全 文 ：·中药与天然药物·
基于 Gabor小波变换压缩和偏最小二乘判别分析的土牛膝药材 HPLC图谱鉴别
马 骁1，2，姚泽炳3，江 舟1，王 建1(1. 福州大学化学学院 福州 350108;2. 福建省计量科学研究院 福州
350003;3. 福建省福州市药品检验所 福州 350007)
摘要:目的 通过 HPLC指纹图谱研究，快速有效评价土牛膝质量。方法 以怀牛膝和川牛膝做为对照，采用高效液相色谱法，对不同产地、不
同批号的 8 批土牛膝进行齐墩果酸和蜕皮甾酮的含量测定，同时对图谱进行 Gabor小波变换压缩与偏最小二乘法判别分析。结果 HPLC-DAD
法能有效检验土牛膝中的齐墩果酸和蜕皮甾酮含量，该方法重现性、精密度、稳定性试验 ＲSD 均小于 5%，分类结果显示:8 批河南产怀牛膝，8
批四川产川牛膝药材的化学组成一致性好，但野生土牛膝化学组成较复杂、差异性大。结论 该方法可以在一定意义上判断药材的类别，为有
效控制野生药材质量提供参考。
关键词:Gabor小波变换压缩;偏最小二乘;牛膝;高效液相色谱法
中图分类号:Ｒ282. 71 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2015)-03-1228-0031-04
作者简介:马 骁，女(1985. 6 －)。毕业于中国计量学院。职称:工
程师
基金项目:福州大学科技发展基金，2014-XQ-8
Identification of Achyranthes by HPLC Based on Gabor Wavelet Trans-
form Compression and Partial Least Squares Discriminant Analysis
MA Xiao1，2，YAO Ze-bing3，JIANG Zhou1，WANG Jian1(1. College of Chemistry，Fuzhou University，Fuzhou
350108，China;2. Fujian Metrology Institute，Fuzhou 350003，China;3. Fuzhou Institute for Drug Control，
Fuzhou 350007，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To appraise the quality of Achyranthes quickly and effectively by HPLC fingerprint
method. METHODS Achyranthes bidentata Bl. and Cyathula officinalis Kuan were experimented as control，using
HPLC method was used to determine the contents of oleanolic acid and ecdysterone in eight batches Achyranthes from
different locations and batches，then the data of chromatogram was analyzed by Gabor wavelet transform compressin
and partial least squares discriminant analysis. ＲESULTS The HPLC-DAD method can test the contents of oleanol-
ic acid and ecdysterone in Achyranthes effectively. ＲSD of reproducibility，precision，stability test ＲSD were all less
than 5%. The results showed that the chemical compositions of eight batches produced in Henan and Sichuan had
good consistency，however，the chemical compositions of Achyranthes were more complex，and had huge differ-
ences. CONCLUSION This method can determine the category of herbs in a certain sense，and provide a reference
for the effective control of the quality of wild herbs.
KEY WOＲDS:Gabor wavelet transform compression;Partial least squares;Achyranthes bidentata Bl;HPLC
怀牛膝为苋科植物牛膝(学名:Achyranthes bidentata Bl. )
的干燥根〔1〕，其性味苦、甘、酸、平，归肝、肾经，有补肝肾，强筋
骨，逐瘀通经，引血下行之功〔2〕。川牛膝为苋科杯苋属植物
川牛膝(学名:Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，是著名的
川产道地药材之一，具有逐瘀痛经，通利关节，利尿通淋的功
效〔3〕。土牛膝别名倒扣草，为苋科牛膝属植物，以根或全草
入药，具有明显的抗炎抗菌作用、镇痛作用、抗衰老等作
用〔4〕。现代药理研究表明牛膝中含有甾体、甾酮、皂苷、异黄
酮和多糖等多种成分〔5 ～ 10〕。怀牛膝、川牛膝和土牛膝在外观
上有较大差异，其药理作用也略不相同。土牛膝虽然并未被
《中国药典》收载，但是在市场上畅销。由于土牛膝产地来源
广泛，质量影响因素较多，为了明确土牛膝药材质量的差异，
区分怀牛膝、川牛膝与土牛膝之间有效化学成分的差异，避免
这 3 种药物之间的误用，是合理利用其资源的基础性研究工
作。由于目前对土牛膝的质量控制仅限于性状鉴别、显微鉴
别，基于此本论文比较了不同产地土牛膝药材质量的差异，重
点分析了土牛膝与怀牛膝的有效成分相似性。中国药典中鉴
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别怀牛膝是以齐墩果酸、蜕皮甾酮做为对照品，因此，本文采
用齐墩果酸和蜕皮甾酮含量做为评价土牛膝药材有效成分质
量的重要依据。再使用 Gabor 小波变换压缩-偏最小二乘判
别分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis)对牛膝的
色谱数据建模，以期建立一种简便、实用的鉴别模型，从而实
现对土牛膝药材质量的简便、快速鉴别。
1 仪器与药品
1. 1 仪器 LC-20AD 高效液相色谱仪，SPD-M20A 二极管阵
列检测器，LC-solution 色谱工作站(日本岛津公司)，KQ-
500WDE型三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司)，BP211D Sartorius电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限
公司)，Mill-Q 超纯水机(Millipore 公司)，GM-0. 33Ⅱ型津腾
隔膜真空泵，药材粉碎机等。
1. 2 药品 蜕皮甾酮(批号 111638-200402，中国药品生物制
品检定研究所)，齐墩果酸(批号 110709-200304，中国药品生
物制品检定研究所)，乙腈为色谱纯，超纯水(自制)，甲酸(分
析纯)，无水乙醇(分析纯)。川牛膝(1 ～ 8)、怀牛膝(9 ～ 16)、
土牛膝(17 ～ 24)各 8 批，分别来自于市售各大药店(见表 1)。
2 实验方法
2. 1 色谱条件 选用 Agilent Extend-C18(4. 6mm × 250mm，
5μm)色谱柱，检测波长范围 200nm ～ 500nm，进样量为 10μL，
柱温为 35℃，流速为 1. 0mL·min －1，蜕皮甾酮流动相为乙腈
∶水∶甲酸(16∶84∶ 0. 1)，齐墩果酸流动相乙腈 ∶水(88∶ 12) ，运
行时间 15min。
表 1 牛膝药材来源
编号 名称 产地 批号
1 川牛膝 1 四川 121021
2 川牛膝 2 四川 130313
3 川牛膝 3 四川 110206
4 川牛膝 4 四川 130620
5 川牛膝 5 四川 130501
6 川牛膝 6 四川 120908
7 川牛膝 7 四川 111026
8 川牛膝 8 四川 130821
9 怀牛膝 1 河南 20130601
10 怀牛膝 2 河南 130216
11 怀牛膝 3 河南 12011201
12 怀牛膝 4 河南 120208
13 怀牛膝 5 河南 131120
14 怀牛膝 6 河南 20130901
15 怀牛膝 7 河南 20130810
16 怀牛膝 8 河南 130417
17 土牛膝 1 福建 110011
18 土牛膝 2 福建 无
19 土牛膝 3 福建 无
20 土牛膝 4 福建 130101
21 土牛膝 5 福建 130508
22 土牛膝 6 福建 121101
23 土牛膝 7 广西 121010
24 土牛膝 8 福建 111010
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 对照品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的蜕皮甾酮
11. 50mg至 10mL量瓶中，乙腈定容，制成浓度为 1. 15mg·
mL －1的溶液;精密称取干燥至恒重的齐墩果酸 15. 75mg 至
50mL量瓶中，制成 0. 315mg·mL －1的溶液。摇匀，过 0. 45μm
微孔滤膜，备用。
2. 2. 2 蜕皮甾酮供试品溶液的制备〔11〕:精密称取牛膝药材
粉末(过三号筛)约 2g，置具塞锥形瓶中，加水饱和正丁醇
30mL，密塞，浸泡过夜，超声处理(50℃，功率 300KW，频率
50kHz)30min，滤过，用甲醇 10mL分数次洗涤容器及残渣，合
并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至 10mL 量瓶
中，加甲醇至刻度，作为供试品溶液。
2. 2. 3 齐墩果酸供试品溶液的制备〔12〕:精密称取牛膝药材
粉末(过三号筛)约 2g，置圆底烧瓶中，加 2mol·L －1盐酸溶液
40mL，80℃水浴回流 2h，冷却至室温，过滤，滤渣用蒸馏水洗
至中性，60℃烘干，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇 30mL，超声
处理(50℃，功率 300KW，频率 50kHz)30min，滤过，滤渣重复
超声 1 次，合并两次超声提取液，水浴蒸干，用乙腈定容至
10mL，作为供试品溶液。
3 实验结果与讨论
3. 1 HPLC方法学考察
3. 1. 1 稳定性实验:分别取 3 种牛膝的某一批号供试品溶
液，分别在 0、1、2、4、8、16、24、48h检测。结果表明，峰面积占
总峰面积 1%以上的峰，其色谱峰的相对保留时间和峰面积
的比值基本没有明显变化(ＲSD 均在 5%以内)，样品溶液基
本稳定。
3. 1. 2 精密度实验:分别取 3 种牛膝的第二批供试品溶液，
连续进样 5 次，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一
致性。结果表明，峰面积占总峰面积 1%以上的峰，其色谱峰
的相对保留时间和峰面积的比值基本没有明显变化(ＲSD 均
在 5%以内)，符合指纹图谱技术要求。
3. 1. 3 重复性实验:分别取 3 种牛膝的第二批的粗粉各 5
份，按照供试品溶液的制备方法平行制得 15 份供试品溶液，
依 2. 1 的实验方法测定考察色谱峰的相对保留时间、峰面积
比值的一致性。结果表明，峰面积占总峰面积 1%以上的峰，
其色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值基本没有明显变化
(ＲSD均在 5%以内)，符合指纹图谱技术要求。
3. 2 色谱数据的预处理
从图 1，2 中可以看出，在 3min 前，有一个大的杂质洗脱
峰，考虑到齐墩果酸保留时间在 8 ～ 9min左右，蜕皮甾酮保留
时间在 7 ～ 8min左右，齐墩果酸最大吸收波长在 200nm以下，
蜕皮甾酮最大吸收波长在 246nm。为提高样品测定灵敏度，
使主要成分有较强吸收响应。后续模式识别中，截取保留时
间从 3min 到 10min，以及波长从 200nm 到 350nm 的二维数
据。在以上范围内等间距选取 128 × 128 矩阵，用于模式识别
研究。
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海峡药学 2015 年 第 27 卷 第 3 期
图 1 齐墩果酸提取工艺得到的供试品的 HPLC-DAD结果
(土牛膝 7#，广西，批号 121010)
图 2 蜕皮甾酮提取工艺得到的供试品的 HPLC-DAD结果
(土牛膝 8#，福建，批号 111010)
图 3 210nm处，川牛膝、怀牛膝、土牛膝依齐墩果酸
提取工艺得到的供试品的 HPLC图谱
3. 3 不同批次药材的指纹图谱对比 比较各地的药材的指
纹图谱可见，不同地区的药材之间的化学成分有较大差异。
怀牛膝以栽培为主，相对含量十分稳定。土牛膝中，有的药材
提取物中齐墩果酸相对峰面积较高，但是蜕皮甾酮相对峰面
积较小，这些差异的形成可能和牛膝种源、原产地、采收期、生
长年限及存储等因素有关。所以综合考察齐墩果酸和蜕皮甾
酮，建立怀牛膝的指纹图谱共有模式，对野生土牛膝的品质进
行综合评价，可以为地道药材怀牛膝的真伪鉴别及品质评价
提供重要参考依据。
图 3 结果显示，对照品齐墩果酸在 8. 1min 处出峰，对应
怀牛膝供试品，都有检出齐墩果酸，而川牛膝均未检出;土牛
膝提取物较复杂，有部分土牛膝类似怀牛膝的组成，部分和川
牛膝的图谱相似。
图 4 结果显示，对照品蜕皮甾酮在 7. 9min 处出峰，对应
怀牛膝供试品，都有该物质被检出，而川牛膝供试品中均未检
出;部分土牛膝类似怀牛膝的组成，但部分土牛膝类似川牛膝
的组成。
3. 4 特征值提取 采用 Gabor小波变换压缩处理，提取特征
数值的方法大大简化的计算量〔13〕。Gabor变换是传统傅里叶
分析和小波变换间的过渡方法。傅里叶分析将一段较长的时
间内的信号看作按一定规律周期性变化，分析信号的频率成
分;Gabor变换是在要分析的信号上提取出信号中的每一个
小段，将此小段进行两端周期性延拓，进行传统傅里叶分析，
得到此小段内信号的频率特性，平移原有分析信号中小段的
位置，得到整个要分析信号在每个小范围内频率成分。每个
药材供试品的二维数据(128 × 128)经过压缩处理得到 1 × 80
的一维数据。3 种药材样品分别得到维数 8 × 80 的特征值变
量数据矩阵 X，供偏最小二乘建模使用。
图 4 246nm处，川牛膝、怀牛膝、土牛膝依蜕
皮甾酮提取工艺得到的供试品的 HPLC图谱
偏最小二乘判别分析(PLS-DA)预测使用 SIMCA-P 软件
进行〔14〕。PLS模型是通过最小化误差平方和，找到一组数据
的最佳匹配函数，建立线性判别模型，利用模型对个体属性进
行判断。本研究将中药怀牛膝和川牛膝的指纹图谱的整体轮
廓，即二维数据点，提取出一维数据点 16 × 80，作为输入变
量;产地作为输出指标(怀牛膝设为 2，川牛膝设为 1)，得到
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16 × 1 的应变量数据矩阵;通过训练，建立偏最小二乘回归数
学模型，进而用于土牛膝的品质预测，评价药材的质量。
为了对比，我们也选择齐墩果酸的较大吸收波长 210nm，
和蜕皮甾酮的最大吸收波长 246nm处的色谱曲线，带入 Sim-
cap中进行计算。怀牛膝、川牛膝各 8 条色谱曲线数据(16 ×
128)组成输入变量，产地信息(16 × 1)作为输出指标，进行训
练。采用土牛膝样品(8 × 128)做为模拟实验。土牛膝品质
较多接近怀牛膝(见表 2)。
表 2 齐墩果酸提取工艺得到的供试品色谱的偏最小二乘分析结果
样品号
210nm处
色谱
246nm处
色谱
全谱提取
特征值
1 1. 841* 2. 085* 1. 8048*
2 1. 104 1. 743 1. 2877
3 1. 861* 2. 137* 1. 9385*
4 1. 054 1. 195 1. 6607
5 1. 044 1. 309 1. 2734
6 0. 912 1. 381 1. 2527
7 2. 001* 2. 131* 2. 1583*
8 1. 513 1. 162 0. 6261
ＲMSECV 0. 0875 0. 1912 0. 1345
ＲMSEE 0. 0392 0. 1816 0. 1092
* 表示结果范围处在 1. 8 ～ 2. 2 之间，化学组成更接近怀牛膝
表 3 蜕皮甾酮提取工艺得到的供试品色谱的偏最小二乘分析结果
样品号
210nm处
色谱
246nm处
色谱
全谱提取
特征值
1 1. 061 0. 923 1. 3531
2 1. 114 1. 423 1. 2079
3 1. 896* 1. 955* 1. 8964*
4 1. 464 1. 749 1. 5972
5 1. 201 1. 594 1. 5251
6 0. 996 1. 071 1. 1636
7 1. 103 0. 971 0. 8917
8 1. 571 1. 901* 1. 5324
ＲMSECV 0. 0971 0. 0573 0. 1845
ＲMSEE 0. 0571 0. 0364 0. 1120
* 表示结果范围处在 1. 8 ～ 2. 2 之间，化学组成更接近怀牛膝
PLS所用的因子数为 3，如果所用因子数太多，虽然对校
正集中样品的校正结果很好，但是对没有在校正集中样品的
预测结果会很差。采用单一波长色谱曲线为描述变量时，交
叉验证均方差(ＲESECV)和校正均方根误差(ＲMSEE)虽然可
能小于采用全谱数据特征值作为样品描述变量所建立的模
型。但是植物提取物成分复杂，不同波长的选取带有人为性，
结果可能不一致。全谱数据用 Gabor 小波变换压缩特征值，
大大减少了运算量，也能得到满意结果，体现了全局化的结
果，更准确，更稳定。综合考虑 2 种怀牛膝特征组分(齐墩果
酸、蜕皮甾酮)可提高判断的准确率。综合齐墩果酸和蜕皮
甾酮的结果，3#土牛膝品质上最接近怀牛膝。
4 结论
指纹图谱分析一般是积分每个色谱图中较大的共有色谱
峰，获得其峰面积，组成保留时间-峰面积数据矩阵。本文方
法直接利用色谱工作站导出的色谱轮廓，不需要峰面积做模
式分类。鉴于 HPLC-DAD数据量大，本文基于二维色谱数据
的小波变换系数来构建指纹图，经小波变换，仍保留大部分的
光谱和色谱信息。当数据压缩到原来的 5 /1000 后，所得的小
波系数用于样品的指纹图构建和分类识别，可以得到比一维
数据更全面、可靠的信息。
通过分析不同来源牛膝药材质量，表明怀牛膝、川牛膝和
土牛膝的有效成分含量有明显的不同，可以通过对齐墩果酸
或者蜕皮甾酮的检测区分怀牛膝与川牛膝药材，同时还明确
了土牛膝药材质量的现状，通过对野生与栽培牛膝药材质量
分析，发现野生土牛膝有效成分含量差异大，土牛膝提取物中
的物质含量比较复杂，有些批次的土牛膝供试品与怀牛膝相
似，说明土牛膝药材的质量较难控制，需要慎重用药。本文建
立的实验分析方法简便快速，但是，最佳数据处理模式的获取
和强大专家判别系统的建立还需要海量数据加以验证。
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