全 文 ：7) ，151． 8(C － 8) ，107． 5 (C － 8a) ，102． 2(C － 8b) ，184． 1(C －
9) ，56． 3(3 － OCH3)。以上光谱数据与文献［2］报道的 bellidifod-
in数据一致。
2． 2． 3 化合物Ⅲ mp 297 ～ 300℃(乙醇)。TLC 板喷浓 H2SO4 显
紫红色，醋酐 －浓 H2SO4 反应(Libermann － Burchard 反应)呈紫
色，1H － NMR(500 MHz ，CDCl3) :5． 30(1H，t，J =3． 6 Hz，12 － H) ，
3． 24(1H，dd，J =11． 0，4． 4 Hz，3 － H) ，1． 16，1． 00，0． 95，0． 94，0． 80，
0． 77，0． 75(3H，s，7 × CH3)。13C － NMR(125 MHz，CDCl3) :38． 4
(C －1) ，27． 1(C －2) ，79． 0(C － 3) ，39． 2(C － 4) ，55． 2(C － 5) ，18．
3(C －6) ，32． 6(C － 7)39． 3(C － 8) ，47． 6(C － 9) ，38． 4(C － 10) ，
22． 9(C －11) ，122． 6(C －12) ，143． 6(C － 13) ，41． 0(C － 14) ，27． 7
(C －15) ，23． 4(C － 16) ，47． 6(C － 17) ，41． 0(C － 18) ，45． 8(C －
19) ，30． 6(C －20) ，33． 8(C －21) ，32． 4(C － 22) ，28． 1(C － 23) ，15．
5(C －24) ，15． 3(C －25) ，17． 1(C － 26) ，25． 9(C － 27) ，182． 9(C －
28) ，33． 0(C －29) ，23． 6(C －30)。以上数据与文献［3］报道一致，
鉴定为齐墩果酸(oleanolic acid)。样品与标准品齐墩果酸 TLC结
果 Rf值相等，1∶ 1混合测得熔点不变。
化合物 IV:白色粉末，mp 110 ～ 112℃。样品与标准品獐牙
菜苦苷 TLC结果 Rf值相等 1∶ 1 混合测得熔点不变，说明化合物
IV为獐牙菜苦苷(swertamarin)。
3 讨论
我们首次对宾川獐牙菜植物进行化学成分研究，从其低极性
部位分离鉴定出 2 个 酮化合物和 1 个三萜化合物，从正丁醇部
分得到 1 个环烯醚萜苷，它们均为首次从该植物中分离到。三萜
化合物齐墩果酸的量较多，该化合物具有保肝活性，可能为该植
物民间应用的主要活性成分之一。其中两个 酮的含量也比较
大，有必要进一步研究其生理活性。
参考文献:
［1］ 中国科学院中国植物志编委会． 中国植物志，第 62 卷［M］． 北京:
科学出版社，1988:344．
［2］ 张媛媛，管 棣，谢青兰，等． 大籽獐牙菜化学成分研究［J］．中国
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［3］ 白玉华，于 辉，常乃丹，等． 日本苦苣菜的化学成分研究［J］． 中
国药科大学学报，2008，39(3) :279．
收稿日期:2010-06-04; 修订日期:2010-11-31
基金项目:江苏省自然科学基金(No． BK2007122)
作者简介:池小妹(1976-) ，女(汉族) ，江苏南京人，现任江苏省南京市白
下区建中中医院主管中药师，主要从事中草药资源研究工作．
喀西茄 AFLP技术体系的建立与优化
池小妹1，庄 勇2
(1．江苏省南京市白下区建中中医院，江苏 南京 210004; 2．江苏省农业科学院，江苏 南京 210014)
摘要:目的 研究建立一套适合于喀西茄的 AFLP技术体系。方法 比较 CTAB法和改良 CTAB法提取 DNA的效果;设置
不同浓度梯度的引物、dNTPs和 Mg2 +，优化选择性扩增体系。结果 改良 CTAB 法提取的 DNA 质量优于 CTAB 法，加入
50 ng /μl 的两种引物各 1． 0 μl，2 mmol /L dNTPs 2． 4 μl和 25 mmol /L Mg2 + 1． 6 μl的选择性扩增体系最优。结论 建立了
适合于喀西茄的 AFLP技术体系。
关键词:喀西茄; AFLP; 技术体系
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 05． 021
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2011)05-1087-02
Construction and Optimization of AFLP Technological System for Solanum khasianum
CHI Xiao － mei1，ZHUANG Yong2
(1． Jianzhong Hospital of Chinese Medicine，Nanjing 210004，China;2． Jiangsu Academy of Agricultural Sci-
ences，Nanjing 210014，China)
Abstract:Objective To construct an AFLP technological system for S． khasianum．Methods Two methods，CTAB and modified
CTAB were used for DNA extraction and compared with DNA quality． The contents of primers，dNTPs and Mg2 + in PCR solutions
were optimized for selective amplification． Results The quality of DNA extracted by modified CTAB was better than that by CTAB．
PCR solutions with 50 ng /μl each primer 1． 0 μl，2 mM dNTPs 2． 4 μl and 25 mM Mg2 + 1． 6 μl showed the best performance in
selective amplification． Conclusion An AFLP technological system for S． khasianum was constructed．
Key words:S． khasianum; AFLP; Technological System
喀西茄 S． khasianum Clarke，为栽培茄子(S． melongena)的近
缘野生种。它主要以新鲜或晒干的果实和叶片入药，味微苦，性
寒，小毒，具有祛风止痛和清热解毒功效，主治风湿痹痛、头痛、牙
痛、乳痈、痄腮、跌打疼痛和小儿惊厥［1］。此外，人工合成类固醇
类药物和性激素的重要前体 －澳州茄碱(Soasodine)在其果实中
的含量也非常丰富，在印度它已作为提取澳州茄碱的重要经济作
物而大面积种植。因此，喀西茄是一种非常具有开发前景的药用
植物。
AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是在 RFLP
(Restriction fragment length polymorphism)和 RAPD(Random am-
plified polymorphic DNA)基础上发展起来的，基于 PCR 反应的一
种选择性扩增限制性片段的方法，具有多态性丰富、DNA 用量
少、无需预知基因组序列信息、稳定性好等优点，在遗传多样性分
析［2］、图谱构建［3］、基因定位［4］、品种鉴定［5］、分子辅助育种［6］等
领域具有广泛的应用前景。虽然已有许多作物开展了 AFLP 技
术研究，但不同作物的具体特性不同，其 AFLP 关键技术体系也
存在差异。因此本研究旨在建立一套适合于喀西茄的 AFLP 技
术体系，从而为品种分子改良、品种鉴定及重要功能基因的鉴定
奠定基础。
1 材料
喀西茄 S． khasianum，引自 CGN(Centre for Genetic Resources，
The Netherlands) ，种质资源编号 CGN22906。
2 方法
2． 1 DNA提取 分别利用 CTAB［5］法和改良 CTAB 法提取喀西
茄的新鲜幼叶 DNA，具体改进措施包括增加 1 次氯仿 /异戊醇抽
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 5 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期
提和 2 次酒精洗涤以减少酚类和色素的污染。DNA 经 RNase A
处理后溶解于 200 μl TE 溶液中，用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳检测
DNA的完整度，紫外分光光度计检测 DNA 的浓度，浓度调整至
50 ng /μl备用。
2． 2 酶切和连接 取约 300 ng DNA，采用 Eco RI和 Tru 9进行双酶
切。酶切体系 40 μl，内含 DNA 6 μl，10 U/μl Eco RI和 Tru 9各 0． 5
μl，10 × Multicore buffer 4． 0 μl。37℃酶切 3h后，立即置于冰上，加
入连接体系 10 μl，内含 10 × Multicore buffer 1． 0 μl，5 pmol /μl Eco
RI 接头 1． 0μl，50 pmol /μl Tru 9接头 1． 0 μl，5 U/μl T4 连接酶 0． 2
μl，10 mol /L ATP 1． 0 μl。16℃连接过夜，－20℃保存。
2． 3 预扩增和和选择性扩增 PCR 扩增在 MJ PTC － 100 thermal
cycler上进行。预扩增和选择性扩增的引物序列见表 1。
表 1 AFLP预扩增和选择性扩增引物序列
预扩增引物
E00 M00
5＇－ GACTGCGTACCAATTC － 3＇ 5＇－ GATGAGTCCTGAGTAA －3＇
选择性扩增引物
E － AA M － CAG
5＇－ GACTGCGTACCAATTCAA －3＇ 5＇－ GATGAGTCCTGAGTAACAG －3＇
预扩增反应体系 25 μl，内含酶切连接产物 5 μl、10 ng /μl
E00和 M00 各 3 μl，2 mmol /L dNTP 2 μl，5 U /μl Taq聚合酶 0． 2
μl，10 × PCR buffer 2． 5 μl，反应程序为:94℃ 60 s ，56℃ 60 s，
72℃ 60 s，35 个循环，10℃保存。用 1． 2%琼脂糖凝胶电泳检测
预扩增产物的片段大小和浓度，预扩增产物稀释 30 倍后用于选
择性扩增。
选用 E － AA和 M － CAG引物组合进行选择性扩增，反应体
系 20μl，内含预扩增产物稀释产物 5μl，10 × PCR buffer 2μl，5U /
μl Taq聚合酶0． 2μl，对引物、Mg2 +和 dNTPs 设置不同浓度梯度
(见表 2) ，筛选出最佳的选择性扩增体系。反应程序为:94℃30 s
，65℃30 s，72℃60 s，12 个循环;94℃30 s ，56℃30 s，72℃60 s，24
个循环，10 ℃保存。
表 2 AFLP选择性扩增体系 μl
体系
引物
(50 ng /μl)
dNTPs
(2mmol /L)
Mg2 +
(25mmol /L)
体系
引物
(50 ng /μl)
dNTPs
(2mmol /L)
Mg2 +
(25mmol /L)
1 1． 0 1． 2 0． 8 10 1． 4 1． 2 0． 8
2 1． 0 1． 2 1． 2 11 1． 4 1． 2 1． 2
3 1． 0 1． 2 1． 6 12 1． 4 1． 2 1． 6
4 1． 0 1． 8 0． 8 13 1． 4 1． 8 0． 8
5 1． 0 1． 8 1． 2 14 1． 4 1． 8 1． 2
6 1． 0 1． 8 1． 6 15 1． 4 1． 8 1． 6
7 1． 0 2． 4 0． 8 16 1． 4 2． 4 0． 8
8 1． 0 2． 4 1． 2 17 1． 4 2． 4 1． 2
9 1． 0 2． 4 1． 6 18 1． 4 2． 4 1． 6
2． 4 变性聚丙稀酰胺凝胶电泳及银染 选择性扩增产物在 6%
的变性聚丙稀酰胺凝胶上进行电泳分离，条带的显色参照采用硝
酸银染色法［7］。
3 结果
3． 1 DNA质量 利用改良 CTAB法提取的基因组 DNA的质量优
于 CTAB法。非变性琼脂糖电泳检测时可以看到两种方法提取
的 DNA电泳条带都整齐明亮，无弥散(图 1a) ，说明所提 DNA 无
降解;经紫外分光光度计检测，改良 CTAB 法样品的 A260 /A280值
为 1． 8，A260 /A230值为 2． 1，表明所提 DNA 纯度较高，基本无蛋白
质、酚类和色素污染，而 CTAB法提取 DNA 的 A260 /A230值为 1． 8，
杂质污染较重。以上结果说明利用改良 CTAB 法从喀西茄叶片
中提取的基因组 DNA质量较好，可以满足 AFLP分析的要求。
3． 2 预扩增产物检测 预扩增产物电泳检测时表现为一片连续
均匀的弥散带(图 1b) ，产物片段大小分布在 100 bp和 500 bp之
间，说明酶切比较完全，预扩增效果较好，符合进一步进行选择性
扩增的要求。根据预扩增产物在紫外灯检测下的亮度，将预扩增
产物稀释 30 倍用于下面选择性扩增的体系优化。
图 1 DNA(a)和 AFLP预扩增产物(b)琼脂糖凝胶电泳检测图
3． 3 选择性扩增体系的优化 不同选择性扩增体系的扩增结果
存在很大差异。从图 2 可以看出，体系中引物各加入 1 μl 时(泳
道 1 ～ 9) ，可扩增出较多的条带，效果明显优于各加入 1． 4 μl 引
物时扩增效果(泳道 10 ～ 18) ;dNTPs 加入量对扩增产物条带数
目的多少影响不大，但当加入 1． 2 μl 且 Mg2 +加入 0． 8μl 和 1． 2
μl时，几乎无扩增产物(泳道 1、10、11) ;Mg2 +加入 1． 6 μl 时的
扩增效果最好(泳道 3，6，9，12，15，18) ，加入 0． 8 μl 时则基本无
扩增产物。由以上分析可知，加入两种引物各 1． 0 μl、dNTPs 2． 4
μl和 Mg2 + 1． 6 μl的体系(泳道 9)可获得最佳的扩增效果。
图 2 不同选择性扩增体系的 PCR产物变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测结果
4 讨论与结论
AFLP是一种高效的分子标记技术，但它步骤繁琐，程序复
杂，从 DNA 的提取、双酶切、片段的预扩增和选择性扩增，以及凝
胶电泳和银染，每一个环节都有严格的技术要求，否则很难获得
理想的结果。其中 DNA 的充分酶切和高效的选择性扩增是
AFLP技术体系的关键。因此本文围绕高质量基因组 DNA 的提
取和选择性扩增体系的优化开展研究，建立了 AFLP 技术体系，
从而为在喀西茄遗传改良和品种鉴定中应用该技术奠定了基础。
本研究建立的喀西茄 AFLP 技术体系包括两个关键内容。
一是针对由于喀西茄叶片中含有较多的酚类物质和色素，采用改
良的 CTAB法提取 DNA，通过增加氯仿 /异戊醇抽提和酒精洗涤
的次数提高了 DNA的纯度，从而为进一步的酶切提供了高质量
的 DNA;二是建立了高效的选择性扩增体系(总体积 20 μl) :模
板 DNA 5 μl，10 × PCR Buffer 2． 0 μl，5 U /μl Taq聚合酶 0． 2 μl，
50 ng /μl 的两种引物各 1． 0 μl，2 mmol /L dNTPs 2． 4 μl，25 mmol /
L Mg2 + 1． 6 μl和 H2O 6． 8 μl。
参考文献:
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 5