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普洱茶提取物及普洱茶多糖对人成纤维细胞抗衰老作用机制研究



全 文 :云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University,2015,30 (2):219 - 227 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 - 390X;CODEN YNDXAX E-mail:ynauzkxb@ foxmail. com
收稿日期:2013 - 12 - 12 修回日期:2014 - 11 - 07 网络出版时间:2015 - 03 - 13 15:56
* 基金项目:云南省教育厅重点基金项目 (2012Z022)。
作者简介:王媛 (1987—),女,黑龙江双城人,硕士研究生,主要从事细胞与分子生物学研究。
E-mail:473280093@ qq. com
**通信作者Corresponding author:徐志强 (1973—),男,云南宣威人,硕士,讲师,主要从事畜产品品质与安全控
制研究。E-mail:xuzhiqiang1974@ sina. com
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20150313. 1556. 009. html
DOI:10. 16211 / j. issn. 1004-390X(n). 2015. 02. 009
普洱茶提取物及普洱茶多糖对人成纤维
细胞抗衰老作用机制研究*
王 媛1,2,荣 华1,初晓辉1,豆腾飞1,高 玲1,
谷大海3,林秋叶1,曹振辉1,葛长荣1,贾俊静1,徐志强3**
(1. 云南农业大学 动物科学技术学院,云南省动物营养与饲料科学重点实验室,云南 昆明 650201;
2. 广西玮美生物科技有限公司,广西 南宁 530105;3. 云南农业大学 食品科学学院,云南 昆明 650201)
摘要:本文通过比较普洱茶提取物、普洱茶多糖、葡萄籽提取物、绿茶提取物、绿茶多酚及维生素 C 6 种天
然抗氧化物对体外培养人衰老成纤维细胞 (HDF)的作用机制,研究普洱茶等天然抗氧化物对抗复制性衰老
的作用功效。试验建立了 HDF 衰老细胞模型,用含低质量浓度 (3. 125,6. 250 μg /mL),中质量浓度
(12. 500,25. 000 μg /mL)和高质量浓度 (50. 000,100. 000 μg /mL)的 6 种组分的培养基培养 1 ~ 7 d,采用
MTT法及荧光定量 PCR比较细胞的增殖能力、相对存活率以及细胞 SOD1,SOD2,CAT,GPx 及线粒体 D310
和 D-loop基因的表达量。结果显示:低质量浓度组的 6 种天然抗氧化物和中、高质量浓度组的普洱茶多糖和
维生素 C能显著提高衰老 HDF 细胞的增殖能力 (P < 0. 05);绿茶多酚和绿茶提取物可提高衰老 HDF 细胞
SOD1,SOD2,D310 和 D-loop基因的表达量;普洱茶多糖可显著提高 SOD1,GPx和 D-loop基因的表达量;维
生素 C能显著提高 SOD1 和 GPx基因的表达量。可见,6 种天然组分均有延缓 HDF 细胞复制性衰老的功效,
且不同天然抗氧化组分之间对细胞的抗衰老功效具有不同的细胞、分子作用机制。
关键词:普洱茶提取物;普洱茶多糖;人成纤维细胞;抗衰老;抗氧化酶
中图分类号:R 151. 41 文献标志码:A 文章编号:1004 - 390X (2015)02 - 0219 - 09
Effects of Natural Antioxidant Extracts on the
Molecular Mechanism of Anti-aging in HDF
WANG Yuan1,2,RONG Hua1,CHU Xiaohui1,DOU Tengfei1,GAO Lin1,
GU Dahai3,LIN Qiuye1,CAO Zhenhui1,GE Changrong1,JIA Junjing1,XU Zhiqiang3
(1. Yunnan Provincial Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science,Yunnan Agricultural University,Kunming
650201,China;2. Guangxi Weimei Bio-Tech.,Ltd,Nanning 530105,China;3. College of food science,
Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)
Abstract:The purpose of this study is to investigate the effects of natural antioxidants (grape seed ex-
tract,green tea extract,green tea polyphenols,Pu-erh tea extract,Pu-erh tea polysaccharide)on the
molecular mechanism of anti-aging in old cell model of HDF. After establishment of old cell model,the
HDF cells were cultured in the medium containing different concentrations natural antioxidants with low
concentration (3. 125,6. 250 μg /mL),medium concentration (12. 500,25. 000 μg /mL)and high
concentration (50. 000,100. 000 μg /mL)from Day 1 to Days 7. The ability of HDF proliferation was
determined by using MTT method. Total RNA was extracted from each culture treatment to determine
expressions of SOD1,SOD2,CAT,GPx,mitochondrial D310 and D-loop genes. It has been shown
that the low concentration treatments of all natural antioxidants significantly increased the proliferation
ability in old HDF. In medium and high concentration treatments,only the treatments from Pu-erh tea
polysaccharide and Vc were observed to increase significantly proliferation ability of HDF. The green
tea extract and green tea polyphenols treatments significantly up-regulated expressions of SOD1,
SOD2,mitochondrial D310 and D-loop genes of old HDF cell. Pu-erh tea treatments significantly up-
regulated expressions of SOD1,GPx and D-loop genes while Vc treatments significantly up-regulated
expressions of SOD1 and GPx genes old HDF cell. All natural antioxidants treatments from current
study were observed to have anti-aging function. Compared with others,Pu-erh tea polysaccharide
showed high ability of anti-aging in HDF cell. It has been shown that there were different molecular
mechanisms or pathways for the natural antioxidants affecting on anti-aging functions in HFD cell.
Keywords:Pu-erh tea extract;Pu-erh tea polysaccharide;human fibroblasts;anti-aging;antioxidant
enzyme
人口老龄化问题日趋严重,衰老机理和抗衰
老药物的研究已成为现代生命科学领域的重要研
究课题。自由基代谢失衡所造成的生物大分子氧
化损伤是衰老、心脑血管疾病、癌症等退行性疾
病发生的共通点[1 - 2]。因此,解决氧化问题可能
是延缓衰老最有效的途径之一。机体通过抗氧化
防御系统参与自由基的清除来保护生物体免受氧
化损伤。主要的抗氧化酶防御体系包括过氧化氢
酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)、Cu /
Zn-超氧化歧化酶 (胞液 - SOD,SOD1)和 Mn-
SOD (线粒体-SOD,SOD2),是清除自由基的第
一条防御系统[3]。普洱茶、绿茶及葡萄籽的抗氧
化功效及其活性成分已有大量深入的研究。然而,
对于这些天然抗氧化组分的抗氧化、抗衰老的细
胞代谢机制、分子机理尚未阐明。本试验以体外
培养的人衰老成纤维细胞 (HDF)细胞作为抗衰
老研究模型,观察普洱茶提取物、普洱茶多糖、
绿茶提取物、绿茶多酚及葡萄籽提取物对 HDF 细
胞生长增殖能力的影响,以分析其能否延缓 HDF
细胞的复制性衰老,探讨普洱茶等天然抗氧化提
取物对抗复制性衰老的作用功效。
1 材料与方法
1. 1 材料
人成纤维细胞系 HDF (上海佛雷堡生物科技
发展有限公司),胰蛋白酶 (25% EDTA)、MTT、
DMSO (Sigma 公司),胎牛血清、DMEM (Hy-
clone公司),绿茶提取物 (1 ∶ 10)、绿茶多酚
(99%)、葡萄籽提取物 (含 95%原花青素)(长
沙旭禾生物科技有限公司),普洱茶提取物与普
洱茶多糖 (云南农业大学食品学院提供)。
1. 2 方法
1. 2. 1 衰老细胞模型
采用人的成纤维细胞系 (HDF)接种于含有
10%胎牛血清、50 mg /L 青霉素,100 mg /L 链霉
素的 H-DMEM培养基上,放于培养瓶中,置恒温
培养箱 (37 ℃,5% CO2)内培养,观察细胞贴
壁和生长情况。细胞增殖至培养瓶壁 80%左右,
细胞生长旺盛时,可以用 0. 25%胰蛋白酶消化、
收集细胞、计数传代。将 HDF细胞进行连续传代
培养,使细胞达到复制性衰老,模拟人体内细胞,
建立细胞衰老模型;用 β-半乳糖苷酶试剂盒检测
细胞衰老情况[4],细胞群体倍增系数大于 35 时细
胞达到复制性衰老[4]。
1. 2. 2 衰老 HDF细胞生长增殖能力及相对存活率
培养的 1,2,3,4,5,6,7 d 时分别用 MTT
法检测细胞生长增殖情况。每孔加入 5 g /L的 MTT
溶液20 μL,放入培养箱中孵育 4 h,然后移去原培
养基,每孔中加入二甲基亚砜 (DMSO)150 μL,
置摇床上低速振荡 10 min,使结晶物充分溶解。于
酶联免疫检测仪 492 nm 波长处检测光密度值
(OD),并计算细胞相对存活率,公式如下:
细胞相对存活率 =试验组 OD 值 /对照组 OD
值 × 100%。
022 云南农业大学学报 第 30 卷
1. 2. 3 衰老 HDF 细胞抗氧化酶及线粒体基因表
达测序
根据 NCBI (GenBank)中发表的人的 β-ac-
tin,SOD1,SOD2,GPx,CAT,D-loop,D310 基
因序列设计引物,引物序列由宝生物工程有限公
司合成。引物序列信息见表 1。用 Trizol (TaKaRa
宝生物工程有限公司)试剂提取 1. 2. 2 中所培养
的细胞的总 RNA,采用北京全式金生物工程技术
服务有限公司提供的试剂盒进行反转录合成 cD-
NA。采用实时荧光定量 PCR 仪 (Bio-Rad,美
国)和 SYBR-Green 荧光定量试剂盒 (iQTM
SYBR-Green Supermix,TaKaRa 宝生物工程有限
公司)检测细胞中 SOD1,SOD2,GPx,CAT,D-
loop,D310 的基因表达量,反应体系按照产品说
明书进行操作。
表 1 实时荧光定量 PCR引物序列
Tab. 1 Real-time RT-PCR parameter of primers
基因名称
genes
引物序列 primer sequence
D-loop
F:5’- tat cttttggcggtatgc act tttaac agt - 3’
R:5’- tga tga gat tag taggggagt gg - 3’
D310
F:5’- cac acagacatcataacaaaaaatttc c - 3’
R:5’- ggt gttagggttctttgtttt tgg - 3’
CAT
F:5’- ttt ccc aggaagatcctg ac - 3’
R:5’- acc ttggtgagatcgaat gg - 3’
GPx
F:5’- aga atgtggcgt ccc tct ga - 3’
R:5’- cag ctcgtt cat ctgggtgta g - 3’
SOD1
F:5’- ggt cctcactttaatcctcta t - 3’
R:5’- cat ctttgt cag cagtca cat t - 3’
SOD2
F:5’- ttc tggacaaacctcagc cc - 3’
R:5’- agt ttgatggcttccagc a - 3’
β-actin
F:5’- tca ccc acactgtgcccatctacg a - 3’
R:5’- cag cggaaccgctcattgccaatg g - 3’
1. 3 统计方法
采用 SPSS 17. 0 软件进行统计分析,统计数据
以平均数 ±标准差 (SD)表示,用 One-way ANOVA
进行方差分析与显著性检验,P≤0. 05 表示差异显
著。采用人 β-actin基因作为看家基因矫正目标基因,
基因表达数据表示为各处理组目标基因相对于对照
组倍数变化 (Folds Change)。△Ct =目标基因 Ct -
看家基因 Ct,△△Ct =处理组△Ct -未处理组△Ct,
基因表达倍数 (Fold change) = 2 -△△Ct,即相对对
照 mRNA上调几倍或下调几倍 (Fold change)来表
示目标基因的表达量。
2 结果与分析
2. 1 HDF衰老细胞模型的建立
连续传代培养到 10 代以上使细胞达到复制性
衰老,模拟人体内细胞建立细胞衰老模型。用 β -
半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况 (图 1),细
胞群体倍增系数大于 35 时细胞达到复制性衰老,
本试验已经建立了衰老细胞模型。
2. 2 不同质量浓度的相同天然提取物对 HDF 细
胞增殖能力的影响
MTT可透过细胞膜进入细胞内,活细胞线粒
体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT还原为难溶于
水的蓝紫色甲臜结晶并沉积在细胞中,结晶物能
被二甲基亚砜溶解,用酶标仪在 492 nm波长处测
定其光密度值可间接反映活细胞数量,进而说明
5 种天然提取物对细胞生长增殖能力的影响。
2. 2. 1 维生素 C对细胞增殖能力的影响
试验结果如表 2 所示:添加低、中质量浓度
组维生素 C 培养到 3,4,5,6,7 d,细胞增殖
能力均出现不同程度的高于对照组,而添加高
质量浓度维生素 C 的培养组,培养的 1,3,4,
5,6,7 d 的细胞增殖能力显著高于对照组
(P≤0. 05);所有维生素 C 质量浓度组分随培养
时间增加,细胞增殖能力有逐渐增大的趋势。
适当质量浓度的维生素 C 能有效提高衰老的
HDF细胞增殖能力。
122第 2 期 王 媛,等:普洱茶提取物及普洱茶多糖对人成纤维细胞抗衰老作用机制研究
表 2 维生素 C对细胞增殖能力的影响
Tab. 2 Effects of vitamin C on the proliferation ability in HDF
ρ / (μg·
mL -1)
OD值 OD value
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d
对照组
(NC)
0. 377 ± 0. 031 0. 482 ± 0. 040 0. 577 ± 0. 037 0. 462 ± 0. 034 0. 577 ± 0. 060 0. 674 ± 0. 028 0. 686 ± 0. 262
3. 125 0. 368 ± 0. 010 0. 508 ± 0. 009 0. 636 ± 0. 018* 0. 513 ± 0. 006* 0. 651 ± 0. 031* 0. 801 ± 0. 024* 0. 932 ± 0. 013*
6. 250 0. 355 ± 0. 009 0. 480 ± 0. 019 0. 592 ± 0. 006 0. 472 ± 0. 010 0. 616 ± 0. 006* 0. 783 ± 0. 010* 0. 849 ± 0. 049*
12. 500 0. 361 ± 0. 012 0. 459 ± 0. 014 0. 613 ± 0. 018* 0. 523 ± 0. 022* 0. 565 ± 0. 043 0. 769 ± 0. 033* 0. 927 ± 0. 021*
25. 000 0. 376 ± 0. 004 0. 462 ± 0. 021 0. 589 ± 0. 017 0. 511 ± 0. 025* 0. 650 ± 0. 026* 0. 776 ± 0. 044* 0. 849 ± 0. 043*
50. 000 0. 436 ± 0. 008* 0. 451 ± 0. 040 0. 582 ± 0. 034 0. 503 ± 0. 016* 0. 647 ± 0. 019* 0. 787 ± 0. 031* 0. 909 ± 0. 027*
100. 000 0. 429 ± 0. 062* 0. 485 ± 0. 016 0. 621 ± 0. 005* 0. 580 ± 0. 006* 0. 673 ± 0. 026* 0. 837 ± 0. 052* 0. 922 ± 0. 024*
注:“* ”表示差异显著 (P≤0. 05),下同。
Note:“* ” represents significant different at 0. 05 levels,the same as below.
2. 2. 2 葡萄籽提取物对细胞增殖能力的影响
如表 3 所示:用含量为 3. 125 μg /mL 的葡萄
籽提取物的培养基培养细胞 5 ~ 7 d,细胞增殖能
力显著高于对照组 (P≤ 0. 05),而用含量为
100. 000 μg /mL的培养基孵育 5 ~ 7 d,细胞增殖
能力显著低于对照组 (P≤0. 05);其他差异不显
著。但数据显示,随时间的累积低质量浓度组细
胞增殖能力大于高质量浓度组,且 1 ~ 7 d 里高质
量浓度组细胞增殖能力表现为先升高后下降的
趋势。
表 3 葡萄籽提取物对细胞增殖能力的影响
Tab. 3 Effects of grape seed extracts on the proliferation ability in HDF
ρ / (μg·
mL -1)
OD值 OD value
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d
对照组
(NC)
0. 377 ± 0. 031 0. 482 ± 0. 040 0. 577 ± 0. 037 0. 462 ± 0. 034 0. 577 ± 0. 060 0. 674 ± 0. 028 0. 686 ± 0. 262
3. 125 0. 349 ± 0. 035 0. 519 ± 0. 048 0. 634 ± 0. 045 0. 531 ± 0. 073 0. 716 ± 0. 082* 0. 838 ± 0. 051* 0. 962 ± 0. 016*
6. 250 0. 331 ± 0. 035 0. 482 ± 0. 033 0. 576 ± 0. 052 0. 466 ± 0. 077 0. 605 ± 0. 033 0. 713 ± 0. 047 0. 780 ± 0. 051
12. 500 0. 367 ± 0. 034 0. 475 ± 0. 035 0. 564 ± 0. 034 0. 494 ± 0. 061 0. 558 ± 0. 054 0. 687 ± 0. 009 0. 803 ± 0. 057
25. 000 0. 400 ± 0. 041 0. 499 ± 0. 034 0. 556 ± 0. 033 0. 500 ± 0. 038 0. 628 ± 0. 031 0. 680 ± 0. 037 0. 700 ± 0. 038
50. 000 0. 400 ± 0. 001 0. 450 ± 0. 059 0. 537 ± 0. 035 0. 550 ± 0. 020 0. 560 ± 0. 030 0. 600 ± 0. 020* 0. 542 ± 0. 010
100. 000 0. 385 ± 0. 029 0. 424 ± 0. 053 0. 530 ± 0. 028 0. 403 ± 0. 031 0. 466 ± 0. 040* 0. 414 ± 0. 035* 0. 405 ± 0. 039*
2. 2. 3 绿茶多酚对细胞增殖能力的影响
如表 4 所示:当培养基中茶多酚含量为
3. 125 μg /mL 时,培养的第 5 天,细胞增殖能
力开始显著高于对照组 (P≤0. 05)。而含量
为 25. 000,50. 000,100. 000 μg /mL 的培养基
培养的细胞增殖能力,除 100. 000 μg /mL 的培
养的第 1 天外,均低于对照组,且在 50. 000
和 100. 000 μg /mL 培养的 3,6 d 时表现为差异
显著 (P≤0. 05)。5 d 后相同的时间点,细胞
增殖能力表现为低质量浓度促进,高质量浓度
抑制的作用。
2. 2. 4 绿茶提取物对细胞增殖能力的影响
如表 5 所示:用绿茶提取物含量为 3. 125,
6. 250 μg /mL的培养基培养 HDF 细胞,细胞增殖
能力均高于对照组,且从 2 d开始差异显著 (P≤
0. 05),而 25. 000 ~ 100. 000 μg /mL质量浓度组的
细胞增殖能力,除 100. 000 μg /mL 培养的第 4 天
外,在 3 ~ 7 d 均小于对照组,并且在 3,4,6 d
时差异显著 (P≤0. 05)。
2. 2. 5 普洱茶提取物对细胞增殖能力的影响
如表 6 所示:含量为 3. 125 μg /mL 普洱茶提
取物培养基培养 HDF细胞第 5 天开始,细胞增殖
能力显著高于对照组 (P≤0. 05),而 25. 000 ~
100. 000 μg /mL的培养基培养的细胞,细胞增殖
能力小于对照组,且在 3 d和 6 d表现为差异显著
(P≤0. 05)。
222 云南农业大学学报 第 30 卷
表 4 绿茶多酚对细胞增殖能力的影响
Tab. 4 Effects of green tea polyphenols on the proliferation ability in HDF
ρ / (μg·
mL -1)
OD值 OD value
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d
对照组
(NC)
0. 377 ± 0. 031 0. 482 ± 0. 040 0. 577 ± 0. 037 0. 462 ± 0. 034 0. 577 ± 0. 060 0. 674 ± 0. 028 0. 686 ± 0. 262
3. 125 0. 386 ± 0. 040 0. 528 ± 0. 056 0. 577 ± 0. 039 0. 543 ± 0. 048 0. 698 ± 0. 051* 0. 767 ± 0. 042* 0. 879 ± 0. 039*
6. 250 0. 399 ± 0. 037 0. 540 ± 0. 062 0. 559 ± 0. 024 0. 503 ± 0. 042 0. 678 ± 0. 082 0. 656 ± 0. 033 0. 766 ± 0. 007
12. 500 0. 329 ± 0. 064 0. 444 ± 0. 036 0. 512 ± 0. 053 0. 464 ± 0. 050 0. 590 ± 0. 054 0. 648 ± 0. 012 0. 712 ± 0. 008
25. 000 0. 346 ± 0. 037 0. 429 ± 0. 057 0. 500 ± 0. 035 0. 452 ± 0. 037 0. 562 ± 0. 045 0. 585 ± 0. 003* 0. 638 ± 0. 026
50. 000 0. 367 ± 0. 040 0. 448 ± 0. 063 0. 490 ± 0. 044* 0. 454 ± 0. 047 0. 576 ± 0. 067 0. 564 ± 0. 037* 0. 589 ± 0. 037
100. 000 0. 445 ± 0. 022 0. 440 ± 0. 044 0. 481 ± 0. 045* 0. 445 ± 0. 066 0. 503 ± 0. 031 0. 532 ± 0. 023* 0. 556 ± 0. 004
表 5 绿茶提取物对细胞增殖能力的影响
Tab. 5 Effects of green tea extract on the proliferation ability in HDF
ρ / (μg·
mL -1)
OD值 OD value
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d
对照组
(NC)
0. 377 ± 0. 031 0. 482 ± 0. 040 0. 577 ± 0. 037 0. 462 ± 0. 034 0. 577 ± 0. 060 0. 674 ± 0. 028 0. 686 ± 0. 262
3. 125 0. 421 ± 0. 014 0. 548 ± 0. 015* 0. 611 ± 0. 008 0. 541 ± 0. 015* 0. 739 ± 0. 009* 0. 834 ± 0. 037* 0. 886 ± 0. 019*
6. 250 0. 424 ± 0. 005 0. 574 ± 0. 017* 0. 589 ± 0. 016 0. 550 ± 0. 009* 0. 741 ± 0. 061* 0. 777 ± 0. 023* 0. 846 ± 0. 002
12. 500 0. 441 ± 0. 023* 0. 480 ± 0. 028 0. 548 ± 0. 013 0. 480 ± 0. 014 0. 594 ± 0. 031 0. 623 ± 0. 038 0. 673 ± 0. 056
25. 000 0. 396 ± 0. 005 0. 471 ± 0. 009 0. 511 ± 0. 004* 0. 419 ± 0. 022* 0. 554 ± 0. 011 0. 554 ± 0. 023* 0. 608 ± 0. 033
50. 000 0. 417 ± 0. 007 0. 486 ± 0. 015 0. 509 ± 0. 012* 0. 411 ± 0. 009* 0. 568 ± 0. 014 0. 524 ± 0. 026* 0. 525 ± 0. 036
100. 000 0. 392 ± 0. 052 0. 506 ± 0. 008 0. 522 ± 0. 021* 0. 496 ± 0. 014 0. 552 ± 0. 007 0. 548 ± 0. 037* 0. 526 ± 0. 033
表 6 普洱茶提取物对细胞增殖能力的影响
Tab. 6 Effects of Pu-erh tea extract on the proliferation ability in HDF
ρ / (μg·
mL -1)
OD值 OD value
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d
对照组
(NC)
0. 377 ± 0. 031 0. 482 ± 0. 040 0. 577 ± 0. 037 0. 462 ± 0. 034 0. 577 ± 0. 060 0. 674 ± 0. 028 0. 686 ± 0. 262
3. 125 0. 421 ± 0. 014 0. 548 ± 0. 015* 0. 611 ± 0. 008 0. 541 ± 0. 015* 0. 739 ± 0. 009* 0. 834 ± 0. 037* 0. 886 ± 0. 019*
6. 250 0. 424 ± 0. 005 0. 574 ± 0. 017* 0. 589 ± 0. 016 0. 550 ± 0. 009* 0. 741 ± 0. 061* 0. 777 ± 0. 023* 0. 846 ± 0. 002
12. 500 0. 441 ± 0. 023* 0. 480 ± 0. 028 0. 548 ± 0. 013 0. 480 ± 0. 014 0. 594 ± 0. 031 0. 623 ± 0. 038 0. 673 ± 0. 056
25. 000 0. 396 ± 0. 005 0. 471 ± 0. 009 0. 511 ± 0. 004* 0. 419 ± 0. 022* 0. 554 ± 0. 011 0. 554 ± 0. 023* 0. 608 ± 0. 033
50. 000 0. 417 ± 0. 007 0. 486 ± 0. 015 0. 509 ± 0. 012* 0. 411 ± 0. 009* 0. 568 ± 0. 014 0. 524 ± 0. 026* 0. 525 ± 0. 036
100. 000 0. 392 ± 0. 052 0. 506 ± 0. 008 0. 522 ± 0. 021* 0. 496 ± 0. 014 0. 552 ± 0. 007 0. 548 ± 0. 037* 0. 526 ± 0. 033
2. 2. 6 普洱茶多糖对细胞增殖能力的影响
如表 7 所示:6 个质量浓度的普洱茶多糖
培养基培养的细胞与对照组相比,细胞增殖
能力均表现为上升的趋势,且除 1,2 d 的
12. 500 μg /mL 质量浓度组外,其他组均表现
为差异显著 (P≤0. 05)。因此普洱茶多糖能
有效提高衰老 HDF 细胞的增殖能力,延缓细
胞衰老。
322第 2 期 王 媛,等:普洱茶提取物及普洱茶多糖对人成纤维细胞抗衰老作用机制研究
表 7 普洱茶多糖对细胞增殖能力的影响
Tab. 7 Effects of Pu-erh tea polysaccharide on the proliferation ability in HDF
ρ / (μg·
mL -1)
OD值 OD value
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d
对照组
(NC)
0. 377 ± 0. 031 0. 482 ± 0. 040 0. 577 ± 0. 037 0. 462 ± 0. 034 0. 577 ± 0. 060 0. 674 ± 0. 028 0. 686 ± 0. 262
3. 125 0. 379 ± 0. 038 0. 558 ± 0. 063 0. 540 ± 0. 034 0. 553 ± 0. 049 0. 717 ± 0. 065* 0. 801 ± 0. 066* 0. 876 ± 0. 050*
6. 250 0. 350 ± 0. 050 0. 464 ± 0. 037 0. 463 ± 0. 040* 0. 507 ± 0. 069 0. 598 ± 0. 065 0. 667 ± 0. 034 0. 718 ± 0. 037
12. 500 0. 333 ± 0. 039 0. 486 ± 0. 059 0. 466 ± 0. 036* 0. 491 ± 0. 053 0. 593 ± 0. 057 0. 654 ± 0. 056 0. 671 ± 0. 054
25. 000 0. 370 ± 0. 039 0. 502 ± 0. 051 0. 449 ± 0. 037* 0. 456 ± 0. 062 0. 563 ± 0. 047 0. 554 ± 0. 027* 0. 564 ± 0. 033
50. 000 0. 409 ± 0. 049 0. 471 ± 0. 067 0. 433 ± 0. 037* 0. 450 ± 0. 065 0. 506 ± 0. 051 0. 571 ± 0. 045* 0. 648 ± 0. 234
100. 000 0. 372 ± 0. 041 0. 462 ± 0. 048 0. 424 ± 0. 060* 0. 425 ± 0. 064 0. 507 ± 0. 050 0. 539 ± 0. 053* 0. 521 ± 0. 046
2. 3 不同天然提取物和质量浓度对衰老 HDF 细
胞的影响
以天然提取物质量浓度对细胞相对存活率作
曲线,培养时间为 6 d 作图 (图 2)。可以看出:
质量浓度为 3. 125 μg /mL 的 6 种天然提取物培养
的细胞存活率均增加,其中普洱茶多糖培养的细
胞存活率最大;随着葡萄籽提取物、绿茶提取物、
绿茶多酚、普洱茶提取物质量浓度的增加,细胞
的存活率逐渐降低,绿茶提取物、绿茶多酚、普
洱茶提取物降低情况相近;而普洱茶多糖、Vc 培
养的细胞随着培养物质量浓度的增加,细胞存活
率有逐渐增加的趋势。
2. 4 不同天然提取物抗衰老作用细胞、分子机制
将衰老HDF细胞用含天然提取物的培养基处理
24 h后,以未经处理的衰老 HDF细胞作为对照,检
测抗氧化酶系统 SOD1,SOD2,GPx,CAT,D310,
D - loop基因mRNA表达量的变化。以基因表达量相
对于对照组的倍数变化和天然提取物质量浓度作图。
图 3 显示:普洱茶多糖、绿茶多酚及葡萄籽
提取物处理组上调 SOD1 基因表达,其中,普洱
茶多糖 12. 5 μg /mL处理组、绿茶多酚及葡萄籽提
取物 50 μg /mL 处理组显著上调 SOD1 基因表达
(P≤0. 05);而 12. 5,25,50 μg /mL普洱茶提取
物组 SOD1 的表达量显著降低 (P≤0. 05)。绿茶
提取物处理的各质量浓度组及 50 μg /mL绿茶多酚
处理组均显著上调 SOD2 基因表达 (P≤0. 05);
而葡萄籽提取物 50 μg /mL 处理组显著下调 SOD2
基因表达 (P≤0. 05)。
图 4显示:普洱茶多糖、绿茶多酚、葡萄籽提
取物及维生素 C处理组均上调 GPx基因表达,其中,
普洱茶多糖处理的各质量浓度组及 25. 50 μg /mL 绿
茶多酚、葡萄籽提取物及维生素 C 处理组显著上
调 GPx 基因表达 (P≤0. 05)。绿茶多酚 50 μg /
mL处理组显著上调 CAT 基因表达 (P≤0. 05);
葡萄籽提取物中、高计量处理组显著下调 CAT 基
因表达 (P≤0. 05)。
图 5 显示:普洱茶多糖、绿茶多酚及绿茶提
取物处理组上调线粒体 D-loop mRNA 表达,其
中,普洱茶多糖及绿茶提取物处理的各质量浓度
组显著上调 D-loop mRNA表达 (P≤0. 05);而葡
萄籽提取物中、高剂量处理组显著下调 D-loop
mRNA表达 (P≤0. 05)。D310 基因表达结果显
示,普洱茶提取物、绿茶多酚及绿茶提取物处理
组上调线粒体 D310 mRNA 表达,其中,绿茶提
取物各质量浓度处理组、普洱茶提取物低、高质
量浓度处理组及绿茶多酚高质量浓度处理组显著
上调 D310 mRNA表达 (P≤0. 05)。
422 云南农业大学学报 第 30 卷
3 讨论
3. 1 普洱茶提取物及其多糖对衰老 HDF 细胞增
殖能力的影响
衰老是宇宙的自然规律。成纤维细胞
(HDF)为正常二倍体细胞,随着代龄的增加会
逐渐出现衰老迹象,细胞增殖能力逐渐降低,细
胞数量逐渐减少[6]。体外长期培养的 HDF 细胞,
在不断地传代培养过程中达到复制性衰老,是一
个很好的模仿自然衰老过程的模型[7]。本试验对
建立的衰老 HDF细胞模型添加低水平的普洱茶提
取物及中高水平的普洱茶多糖,能显著提高衰老
HDF 细胞的增殖能力 (P≤ 0. 05)。1956 年由
JOHNSON和 HARMAR提出了衰老自由基学说,指
出由于活性氧的攻击造成细胞许多生物大分子的氧
化损伤,可能是造成细胞衰老的直接原因[1,8]。
522第 2 期 王 媛,等:普洱茶提取物及普洱茶多糖对人成纤维细胞抗衰老作用机制研究
因此提示普洱茶提取物及其多糖提高衰老 HDF细
胞增殖能力的原因可能是保护衰老 HDF细胞免受
氧化损伤。
3. 2 普洱茶提取物及其多糖对衰老 HDF 细胞抗
氧化酶系统的影响
SOD1,SOD2,GPx,CAT是机体抗氧化的第
一道防御系统;衰老细胞在自然进程中自由基不
断地累积,抗氧化酶活性退化。并且与年轻细胞
相比较,复制性衰老的 HDF 细胞的抗氧化酶 (
CAT,SOD1,SOD2 和 GPx )活性以及 mRNA 的
表达量显著降低[9]。本试验中普洱茶多糖显著提
高衰老 HDF细胞 SOD1,GPx基因的表达量 (P≤
0. 05)。同样的研究报道显示,普洱茶具有较强
的羟自由基和 DPPH自由基清除能力[10],能够影
响小鼠肝组织抗氧化酶活性[11]。因此,添加的普
洱茶多糖可能直接清除细胞内的自由基,或作为
抗氧化酶的辅助因子协同作用与衰老 HDF细胞抗
氧化酶系统,减少细胞氧化损伤延缓衰老。同时
本实验还得到,在低、中及高质量浓度处理组,
绿茶多酚和绿茶提取物能提高衰老 HDF 细胞
SOD1,SOD2 基因的表达量;维生素 C 也显著提
高 SOD1 和 GPx基因的表达量 (P≤0. 05)。这些
天然提取物同样可以作为外源的抗氧化物,保护
细胞增殖活力。
3. 3 普洱茶提取物及其多糖对衰老 HDF 细胞线
粒体基因的影响
细胞线粒体既是细胞内 ROS 的主要来源也是
ROS攻击的目标,一些与衰老有关的氧化损伤在
线粒体 DNA (mtDNA)上被发现,尤其在线粒体
DNA的复制调控区内[12]。D-loop基因是线粒体基
因组中唯一的非编码区和复制起始位点,D310 基
因决定 mtDNA复制的起始,极易被氧化损伤[13]。
本试验结果显示,添加普洱茶多糖显著提高衰老
HDF细胞的线粒体 D-loop 基因的表达量。因此,
普洱茶多糖可能通过保护衰老 HDF细胞线粒体免
受氧化损伤和完整性,从而保护细胞延缓衰老。
本试验还得到,普洱茶提取物也能够显著提高
D310 基因表达量,因此,提示普洱茶提取物中仍
有其他物质能够调节线粒体 D310 基因的表达量。
而高质量浓度的普洱茶提取物虽然能够保护线粒
体基因但仍然显著抑制衰老 HDF细胞的增殖,并
且随着时间的累积,抑制效果越来越显著。之前
的报道研究显示,普洱茶水提物在 50 μg /mL剂量
培养 3T3 前脂肪细胞 24h 能够促进 3T3 细胞的增
殖,而在 100 μg /mL 剂量时在 24h 开始抑制 3T3
前脂肪细胞的增殖,从 96 h 开始显著抑制 3T3 细
胞的增殖[14]。因此,普洱茶提取物对细胞增殖的
调节是双向的,其作用机理仍需进一步的研究。
3. 4 其他天然提取物对衰老 HDF细胞的影响
本试验显示,适量的维生素 C、葡萄籽提取
物、绿茶多酚、绿茶提取物 4 种天然抗氧化物对
衰老 HDF细胞的增殖能力均有一定的促进效果。
自由基能引起脂质过氧化反应,生成丙二醛
(MDA),与生物膜中磷脂蛋白反应,使生物膜的
622 云南农业大学学报 第 30 卷
基本特性发生改变[15]。本试验中,中高质量浓度
的葡萄籽提取物对衰老 HDF细胞增殖、抗氧化酶
系统和线粒体基因表达量的调节作用结果一致,
其原因可能是通过对抗氧化酶系统的高质量浓度
抑制作用,从而影响衰老细胞的线粒体及其增殖
能力。MENG 等[9] 的 研 究 表 明,绿 茶 多 酚
(EGCG)能够协同作用于抗氧化酶系统,并对线
粒体的完整性具有保护作用。本试验中,24 h 内
50 μg /mL绿茶多酚对衰老 HDF 细胞的增殖以及
抗氧化酶基因和线粒体基因的保护作用显著,绿
茶提取物能够促进 SOD2 基因的表达,与其研究
结果一致。
4 结论
6 种天然组分均有延缓 HDF 细胞的复制性衰
老功效,不同的天然抗氧化组分之间对细胞的抗
衰老功效具有不同的细胞、分子作用机制。
[参考文献]
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