全 文 ： Journal of Pharmaceutical Analysis 药物分析杂志
·1293· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(7)
Chinese
柱前衍生化 HPLC法测定维 U颠茄铝胶囊中维生素 U的含量
马经明 1，赵吉平 2
（1.恩施土家族苗族自治州中心医院药剂科，恩施 445000；2.仙桃市食品药品检验检测中心，仙桃 433000）
摘要 　目的：对维 U颠茄铝胶囊中维生素 U含量测定的方法进行改进，根据维生素 U的特殊结构，建立
柱前衍生化 HPLC检测法测定其含量。方法：以二硝基氟苯（FDNB）为柱前衍生剂，在碳酸钠 -碳酸氢钠
缓冲液（pH 10.0）介质中进行衍生化反应；以 HPLC法测定含量，采用 Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以 0.01 mol·L-1乙酸钠溶液（用乙酸调 pH至 6.5）-乙腈（70∶30）为流动相，流速 1.0
mL·min-1，检测波长 360 nm。结果：2种结构维生素 U（氯甲基蛋氨酸和碘甲基蛋氨酸）的衍生产物色谱分
离效果均良好，氯甲基蛋氨酸和碘甲基蛋氨酸质量浓度分别在为 20.12~201.20和 29.23~292.31 μg·mL-1范围
内线性关系良好，氯甲基蛋氨酸和碘甲基蛋氨酸的加样回收率分别为 97.33%~98.74%和 97.71%~99.24%，
RSD（n=6）分别为 1.95%~2.52%和 1.85%~2.78%；以本文的柱前衍生化 HPLC法测得的不同厂家的 3批
样品中维生素 U含量分别为 99.06%、99.73%、100.52%，传统滴定法测得的含量分别为 101.07%、102.26%、
99.79%，两法结果基本一致。结论：方法学验证结果表明，本文建立的方法可以用于测定维 U颠茄铝胶囊
制剂中维生素 U的含量。
关键词：维 U颠茄铝胶囊；维生素 U；氯甲基蛋氨酸；碘甲基蛋氨酸；二硝基氟苯（FDNB）；衍生化；HPLC
中图分类号：R 917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2016）07-1293-06
doi：10.16155/j.0254-1793.2016.07.23
Determination of vitamin U in vitamin U，belladonna and aluminium
capsules by pre-column derivatization HPLC
MA Jing-ming1，ZHAO Ji-ping2
（1. Pharmacy Department of Enshi Tujia Miao National Minority Autonomous Prefecture Central ，Hospital，Enshi 445000，China；
2. Xiantao Center for Food and Drug Control and Test，Xiantao 433000，China）
Abstract Objective：To establish a new analysis method for determination of vitamin U by pre-column
derivatization HPLC according to vitamin U special structure，so as to improve the determination method of vitamin
U in vitamin U，belladonna and aluminium capsules．Methods：The derivatization reaction is carried out in
Na2CO3-NaHCO3 buffer（pH 10.0）medium，with dinitrofluorobenzene（FDNB）as pre-column derivatization，and then analyzed by HPLC．Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column was adopted，the mobile phase consisted of sodium acetate solution（adjusted to pH 6.5 with acetic acid）-acetonitrile（70∶30）at the flow rate of 1.0
mL·min-1，and the detection wavelength was 360 nm．Results：The derivation products of the two kinds of vitamin U
　　　　第一作者　Tel：13032786888；E-mail：3087139521@qq.com
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（chlorine methyl methionine and idodine methyl methionine）could be well separated by HPLC．The results showed
good relationships between the ranges of 20.12-210.20 μg·mL-1（chlorine methyl methionine）and 29.23-292.31
μg·mL-1（idodine methyl methionine）．The recoveries for chlorine methyl methionine were 97.33%-98.74%
and 97.71%-99.24% for idodine methyl methionine，and RSDs（n=6）were 1.95%-2.52% and 1.85%-2.78%．
The vitamin U contents determined by pre-column derivatization HPLC of three samples from different companies
were 99.06%，99.73% and 100.52%，while the contents by titration analysis method were 101.07%，102.26%
and 99.79%．The results determined by two methods were almost the same．Conclusion：The established method
is proved by methodology validation that it can be used for vitamin U determination in vitamin U，belladonna and
aluminium capsules．
Keywords：vitamin U，belladonna and aluminium capsules；vitamin U；chlorine methyl methionine；idodine
methyl methionine；dinitrofluorobenzene（FDNB）；derivation；HPLC
维生素 U为一种抗溃疡剂，用来治疗各种胃
溃疡、十二指肠溃疡，常见制剂有维 U颠茄铝胶
囊、维 U颠茄镁铝片等。其处方中包括维生素 U、
氢氧化铝、颠茄浸膏等，其中维生素 U包括 2种类
型：碘甲基蛋氨酸（C6H14INO2S）和氯甲基蛋氨酸
（C6H14ClNO2S）［1］。目前这些制剂的质量标准分别收
载于化学药品地方标准上升国家标准第六、第十一及
第十五册［2-4］。标准中关于维生素 U的含量测定均
采用化学滴定法；方法原理：先加过量硝酸银滴定液
与维生素 U中的 Cl-或 I-反应形成沉淀，再以硫酸铁
铵为指示剂，用硫氰酸铵滴定液反滴剩余的硝酸银，
以消耗的硝酸银量计算维生素 U含量。此法存在以
下弊端［5］：（1）反应终点不明显，难以判断；（2）采用
的硝基苯试液毒性大；（3）利用 Cl-或 I-与硝酸银反
应的性质难以验证维生素 U的真伪，容易被不法分子
所利用。
反应终点不明显的问题曾多次被检验工作者们
提出，并进行了很多改进，梁长香［6］将生成的氯化银
沉淀先过滤，再反滴剩余的硝酸银；惠白等［7］将反应
前溶液用垂熔玻璃漏斗过滤后再离心，充分去除不溶
性成分，消除其对终点颜色的干扰。以上改进方法均
取得了一定成效，但效果有限。
维生素 U结构中无紫外吸收基团，无法直接用
HPLC-UV进行检测，本文利用其分子中含有氨基酸
结构的特性，建立柱前衍生化 HPLC法测定其［8-9］，
旨在为相关药品标准的完善提供技术支持，保证制剂
中维生素 U的质量。
1　仪器与试药
1.1　仪器　Ulimate 3000高效液相色谱系统（四元
泵、真空在线脱气机，DAD检测器，Chameleon 7工作
站）；Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱
柱；AUW-220D型电子分析天平（上海梅特勒 -托
利多仪器有限公司）；pH-S型 pH计（上海梅特勒 -
托利多仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市光
明医疗仪器有限公司）。
1.2　试药　氯甲基蛋氨酸和碘甲基蛋氨酸对照品，
含量 99.5%，江莱生物科技有限公司；二硝基氟苯
（FDNB），艾科试剂；乙腈为色谱纯；水为超纯水；碳
酸钠、碳酸氢钠均为分析纯，汕头市西陇化工厂；碳酸
钠 -碳酸氢钠缓冲液（pH 10.0）（取碳酸钠 0.635 g，
碳酸氢钠 0.335 g，加水至 100 mL）；维 U颠茄铝胶囊
（山西康立生药业，批号 03141201；山西云鹏制药，批
号 C140514；修正药业集团，批号 140513）。
2　方法与结果
2.1　供试品溶液的制备　避光操作，精密称取维 U颠
茄铝胶囊内容物适量（约相当于氯甲基蛋氨酸 20 mg
或碘甲基蛋氨酸 29 mg），置 100 mL棕色量瓶中，加水
适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
2.2　对照品溶液储备液的制备 避光操作，精密称取
氯甲基蛋氨酸对照品约 20 mg或碘甲基蛋氨酸对照
品 30 mg，置 100 mL棕色量瓶中，加水适量使溶解并
稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度约为 200 μg·mL-1
（氯甲基蛋氨酸）或 300 μg·mL-1（碘甲基蛋氨酸）
的储备液，系列对照品溶液由储备液以水稀释得到。
2.3　衍生化反应　精密量取供试品溶液、对照品溶
液、超纯水各 1 mL，分别置 10 mL棕色量瓶中，依次
加入碳酸钠 -碳酸氢钠缓冲液（pH 10.0）1.0 mL，
0.01 mol·L-1FDNB的乙腈溶液 180 μL（使衍生剂与
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维生素 U的摩尔比为 1.5∶1），振摇使混合均匀，置 60
℃水浴中加热 1 h，取出，放冷至室温，加水定容至 10
mL，摇匀，分别用 0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得
得到衍生化的供试品溶液、衍生化的对照品溶液以及
衍生化的空白溶液。
2.4　色谱条件　参考文献［5］并调整流动相的水
相无机盐浓度、pH及流动性比例，得到优化的色谱
条件：流动相为 0.01 mol·L-1乙酸钠溶液（用乙酸调
pH至 6.5）-乙腈（70∶30），流速 1.0 mL·min-1，检测
波长 360 nm，柱温 30 ℃，进样体积 10 μL。
在上述色谱条件下，空白溶液、氯甲基蛋氨酸和
碘甲基蛋氨酸对照品溶液和供试品溶液衍生后的色
谱图见图 1。由图 1可见，保留时间为 3.55 min左
右的峰为衍生剂 FDNB在碱性条件下形成的复合物
DNP-OH；保留时间 4.04 min左右的峰为氯甲基蛋氨
酸经 FDNB衍生化后的产物，为目标峰；保留时间为
6.35 min左右的峰为未反应完的 FDNB。衍生后的产
物经色谱分离良好，过量的衍生剂可经色谱分离，无
需去除。碘甲基蛋氨酸衍生后的色谱行为与氯甲基
蛋氨酸一致，同等浓度峰面积略有差异，见图 1。
A.衍生化的空白溶液（blank solution after derivatization） 　B.衍生化的氯甲基蛋氨酸对照品溶液（reference substance solution of chlorine methyl
methionine after derivatization） C.衍生化的供试品溶液（sample solution after derivatization） 　D.衍生化的碘甲基蛋氨酸对照品溶液（reference
substance solution of idodine methyl methionine after derivatization）
1. DNP-OH　2.氯化甲基蛋氨酸的衍生物（chlorine methyl methionine after derivatization）　3.碘化甲基蛋氨酸的衍生物（idodine methyl methionine
after derivatization）
图 1　衍生产物的色谱图
Fig. 1　Chromatograms of derivatives
2.5　线性关系考察　精密量取 2个对照品储备液 2、
4、5、6、8 mL，分别置 10 mL棕色量瓶中，加水稀释至
刻度，摇匀，得到质量浓度分别为 40、80、100、120 和
160 μg·mL-1的氯甲基蛋氨酸对照品溶液和质量浓
度为分别为 60、120、150、180、240 μg·mL-1的碘甲
基蛋氨酸对照品溶液。精密量取以上对照品溶液各
1 mL，按“2.3”项下的方法衍生化，以“2.4”项下的色
谱条件进样测定，同时做空白试验。根据对照品溶液
的质量浓度（μg·mL-1）与峰面积（mAU）进行回归
分析，得到氯甲基蛋氨酸和碘甲基蛋氨酸的线性范围
及线性方程，同时测定检测限（LOD，S/N=3）和定量
限（LOQ，S/N=10），结果见表 1。
2.6　精密度试验　取同一浓度对照品溶液（100
μg·mL-1），按“2.3”项下的方法衍生化后，以“2.4”
项下的色谱条件连续进样 6次，得到氯甲基蛋氨
酸衍生物和碘甲基蛋氨酸衍生物峰面积的 RSD
（n=6）分别为 0.89%和 0.93%，表明该法的精密度
良好。
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表 1　2种维生素 U的回归数据、检测限和定量限
Tab. 1　Regression data，limit of quantification（LOQ）and limit of detection（LOD）of two types of vitamin U
对照品
（reference substance）
回归方程
（regression equation） r
线性范围（linearity）
/（μg·mL-1）
定量限
（LOQ）/μg
检测限
（LOD）/μg
氯甲基蛋氨酸（chlorine methyl
methionine）
Y=7.3956X-1.331 5 0.999 0 20.12~201.20 0.264 0.089
碘甲基蛋氨酸（idodine methyl
methionine）
Y=5.6048X+0.257 2 0.999 3 29.23~292.31 0.288 0.106
2.7　重复性试验　取同厂同批次维 U颠茄铝胶囊样
品 6份，依法进行维生素 U含量测定，得到氯甲基蛋
氨酸的含量为 97.82%、99.97%、99.62%、101.78%、
98.45%和 97.17%，RSD（n=6）为 1.69%。
2.8　稳定性试验　取“2.7”项下维 U颠茄铝胶囊衍
生化后的供试品溶液，室温放置，分别于 0、4、8、12、
16、20、24 h按“2.4”项下条件进样测定，维生素 U
含量的 RSD为 2.2%，表明衍生化产物在室温条件下
24 h内基本稳定。
2.9　加样回收率试验　对市售的 3个厂家生产的
维 U颠茄铝胶囊进行加样回收试验。按“2.1”项下的
方法，制成氯甲基蛋氨酸质量浓度约为 50 μg·mL-1
和碘甲基蛋氨酸质量浓度约为 75 μg·mL-1的供试
品溶液，加样水平分别为氯甲基蛋氨酸 30、50和 70
μg·mL-1，碘甲基蛋氨酸 45、75和 105 μg·mL-1，
每个加样水平平行测定 6次，加样回收率（n=6）分
别为 97.33%~98.74%和 97.71%~99.24%，RSD分别为
1.95%~2.52%和 1.85%~2.78%，说明方法准确度良好。
表 2　加样回收结果（n=6）
Tab. 2　Spiked recovery results
厂家（company） 批号（lot No.） 成分（component）
质量浓度
（mass
concentration/
（μg·mL-1）
添加浓度
（added）/
（μg·mL-1）
测定值
（measured
result）
/（μg·mL-1）
回收率
（recovery）
/%
RSD/%
山西康立生药业有限公司（ShanXi
KangLiShen Pharmaceutical Co.，
Ltd.）
03141201 氯甲基蛋氨酸（chlorine
methyl methionine）
50.67 30.00
50.00
70.00
79.18
97.99
119.15
98.15
97.33
98.74
2.52
1.95
2.32
山西云鹏制药有限公司（ShanXi
YunPeng Pharmaceutical Co.，
Ltd.）
C140514 碘甲基蛋氨酸（idodine
methyl methionine）
76.12 45.00
75.00
105.00
119.97
149.56
176.99
99.05
98.96
97.71
2.13
2.03
2.73
修正药业集团股份有限公司
（XiuZheng Pharmaceutical Co.，
Ltd.）
140513 碘甲基蛋氨酸（idodine
methyl methionine）
75.75 45.00
75.00
105.00
119.84
148.55
176.68
99.24
98.54
97.74
1.85
2.24
2.78
2.10　样品测定　取不同厂家生产的维 U颠茄铝胶
囊，按“2.1”项下的方法制成氯甲基蛋氨酸质量浓度
约为 100 μg·mL-1和碘甲基蛋氨酸质量浓度约为
150 μg·mL-1的供试品溶液，依法进行含量测定；同
时按传统滴定法［3］对各批次样品进行检测，结果以
相对于标示量的百分数计。结果见表 2。由表 2可
以看出，柱前衍生化 HPLC法测得的维生素 U含量
与传统滴定法测得的含量基本一致，但传统滴定法滴
定终点颜色突变不明显，难以判断，主观因素大，对操
作者经验的要求较高，初测者难以把握；柱前衍生化
HPLC法准确度高，方法简便、重复性好，主观因素影
响较小，且避免了有毒易挥发试剂硝基苯的使用。
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表 3　不同厂家生产的维 U颠茄铝胶囊中维生素 U含量（%）
Tab. 3　Content of vitamin U in vitamin U，belladonna and aluminum capsules produced by different companies
厂家（company） 批号（lot No.） 成分（component）
柱前衍生化 HPLC法
（HPLC with pre-column
derivation）
化学滴定法
（titration method）
含量
（content） RSD
含量
（content） RSD
山西康立生药业有限公司（ShanXi
KangLiSheng Pharmaceutical Co.，
Ltd）
03141201 氯 甲 基 蛋 氨 酸
（chlorine methyl
methionine）
99.06 1.5 101.07 1.9
山西云鹏制药有限公司（ShanXi
YunPeng Pharmaceutical Co.，
Ltd）
C140514 碘 甲 基 蛋 氨 酸
（idodine methyl
methionine）
99.73 1.4 102.26 2.0
修正药业集团股份有限公司
（XiuZheng Pharmaceutical Co.，
Ltd）
140513 碘 甲 基 蛋 氨 酸
（idodine methyl
methionine）
100.52 1.7 99.79 2.2
3　讨论
3.1　方法优势　目前维 U颠茄铝胶囊等含维生素 U
的制剂采用的质量标准中对维生素 U的含量测定均
采用硝酸银与 Cl-或 I-沉淀法，且鉴别项中仅涉及颠
茄提取物、氯化物或碘化物的鉴别，缺乏对蛋氨酸结
构的判定，容易被不法分子利用，制造假药。本实验
根据维生素 U分子中含氨基酸结构的特性，对氯甲
基蛋氨酸或碘甲基蛋氨酸进行柱前衍生化处理，使之
产生紫外吸收基团，再用 HPLC进行色谱分离及含量
测定，不仅避免了化学滴定法终点难以判断的缺点，
且能准确测定维生素 U的含量，同时也能对蛋氨酸
的结构进行验证，确保维生素 U的质量。
3.2　衍生化试剂选择　常见的氨基酸衍生试剂包括
异硫氰酸苯酯（PITC）、茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）
及 9-芴甲氧羰酰氯（FMOC）等［10-12］，其中茚三酮衍
生灵敏度低，对仪器要求高，PITC和 OPA衍生后多
余的衍生试剂对后续测定有干扰，需去除［13-14］。本
文选用 FDNB为衍生剂，价格低廉易得，过量的衍生
剂可经色谱分离，无需去除。
3.3　衍生条件的选择　本实验选取碱性较强的碳酸
钠 -碳酸氢钠缓冲液（pH 10.0）作为反应介质。文
献报道中，氨基酸的衍生多采用弱碱性的缓冲液（三
乙胺的乙腈溶液等）作为反应介质，介质 pH为 9左
右［15-17］。本实验考察了碱性环境对反应的影响。结
果表明在 pH为 7~9时，衍生剂与维生素 U的反应
率很低，转化不彻底；随着 pH的升高，转化率显著提
升，在 pH为 10.0时几乎全部转化。原因可能在于以
下两方面：一是较高的 pH环境有利于衍生剂 FDNB
的溶解，使衍生反应易于进行。将图 1-A（衍生化的
空白溶液）和 B（衍生化的对照品溶液）进行比较可
以看出，衍生剂在碱性环境中形成复合物，再与维生
素 U进行衍生化反应。衍生剂 FDNB本身很难溶于
水，在碱性环境中与 OH-形成复合物，增加了其溶解
度，提高了其与氯甲基蛋氨酸反应的转化率。二是
维生素 U本身呈弱酸性，在碱性环境中易解离，因此
pH较高时有利于反应的进行。
3.3　小结　本文得到的衍生产物性质稳定，色谱图
中样品的各成分均达到基线分离，且色谱行为良好，
方法准确，精密度高、重复性好，为维 U颠茄制剂中
维生素 U的含量检测提供了新方法。
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（本文于 2015年 9月 16日收到）