methods:The
metabolites of pinocembrin in rat liver microsome and in bile，urine，faeces were studied using UPLC － MS /MS method．
Result:Five metabolites were detected and identified． Their structures were elucidated on the basis of reference standard
and MS /MS spectra． Conclusion:The results indicated that the main metabolic pathways of pinocembrin were hydroxylation
and glucuronidation． Pinocembrin and naringenin were the effective components in vivo． Glucuronidation was the main
257
DOI：10.13193/j.archtcm.2012.04.82.liyy.045
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deactivation pathway of pinocembrin．
Key words:pinocembrin;metabolite;UPLC － MS /MS
草豆蔻为姜科植物草豆蔻 Alpinia katsumadai Hayata的
干燥近成熟种子，为常用中药，主要用于治疗寒湿内阻、脘
腹胀满冷痛、嗳气呕逆、不思饮食等症［1］。本实验室对草
豆蔻的有效成分进行过系统研究［2 － 5］。结果表明，乔松素
是草豆蔻的药效物质基础之一［6］，在抑制幽门螺旋杆菌、
抗病毒和促进胃肠蠕动等方面具有显著的药理活性［5，7 － 9］，
有较好的开发应用前景。但乔松素在体内的代谢过程未见
文献报道，作用形式不明。本研究首次应用超高效液相质
谱联用技术对乔松素在大鼠体外和体内的代谢产物进行了
鉴定和比较，阐明了乔松素在体内的转化形式，为其开发研
究奠定了理论基础。
1 材 料
1． 1 仪器
Waters Acquity UPLC，Quattro Premier XE 质 谱 仪
(Masslynx4． 1 软件) ，Avanti J － 25I 型高速冷冻离心机
(Beckmen) ，ULT － 1786 － 3 型 － 86℃超低温冰箱(Revco) ，
Himac CP100MX 型超高速冷冻离心机(Hitachi) ，BP211D
型电子天平(Sartorius) ，HGC － 24 型氮吹仪(天津市恒奥科
技发展有限公司)。
1． 2 药品与试剂
乔松素、柚皮素(上海中药标准化中心，纯度≥98%) ;
葡萄糖 － 6 －磷酸脱氢酶(D － glucose － 6 － phosephate dehy-
drogenase)、葡糖 － 6 －磷酸(G － 6 － P)购于 Sigma － Aldric
公司;Tris Base (AR)购于上海美季生物技术有限公司;
NADP +、UDPGA、Brij购于 Fluka公司;乙腈(色谱纯)购于
Merck公司;水为超纯水;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、MgCl2
购于上海国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析
纯;固相萃取柱购于天津琛航科技仪器有限公司。
1． 3 实验动物
雄性 SD大鼠 8 只［体重(230 ± 10)g］由上海中医药大
学实验动物中心提供。实验动物进食统一标准，自由饮水，
保持 12h明暗交替，在实验环境下适应一周。
2 方 法
2． 1 肝微粒体的制备
雄性 SD 大鼠 4 只禁食 12h，断头处死，尽量放出血
液，打开腹腔取出肝脏，生理盐水清洗后称重，在冰冷的
Buffer溶液中剪成碎块，在冰浴中制成匀浆，4℃ 下 9，
000r /min 离心 30min，上清液在 4℃下 105，000r /min 离
心 60min，沉淀用 Buffer 溶液重溶，在 4℃下 105，000r /
min离心 60min，沉淀即为肝微粒体，以 Buffer溶液重溶，
Lowry’s 法测定肝微粒体内的蛋白含量［10］，稀释至
10mg /mL 浓度分装，置 － 80℃贮存。
2． 2 尿液、粪便、胆汁样品的收集和预处理
2． 2． 1 尿液、粪便样品的收集和预处理 雄性 SD 大鼠
［体重(230 ± 10)g］8 只，饲养于代谢笼中。给药前禁食
12h，自由饮水，收集空白尿、粪样后，分别灌胃给予
120mg·kg －1的乔松素对照品，收集 0 ～ 24h，24 ～ 48h 的尿
样、粪便，置 － 20℃冰箱中保存备用。
取尿样 400μL，置于已处理好的 C18固相萃取柱上，先
用 2mL纯净水洗脱，继用 3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，
40℃氮气吹干，残渣以 600μL 30%的甲醇复溶并转移到离
心管中，20000r /min离心 10min，吸取上清液进样分析。大
鼠空白尿液同法处理。
取粪样 0． 5g，加 3mL 70%的甲醇，研碎，超声 20min，取
上清液 2mL置离心管中，20000r /min离心 10min，取上清液
1． 2mL，40℃氮气吹干，以 200μL 30%的甲醇复溶，20000r /
min离心 10min，吸取上清液进样分析。
2． 2． 2 胆汁样品的收集和预处理 雄性 SD 大鼠［体重
(230 ± 10)g］8 只。给药前禁食 12h，自由饮水。以乌拉坦
腹腔注射浅麻醉后，固定，打开腹腔，从腹部正中线切口，用
蘸少量肝素的塑料管插胆管，进行胆汁引流［11］，收集空白
胆汁。待大鼠清醒后，分别灌胃给予 120mg /kg的乔松素对
照品，收集 0 ～ 2h，2 ～ 4h，4 ～ 6h，6 ～ 8h，8 ～ 10h，10 ～ 12h 的
胆汁，置 － 20℃冰箱中保存备用。
取胆汁 200μL，置于已处理好的 C18固相小柱上，先用
2mL纯净水洗脱，继用 3mL 甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，
40℃氮气吹干，残渣以 300μL30%的甲醇复溶并转移到离
心管中，20000r /min离心 10min，吸取上清液进样分析。大
鼠空白胆汁样品同法处理。
2． 3 色谱条件
Acquity UPLC BEH C18柱(2． 1mm × 50mm，1． 7μm
美国 Waters公司) ;Van Guard BEH C18，1． 7μm 预柱(美
国 Waters公司) ;柱温 45℃;流动相为 A(0． 1%甲酸)和
B(乙腈) ，梯度洗脱见表 1;流速:0． 3mL /min;进样体
积:5μL。
表 1 乔松素代谢产物流动相梯度表
Time Flow %A %B Curve
Initial 0． 300 90． 0 10． 0 initial
0． 5 0． 300 71． 0 29． 0 6
4． 0 0． 300 71． 0 29． 0 6
5． 0 0． 300 5． 0 95． 0 1
6． 0 0． 300 90． 0 10． 0 1
2． 4 质谱条件
电喷雾离子源(ESI) ，正离子方式，毛细管电离电压:
3kV，锥孔电压:40V，萃取电压:2V，离子源温度:120℃，去
溶剂气温度:400℃，喷雾气:氮气，去溶剂气流速:500L·
h －1，锥孔气流量:50L·h －1，碰撞气为氩气，碰撞气流速:
0． 15mL /min。质谱扫描方式采用全扫(massscan) ，子离子
扫描(daughter scan)和选择离子监测(SIR)。
2． 5 肝微粒体孵育体系
2． 5． 1 肝微粒体Ⅰ相反应孵育体系 大鼠肝微粒体0． 5
mg /mL，D － glucose － 6 － phosephate(10mM)、D － glucose － 6
－ phosephate dehydrogenase (1unit /mL) ，MgCl2 (4mM) ，
Phosephate buffer(100mM，pH = 7． 4) ，NADP +(1mM) ，乔松
素(20μM) ，总体积 200μL，其中有机溶剂体积小于 1%。
设反应组，阴性组(NADP +以 buffer 代替)和空白组(底物
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以甲醇代替)。反应从加入 NADP + 开始，37℃孵育 30
min，加入冰冷乙腈 100μL，冰浴中止反应。20000r /min 离
心 10min，取上清液，进样分析。
2． 5． 2 肝微粒体Ⅱ相反应孵育体系 大鼠肝微粒体0． 5
mg /mL，MgCl2 (4mM) ，Brij (0． 05mg /mL) ，Tris － HCl
(50mM，pH = 7． 4) ，UDPGA(5mM) ，乔松素(20μM) ，总体
积 200μL，其中有机溶剂体积小于 1%。设反应组，阴性组
(UDPGA以 buffer代替)和空白组(底物以甲醇代替)。将
肝微粒体 0． 5mg /mL与 Brij(0． 05mg /mL)混匀，预孵 3min，
反应从加入 UDPGA 开始，37℃孵育 30min，加入冰冷乙腈
100μL，冰浴中止反应。20000r /min离心 10min，取上清液，
进样分析。
3 结 果
3． 1 乔松素及其代谢产物的质谱裂解规律
乔松素易发生碳 1，3 和碳 1，4 断裂，正离子模式下，其
准分子离子为［M + H］+ m /z257，二级质谱中，A 环主要裂
解碎片为 m/z153、m/z97，B环主要裂解碎片为 m/z131、m/
z103。乔松素的Ⅰ相羟基代谢产物，其准分子离子为［M +
H +16］+ m /z273，若羟基化发生在 A 环，其 A 环裂解碎片
增加 16，为 m/z169、m/z141(m/z169 － CO) ，若羟基化发生
在 B环，其 B 环裂解碎片增加 16，为 m/z147、m/z119。乔
松素的Ⅱ相葡萄糖醛酸化代谢产物，其准分子离子为［M +
H +176］+ m /z433，其二级质谱主要碎片离子为 m/z257、m/
z153、m/z131 和 m/z103。
图 1 乔松素主要质谱裂解方式
3． 2 代谢产物的 UPLC － MS /MS分析
3． 2． 1 乔松素在大鼠肝微粒体中代谢产物的分析 采用
UPLC － MS /MS联用法对乔松素大鼠肝微粒代谢反应组进
行分析，并与空白组、阴性组、柚皮素对照品进行对照。在
大鼠肝微粒体Ⅰ相代谢孵育体系中，检测到 m/z273 的代谢
产物 M1、M2、M3，见图 1。在大鼠肝微粒体Ⅱ相代谢孵育
体系中，检测到 m/z433 的代谢产物 M4，见图 2。在孵育体
系中都检测到了乔松素原型 m/z257。
(A．阴性对照组 m/z273;B． 反应组 m/z273;C． 反应组 m/z257;D．
柚皮素对照品 m/z273)
图 2 乔松素体外Ⅰ相代谢产物的选择离子流色谱图
(A．阴性对照组 m/z433;B．反应组 m/z433;C．反应组 m/z257)
图 3 乔松素体外Ⅱ相代谢产物的选择离子流色谱图
3． 2． 2 乔松素在大鼠体内代谢产物的分析 通过与空白
胆汁比较，在不同时间段收集的大鼠胆汁中检测到两个 m/
z433 的Ⅱ相代谢产物，见图 3。通过比较保留时间和二级
质谱主要碎片离子，确定其中一个为 M4。另一个编号为
M5。在 0 ～ 6h的大鼠胆汁中检测到乔松素原型，其含量随
时间下降，8h后已检测不到，说明其基本代谢完全。
(A．空白胆汁 m/z433;B． 给药后胆汁 m/z433;C． 给药后胆汁 m/
z257)
图 4 胆汁中代谢产物的选择离子流色谱图
通过与空白尿液样品比较，从给药后尿样中检测到 3
个代谢产物。比较保留时间和二级质谱主要碎片后，确定
这 3 个代谢产物分别为 M2、M4 和 M5，见图 4。在给药 24h
后的尿样中仍能检测到 M2 和乔松素原型，但未检测到 M4
和 M5。
(A．空白尿液 m/z273;B．给药后尿液 m/z273;C．空白尿液 m/z433;
D．给药后尿液 m/z433;E．给药后尿液 m/z257)
图 5 尿液中代谢产物的选择离子流色谱图
通过与空白粪便样品比较，从给药后粪便样品中检测
到 2 个代谢产物，比较其保留时间和二级质谱碎片后，确定
其分别与 M2 和 M4，见图 5。在给药 24h 后的粪便样品中
仍能检测到乔松素原型和少量 M4，但未检测到 M2。
3． 3 代谢产物的鉴定
M1、M2 的准分子离子［M + H］+为 m/z273，比原药乔
松素多 16。二级质谱主要碎片离子均为 m/z153、m/z147、
m/z119、m/z97。他们的 A环碎片与乔松素相同，B 环碎片
离 子m / z147、m / z119比乔松素B环碎片离子m / z131、
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(A．空白粪样 m/z273;B．给药后粪样 m/z273;C．空白粪样 m/z433;
D．给药后粪样 m/z433)
图 6 粪便样品中代谢产物的选择离子流色谱图
m/z103 多 16，说明 M1、M2 为乔松素的 B 环羟基化代谢产
物。M2 的准分子离子、二级质谱主要碎片、色谱保留时间
与标准品柚皮素完全一致，因此鉴定代谢产物 M2 为柚皮
素(naringenin)。黄酮类化合物肝微粒体体外代谢时 B 环
上易羟基化的位点为 2 位和 4 位［12 － 13］。M2 为 4＇位羟基化
产物，因此鉴定 M1 为乔松素的 2＇位羟基化产物，即 5，7，2＇
－三羟基二氢黄酮(5，7，2＇– trihydroxyflavanone)。
M3 的准分子离子［M + H］+为 m/z273，比原药乔松素
多 16。二级质谱主要碎片离子为 m/z169、m/z141、m/
z131、m/z103。A环碎片离子比乔松素多 16，B环碎片离子
与乔松素相同，说明 M3 为乔松素的 A 环羟基化产物［14］。
乔松素 A环可以羟基化的位点为 6 位和 8 位，因此，推断
M3 为 5，6，7 －三羟基二氢黄酮(dihydrobaicalein)或 5，7，8
－三羟基二氢黄酮(dihydronorwogonin)。
M4、M5 的准分子离子［M + H］+为 m/z433，比原药乔
松素多 176，二级质谱主要碎片离子为 m/z257、m/z153、m/
z131、m/z103 与乔松素一致，为乔松素的葡萄糖醛酸化代
谢产物。文献表明黄酮类化合物的 3 －，5 －，7 － 位羟基
中，经肝脏代谢时葡萄糖醛酸化主要发生在 7 － 位羟基
上［15 － 16］。根据肝微粒体和胆汁代谢产物的色谱图判断，
M4 为Ⅱ相代谢的主要产物，因此鉴定为乔松素 － 7 －葡萄
糖醛酸苷。推断 M5 为乔松素的 3 －位或 5 －位葡萄糖醛
酸化代谢产物。
4 讨 论
超高效液相质谱联用法相比传统液质联用法具有高通
量、高灵敏度、高分离度的优点，在中药代谢产物的分析鉴
定中有极大的应用潜力。本实验首次建立了以超高效液相
质谱联用法快速分析鉴定乔松素在大鼠体内外代谢产物的
方法，将分析时间缩短至 6min，同时可以获得代谢产物的
结构信息，为超高效液相质谱联用技术在中药活性成分代
谢研究中的应用打下了基础。
Ⅰ相代谢是药物的代谢活化过程，实验研究发现，乔松
素经大鼠肝微粒体代谢后，产生了 3 个Ⅰ相代谢产物，其中
只有柚皮素在尿液和粪便中被检测到，说明柚皮素是乔松
素代谢后的入血成分，是其在体内的作用形式之一。Ⅱ相
代谢是药物的代谢失活过程，乔松素的体内外Ⅱ相代谢产
物在组成和含量上都有所不同，在体外仅检测到 1 个Ⅱ相
代谢产物乔松素 － 7 －葡萄糖醛酸苷(M4) ，且含量较高。
在胆汁和尿液中除检测到 M4 外还检测到 1 个Ⅱ相代谢产
物 M5，含量也与体外不同，说明大鼠口服给药乔松素后，在
胃肠道中也发生了代谢转化，造成了体内外代谢结果的差
异。本研究中部分代谢产物的结合位点仍需通过化学和波
谱手段进一步鉴定，这些工作将在后续研究中进一步完善。
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