全 文 ：• 1397 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2010年 9 月第25 卷第 9 期 CJTCMP , September 2010, Vol . 25, No. 9
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(收稿日期：2010年3月21日)
·论著·
大蝎子草乙酸乙酯部位对脂多糖诱导巨噬细胞
炎症介质表达的影响
沈祥春1,2，支娜1，许立1，方泰惠2
(1贵阳医学院药理研究室，贵阳 550004；2南京中医药大学江苏省中药药效学与安全性评价重点实验室，
南京 210029)
摘要：目的：研究大蝎子草乙酸乙酯部位对脂多糖（LPS）诱导大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶
（iNOS）表达、炎性因子一氧化氮（NO）与肿瘤坏死因子α（TNF-α）分泌的影响。方法：建立体外培养大鼠腹
腔巨噬细胞，以LPS为致炎刺激剂，免疫细胞化学法研究大蝎子草乙酸乙酯部位对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞iNOS
表达的影响，Griess法分析培养液NO含量，间接MTT法检测培养液TNF-α含量。结果：LPS刺激大鼠腹腔巨噬细胞
后，其iNOS表达显著增加，培养液中NO和TNF-α含量显著增加，大蝎子草乙酸乙酯部位对上述炎症介质的增加具
有显著的抑制作用。结论：大蝎子草乙酸乙酯部位能抑制LPS诱导NO和TNF-α的产生，减少iNOS的表达，为其进
一步研究开发奠定了实验基础。
关键词：大蝎子草；巨噬细胞；脂多糖；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；肿瘤坏死因子-α
基金资助：贵州省优秀科技教育人才省长专项资金[No.(2006)55]，贵州省科学技术基金[No.(2008)2162]，贵阳
市大学创业基金（No.2008-14）
Inhibited effects of Herba Girardinia ethyl acetate extract on expression of infl ammation
factors in rat peritoneal macrophages induced by LPS
SHEN Xiang-chun1,2, ZHI Na1, XV Li1, FANG Tai-hui2
(1Research Department of Pharmacology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China; 2Jiangsu Key Laboratory for
Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Material Medica, Nanjing University of Chinese Medicine,
Nanjing 210029, China)
通讯作者：沈祥春，贵州省贵阳市北京路9号贵阳医学院科技处，邮编：550004，电话：0851-6908108，传真：0851-6909828
E-mail：shenxiangchun@126.com
• 1398 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2010年 9 月第25 卷第 9 期 CJTCMP, September 2010, Vol . 25, No.9
活麻药用历史悠久，在《楚彝本草》、《滇药
录》、《藏本草》等均有记载，主要用于治疗中风不
语、咳嗽多痰、风湿疼痛、跌打损伤、骨折等。根据
文献资料我国大部分地区所用活麻为荨麻科荨麻
属的植物。活麻作为治疗药物以红禾麻药名被2003
版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收录，该标
准收载的活麻原植物为荨麻科珠牙艾麻Lapor tea
bulfi fera (Sieb. et Zucc.) Wedd.的新鲜或干燥全草[1]。
笔者经过广泛的调查，贵州不少民族地区以荨麻
科蝎子草属植物大蝎子草 Girardinia diversiforlia
(Link) Friis 的全草或根作为活麻药材广泛应用，具
有祛风解表、利气消痰、清热解毒之功效，民间应用
于治疗伤风咳嗽、胸闷痰多、水肿、皮肤瘙痒等症
状。本实验室的前期研究结果证实，大蝎子草乙酸乙
酯部位是其抗炎主要效应成分之一[2]。
巨噬细胞是重要的免疫调节和效应细胞，通过吞
噬杀伤微生物、抗原提呈和分泌多种细胞因子等作用
控制机体的炎症反应和免疫应答[3]。LPS诱导巨噬细
胞已经成为研究炎症应答的重要细胞模型。因此，本
研究以大蝎子草抗炎主要活性部位——乙酸乙酯部
位为研究对象，建立LPS诱导巨噬细胞功能异变的炎
症细胞模型，分析其抗炎作用可能机制。
材料与方法
1. 材料
1.1 药品与试剂 大蝎子草采自贵州省贵阳市花
溪区，由贵阳医学院药用植物学与生药学教研室龙
庆德老师采集并鉴定为Girardinia diversifolia (Link)
Friis，存证标本保留与该教研室。本研究分离提取
采用大蝎子草地上部分，13kg大蝎子草用95%的酒
精回流提取3次，时间分别为4、3、3h，提取液合并浓
缩至无醇味，得总提取物。依次用石油醚、氯仿、乙
酸乙酯萃取，回收浓缩后得到乙酸乙酯部位26g，得
率为0.2%。RPMI1640培养粉：Gibco公司；LPS：美国
Sigma公司产品，批号：110K4060；MTT：美国Sigma公
司产品；iNOS免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程
有限公司产品。
1.2 动物与细胞株 SD大鼠，雌雄兼用，体质量
（200±20g）；贵阳医学院实验动物中心提供，动物
合格证号：SCXK(黔) 2002-0001。L929细胞株，由生
理教研室武春兰惠赠，本室传代培养。
1.3 主要仪器 BS223S型分析天平：赛多利斯仪
器系统有限公司；SW-CJ-1F型双面净化工作台：苏州
净化设备有限公司；XDS-1B倒置显微镜：重庆光电
仪器有限公司；ELX800型酶联免疫检测仪：美国GE
公司；HF90二氧化碳培养箱：上海力康生物医疗科
技控股有限公司。
2. 方法
2.1 大鼠腹腔巨噬细胞分离、培养[4] 大鼠脱颈
椎处死，酒精浸泡消毒，剪开腹部皮肤，向腹腔内
注入约15mL预冷磷酸盐缓冲液（PBS），轻揉腹部
3-5min后用吸管收集腹腔液，4℃离心（1 000r/min×
5min），PBS液洗涤细胞3次，弃去上清，加入含10%
灭活胎牛血清的RPMI1640培养液，调整细胞浓度至
2×106个/mL接种至细胞培养板，经Wright,s染色证明
90%以上为巨噬细胞，台盼蓝染色证明细胞存活率达
95%以上。
2.2 细胞培养液NO的含量测定[5] 将96孔培养
板细胞随机分为对照组、LPS组和大蝎子草乙酸乙酯
Abstract: Objective: To investigate the inhibited effects of Herba Girardinia ethyl acetate extract on inducible
nitric oxide synthase (iNOS) expression, and nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) excretion in rat
peritoneal macrophages induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods: The model was reproduced by LPS stimulating
macrophages in culture in vitro. Induced NOS expression of macrophages was assayed by immuocytochemistry method,
NO contents in medium were detected by Griess method, and the TNF-α contents in medium were measured by indirect
MTT method. Resutls: Induced NOS expression of macrophages, NO and TNF-α contents in medium of macrophages
were signifi cantly increased after the stimulation by LPS. Herba Girardinia Ethyl acetate extract can remarkable ameliorate
the infl ammation factors increase. Conclusion: Herba Girardinia ethyl acetate extract inhibited TNF-α and NO excretions,
and iNOS expression of macrophage, and then the present results provided the experimental base further development and
research.
Key words: Herba Girardinia; Macrophage; lipopolysaccharide (LPS); Inducible nitric oxide synthase (iNOS); Nitric
oxide (NO); Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)
Fund assistiance: Excellent Scientific and Technological & Educational Talents of Governor’ Special Funds in
Guizhou Province(No.2006-55), Science and Technology Foundation of Guizhou Province (No.2008-2162), Undergraduate
Students, Innovative Undertaking Found of Guiyang City (No.2008-14)
• 1399 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2010年 9 月第25 卷第 9 期 CJTCMP , September 2010, Vol . 25, No. 9
提取部位不同浓度组（终浓度分别为：0.621×10-2、
0.031、0.155、0.755、3.875μg/mL）。培养30min后，以
培养体系中加入终浓度为10μg/mL LPS作为刺激剂，
置37℃ 5% CO2培养24h，轻轻吸取上清，-20℃保存，
待测。50μL培养液上清与100μL Griess混合试剂
[1%对氨基苯磺酸溶液+0.1%N-（1-萘基）乙二胺二
盐酸盐溶液等体积]充分混合、振摇10min，540nm酶
标仪上测量吸光度。根据标准曲线计算NO释放量。
2.3 免疫细胞化学法分析巨噬细胞中的iNOS表
达 巨噬细胞接种于预置盖玻片的细胞培养板中，分
组、给药及刺激同2.2。实验结束后按iNOS免疫组化
试剂盒说明书的要求处理细胞。倒置显微镜下观察，
各组细胞iNOS的表达用细胞质棕黄色颗粒的平均吸
光度（A）值表示。于400倍视野下，每组随机选取50
个细胞，采用HPIAS－2000高清晰度图像处理系统，
对各组细胞片进行图像分析，测定其平均吸光度。
2.4 间接MTT比色法检测TNF-α活性[6] 大鼠腹
腔巨噬细胞分离培养、分组及细胞处理同“2.1”。收
集细胞培养上清液，备用。收集处于对数生长期的
L929细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，每孔100μL
加入96孔板中，同时每孔加入待测样品（巨噬细胞培
养上清）100μL。37℃、5%CO2培养箱培养24h后，每孔
加入5mg/mL的MTT 20μL，继续培养4h，弃去上清，加
入150μL DMSO溶解结晶物，15min后在酶标仪570nm
测光吸收值。根据以下公式计算TNF-α含量：
TNF-α含量（%）=1-（实验孔A值/对照孔A值）×100。
2.5 统计学方法 数据用SPSS16.0统计软件包
进行统计分析，实验数据以x-±s表示，采用单因素方
差分析进行组间显著性比较，两组间样本均数比较
采用t检验。
结果
1. 对巨噬细胞培养上清液中NO水平的影响 LPS
10μg/mL作用于巨噬细胞后24h，细胞培养液中NO
含量显著增加，与对照组比较，差异显著。大蝎子
草乙酸乙酯部位0.62×10-2-3.875μg/mL可以显著
抑制LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞NO的合成与分泌
（P<0.05）。见表1。
2 . 大蝎子草乙酸乙酯部位对巨噬细胞中的
iNOS的影响 免疫细胞化学结果提示巨噬细胞经
10μg/mL LPS刺激后，LPS组细胞的着色明显加深，
平均吸光度值显著升高，与对照组比较，差异极显
著（P<0.01），提示LPS诱导巨噬细胞iNOS表达显著
增加。大蝎子草乙酸乙酯部位在0.775-3.875μg/mL
的浓度范围时，与LPS组比较平均吸光度值极显著
组别
对照组
LPS
大蝎子草乙酸乙酯部位
剂量(μg/mL)
-
-
0.621×10-2
0.031
0.155
0.775
3.875
吸光度(AU)
0.099±0.016*
0.131±0.016#
0.114±0.014*
0.096±0.031*
0.103±0.023*
0.112±0.019*
0.099±0.016*
NO (μg/mL)
10.304±1.687**
13.590±1.703##
11.838±1.446*
9.995±3.227*
10.716±2.413*
11.606±2.359*
10.313±3.497*
表1 大蝎子草乙酸乙酯部位对大鼠腹腔巨噬细胞分泌NO的
影响(x-±s,n=6)
注：与LPS组比较，*P<0.05, **P < 0.01，与对照组比较，#P<0.05,
##P< 0.01。
组别
对照组
LPS
大蝎子草乙酸乙酯部位
剂量(μg/mL)
-
-
0.621×10-2
0.031
0.155
0.775
3.875
平均吸光度(AU)
0.344±0.039**
0.505±0.021##
0.496±0.016
0.497±0.022
0.434±0.035
0.401±0.023**
0.397±0.039**
表2 大蝎子草乙酸乙酯部位对LPS诱导的巨噬细胞中iNOS
的影响(x-±s，n=4)
注：与LPS组比较，**P < 0.01；与对照组比较，##P < 0.01。
A B C D
E F G
A-对照，B-脂多糖，C-G 大蝎子草乙酸乙酯部位 0.621×10-2、
0.031、0.155、0.755、3.875μg/mL
图1 大蝎子草乙酸乙酯部位对LPS诱导的巨噬细胞中iNOS
表达的影响
下降（P<0.01），提示大蝎子草乙酸乙酯部位可显著
抑制LPS诱导的巨噬细胞的iNOS的蛋白表达。见表
2和图1。
3. 大蝎子草乙酸乙酯部位对大鼠腹腔巨噬细
胞分泌TNF-α的影响 结果提示LPS10μg/mL诱导
大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α，大蝎子草乙酸乙酯
部位对LPS诱导的巨噬细胞TNF-α的分泌具有一
定的抑制作用，且浓度范围在0.155-3.875μg/mL能
显著抑制LPS刺激大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的产生
（P<0.05）。见表3。
• 1400 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2010年 9 月第25 卷第 9 期 CJTCMP, September 2010, Vol . 25, No.9
讨论
LPS诱导的巨噬细胞活化在严重感染时机体内
环境紊乱中起到关键作用[7]。NO是激活的巨噬细胞
杀灭病原微生物及肿瘤细胞的主要效应分子，也是
重要的炎症介质，过量产生的NO在炎症反应的发生
与发展中起着多种作用。当NO高速率产生时，NO能
与O2-结合形成过氧亚硝基阴离子可能是导致细胞损
伤、能量耗竭和细胞死亡的重要因素，也是NO产生
病理损伤作用的重要环节[8]。NO是在一氧化氮合成
酶（nitric oxidesynthase，NOS）催化下，由左旋精氨酸
（L-Argine，L-Arg）末端胍基上的一个氮原子氧化
生成[9]。活化的巨噬细胞在受到内毒素、炎症介质等
刺激下会分泌诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）诱导合
成大量的NO与多种炎症疾病发生有关等。因此，抑
制 iNOS 的表达成为目前治疗多种炎症疾病的药物
效应靶位之一。iNOS在健康的静止细胞内通常不表
达，但是一旦被细菌内毒素（LPS）或多种细胞类型
的炎症前细胞因子刺激，即可被快速诱导转录。
TNF-α作为一种炎性因子，主要是由活化的单核
巨噬细胞和内皮细胞释放的细胞因子，具有多种生
理活性，高浓度的肿瘤坏死因子可作为内源性致热
源引起发热，作用于单核细胞和血管内皮细胞，引起
机体严重的毒性反应，使机体发生病变，加剧炎症反
应，甚至多器官功能衰竭[10]。以LPS刺激巨噬细胞样
细胞分泌TNF-α的体外模型已广泛应用于抗炎药物
作用及作用机制研究。
本研究从细胞水平初步证实大蝎子草乙酸乙酯
部位能抑制LPS诱导的巨噬细胞iNOS表达，减少NO和
TNF-α的分泌，缓解炎症反应，为其进一步的深入研究
奠定了实验基础。但是，本实验只是在细胞水平验证
大蝎子草乙酸乙酯部位对LPS诱导的炎症介质表达并
进行初步探讨，其作用机制有待于进一步深入研究。
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(收稿日期：2010年3月22日)
组别
LPS
大蝎子草乙酸乙酯部位
剂量/(μg/mL)
-
0.621×10-2
0.031
0.155
0.775
3.875
TNF-α(/%)
28.973±4.406
25.975±4.393
19.030±2.552
9.848±5.169*
10.752±4.773*
13.987±3.214*
表3 大蝎子草乙酸乙酯部位对大鼠腹腔激活巨噬细胞分泌
TNF-α的影响(x-±s，n=4)
注：与LPS比较，*P<0.05。