全 文 ：inducedbyDMH(1, 2-dimethylhydrazine).Methods:DMH(1, 2-dimethylhydrazine)wasinjectedsubcutaneouslytoinduceAberrantCrypt
Foci(ACF)inratcolon.Thefrequenciesofmitoticandapoptoticcellswithinintactmicrodissectedcryptswasexaminedafterstainedwith
Fulgenreagent.Results:Celproliferationwasinhibitedbyhuanglian;cellproliferationwasinhibitedandapoptosiswaspromotedby
wuzhuyuandhuanglian-wuzhuyupairherb, andherbpaireffectwasbetterthansingleherb.Conclusion:Huanglian, wuzhuyuandhuangli-
an-wuzhuyupairherbmaybepotentialchemopreventionagentsagainstcolorectalcancerandthisefectmaybeassociated, atleastinpart,
withinhibitionofcelmitosisandpromotionofcellapoptosis;pairherbscomposedbyhuanglian-wuzhuyumayhavebetereffectthansingle
herb.
Keywords　 huanglian(黄连);wuzhuyu(吴茱萸);huanglian-wuzhuyupairherb(黄连-吴茱萸);aberrantCryptFoci(ACF);DMH(1,
2-dimethylhydrazine)
大蝎子草水层部位对 LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞 iNOS与 TNF-α的影响＊
支　娜 ,陶　玲 1 ,沈祥春＊＊
(贵阳医学院药理研究室 ,贵阳 　550004;1贵阳医学院药剂学与生物药剂学教研室 ,贵阳　 550004)
　　摘　要　目的:研究大蝎子草水层部位对脂多糖(LPS)诱导大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达 、一氧化氮
(NO)与肿瘤坏死因子 α(TNF-α)分泌的影响。方法:建立体外培养大鼠腹腔巨噬细胞 , 以 LPS为炎症刺激剂 , 免疫细胞化学研究
大蝎子草水层部位不同剂量对 LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞 iNOS表达 , Griess法分析培养液 NO含量 ,间接 MTT法分析培养液 TNF-
α含量。结果:LPS刺激大鼠腹腔巨噬细胞后 , 其 iNOS表达显著增加 , 培养液中 NO和 TNF-α含量显著增加 , 大蝎子草水层部位对
上述改变具有显著的抑制作用。结论:大蝎子草水层部位对细胞水平的炎症反应具有一定的抑制作用。
　　关键词　大蝎子草;巨噬细胞;脂多糖;诱导型一氧化氮合酶;肿瘤坏死因子-α
　　大蝎子草为荨麻科植物大蝎子草 Girardiniadiversifolia
(Link)Frlirs的全草或根 ,民间用药经验提示大蝎子草具有很
好的抗炎功效 , 然而目前国内外对其抗炎作用及机制的研究鲜
有报道 [ 1] 。因此本课题采用传统的系统分离的方法 , 研究大蝎
子草水层部位对大鼠腹腔巨噬细胞分泌 NO、iNOS及 TNF-a的
影响。
1　材料与方法
1.1 　试验药物 　大蝎子草采自贵州省贵阳市花溪乡 , 由贵阳
医学院药用植物学与生药学教研室龙庆德老师采集并鉴定 ,本
研究分离提取采用大蝎子草地上部分。大蝎子草 13 kg用 95%
的酒精回流提取 3次 , 时间分别为 4、3、3小时 , 提取液合并浓缩
至无醇味 , 得总提取物。依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯萃取后
得到剩余水层部位 , 回收浓缩后得到水层部分 452 g, 得率为 0.
35%。
1.2 　动物与细胞株　 SD大鼠 , 雌雄兼用 , 体重(200 ± 20)g,
贵阳医学院实验动物中心提供 , 动物合格证号:SCXK(黔)
2002-0001。 L929细胞株 ,由生理学教研室武春兰惠赠 , 本室传
代培养。
1.3　试剂　MTT、ConA、LPS, 美国 Sigma公司产品。
1.4　仪器　SW-CJ-1F型双面净化工作台:苏州净化设备有限
公司;XDS-1B倒置显微镜:重庆光电仪器有限公司;ELX800型
酶联免疫检测仪:美国 GE公司;HF90二氧化碳培养箱:上海力
申科学仪器有限公司。
1.5 　方法
1.5.1　对大鼠腹腔巨噬细胞产生 NO的影响　大鼠颈部脱臼
处死 ,消毒腹部 , 剪开腹部皮肤 , 向腹腔内注入约 30 ml预冷磷
酸盐缓冲液(PBS), 轻揉腹部 3 ～ 5 min后用吸管收集腹腔液 , 4
℃离心(1000rpm×5min), PBS液洗涤细胞 3次 ,弃去上清 , 加
入含 10%灭活胎牛血清的 RPMI1640培养液 , 调整细胞浓度至
2×106 /ml备用 ,经 Wrights染色证明 90%以上为巨噬细胞 , 台
盼蓝染色显示细胞存活率 95%[ 2] 。将细胞悬液按每孔 100 μl
接种到 96孔培养板 ,置于 37℃ 5%CO2的孵箱中贴壁 2h。细胞
贴壁后弃去上清 ,用无血清 RPMI1640培养液冲洗 3次 , 洗去未
贴壁细胞 ,随机分为对照组 、LPS组和给药组。每孔分别加入预
配置的不同浓度的药物(药物终浓度见表 1,下同),培养 30min
后 ,以 10 μg/ml的 LPS作为最佳刺激浓度 ,置 37℃ 5% CO2培
养 24 h, 轻轻吸取上清 , -20℃保存 , 待测。 50μl培养液上清与
100μlGriess混合试剂(1%的对氨基苯磺酸溶液 +0.1%的 N-
(1-萘基)乙二胺二盐酸盐溶液等体积)充分混合 、振摇 10 min,
540nm酶标仪上测量吸光度 ,根据标准曲线计算 NO释放量。
1.5.2　间接 MTT比色法检测 TNF-α活性 [ 3]　分离培养大鼠
腹腔巨噬细胞 ,调整细胞浓度为 2.5×106 /ml, 于 96孔培养板各
加 100μl细胞悬液 , 37℃、 5%CO2培养箱孵育 3 h, 使巨噬细胞
贴壁后倾去上清液 ,除去非黏附细胞 , 再用 PBS洗 3次 , 用 10%
39中药药理与临床 2010;26(3)
＊ 基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长专项资金 [ NO.(2006)55号 ] ;贵州省科学技术基金 [ NO.(2008)2162] 　　　　＊＊通讯作者
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2010.03.016
RPMI1640完全培养基培养。在上述每孔加入终浓度 10 μg/ml
LPS以激活巨噬细胞 ,同时每孔加入不同终浓度的大蝎子草水
层部位 , 并设置 PBS对照孔和 5个重复样品孔继续培养 12h。
收集处于对数生长期的 L929细胞 , 调整细胞浓度为 2 ×105 /
ml, 每孔 100 μl加入 96孔板中 , 同时每孔加入待测样品(细胞
培养上清)100 μl。 37℃、5% CO
2
培养箱培养 24h后 , 每孔加入
5 mg/ml的 MTT20 μl,继续培养 4h, 弃去上清 ,加入 150μlDM-
SO溶解结晶物 , 15min后在酶标仪 570nm测光吸收值。根据以
下公式计算 TNF-α含量:
　　TNF-α含量(%)=[ 1-(实验孔 A值 /对照孔 A值)] ×100
1.5.3　免疫细胞化学法检测巨噬细胞中的 iNOS表达　于 6
孔培养板中 , 每孔放入一张清洁灭菌的盖玻片。取分离培养的
大鼠腹腔巨噬细胞 , 调整细胞浓度为 2.5×106 /ml, 加入每孔 2
ml。待巨噬细胞完全贴壁后 , 改用无血清培养液培养 24h后 ,分
为对照组 、LPS组 、水层部分 WSF, 除对照组外 ,其余各组分别予
以 10μg/ml的 LPS,于 37℃、5%CO
2
培养箱继续培养 12h,每组
均设 5个复孔。试验结束后按 iNOS免疫组化试剂盒分析 iNOS
表达。以 PBS代替一抗进行反应作阴性对照。阳性对照用已
知阳性片。把封好的片子放在倒置显微镜下观察 , 各组细胞
iNOS的含量用细胞质棕黄色颗粒的平均吸光度(A)值表示。
于 400倍视野下 , 每组随机选取 50个细胞 , 采用 HPIAS-2000
高清晰度图像处理系统 , 对各组细胞片进行图像分析 , 测定其
平均吸光度。
2　结果
2.1　巨噬细胞上清液中 NO水平的的测定　采用 Griess(硝酸
还原酶法)法检测大蝎子草水层提取物对 LPS诱导的大鼠腹腔
巨噬细胞产生 N0影响。实验结果显示 , 10μg/mlLPS作用于巨
噬细胞后 , 培养液中 NO的水平显著高于对照组(P<0.01);与
LPS组相比较 ,水层部分 13.5和 67.5μg/ml剂量组可以显著抑
制 NO的产生(P<0.01),实验结果见表 1。
　　表 1　大蝎子草水层部位对大鼠腹腔激活巨噬细胞分泌 NO的影响
( x±s, n=6)
组别 剂量(μg/ml) A570(AU) NO(μg/ml)
对照 0.099±0.016＊ 10.304±1.687＊＊
LPS 0.131±0.016 13.590±1.703
大蝎子草 0.11 0.114±0.032 11.786±3.308
大蝎子草 0.54 0.123±0.026 12.740±2.657
大蝎子草 2.70 0.125±0.029 12.946±2.949
大蝎子草 13.50 0.105±0.023＊ 10.936±2.359＊
大蝎子草 67.50 0.112±0.018＊ 11.644±11.878＊
　　与 LPS组比较 ＊ P<0.05, ＊＊ P<0.01(下同)
2.2　大蝎子草水层部位对大鼠腹腔激活巨噬细胞分泌 TNF-α
的影响　每孔加入终浓度为 10 μg/ml的 LPS刺激巨噬细胞 , 同
时加入不同剂量的大蝎子草水层部位。结果表明大蝎子草水层
部位组 2.70 ～ 67.50μg/ml剂量范围内对 LPS诱导巨噬细胞产
生 TNF-α具有抑制作用 , 结果见表 2。
　　表 2　大蝎子草水层部位对大鼠腹腔激活巨噬细胞分泌 TNF-α的
影响( x±s, n=5)
组别 剂量 (μg/ml) TNF-α(/%) 平均光密度(AU)
对照 0.00±0.00＊＊ 0.344±0.039＊＊
LPS 28.973±4.406 0.505±0.021
大蝎子草 0.11 16.603±3.578 0.488±0.053
大蝎子草 0.54 14.748±5.136 0.494±0.022
大蝎子草 2.70 13.559±2.553＊ 0.404±0.029＊＊
大蝎子草 13.50 10.895±4.441＊ 0.402±0.021＊＊
大蝎子草 67.50 11.846±4.115＊ 0.399±0.023＊＊
2.3　大蝎子草水层部位对 LPS诱导巨噬细胞 iNOS的影响　
免疫细胞化学结果显示巨噬细胞经 10μg/mlLPS刺激 48h后 ,
LPS组与对照组的 iNOS平均吸光度值分别为 0.505±0.021 、
0.344±0.039, 表现为细胞的着色明显加深 , 平均吸光度值显著
升高(P<0.01),提示经 LPS刺激 48h后巨噬细胞内 iNOS明显
增强。大蝎子草水层部位组在 2.700 ～ 67.500μg/m的浓度范
围时 , 与 LPS组比较平均吸光度值显著下降(P<0.01),提示大
蝎子草水层部位组能明显抑制 LPS诱导的巨噬细胞的 iNOS合
成 ,结果见表 2和图 1。
图 1 　大蝎子草水层部位对 LPS诱导的巨噬细胞中 iNOS的影响(A.对照组 , BLPS组 , C～G:大蝎子草水层部位 0.11、0.54、2.70、13.50、67.50μg/ml)
3　讨论
　　我们经过广泛的调查 ,贵州不少民族地区以荨麻科蝎子草
属植物大蝎子草 Girardiniadiversiforlia(Link)Friis的全草或
根作为活麻药材广泛使用。我们前期的研究结果证实 , 大蝎子
草提取物水层部分具有较强的抗炎活性 , 而民间用药的主要方
式是水煎煮 ,这与我们初步筛选结果相一致。因此 , 本研究以大
蝎子草水层部位为研究对象 ,分析其对 LPS诱导巨噬细胞炎症
因子表达的影响 ,为进一步的研究提供实验基础。 LPS可通过
刺激单核细胞 、巨噬细胞分泌多种细胞因子和炎症介质 ,引起机
40 中药药理与临床 2010;26(3)
体在刺激剂局部和全身产生明显的炎症反应和免疫调节作用。
实验结果显示 , 以 LPS刺激巨噬细胞分泌 TNF-a显著增加 , 而
大蝎子草水层部位 2.70 ～ 67.50μg/ml均能显著抑制巨噬细胞
产生 TNF-α。由于 TNF-a作为一种炎性因子 , 引起机体严重的
毒性反应 , 使机体发生病变 , 加剧炎症反应 , 甚至多器官功能衰
竭 , 大蝎子草水提取物通过抑制 TNF-α发挥抗炎作用可能是其
作用机制之一。 iNOS-NO系统为重要的炎症系统之一。活化的
巨噬细胞在受到内毒素 、炎症介质等刺激下会分泌诱导型一氧
化氮合成酶(iNOS)诱导合成大量的 NO与多种炎症疾病发生
有关等 [ 4] 。大蝎子草水层部位在 13.5 ～ 67.5μg/ml可以显著
抑制 LPS诱导的 NO的产生 , 在 2.7 ～ 67.5ug/ml能明显抑制
LPS诱导的巨噬细胞 iNOS的合成 , 大蝎子水提取物抑制 iNOS
的表达 , 抑制 NO的产生 , 从而发挥抗炎作用。
　　本研究从细胞水平初步证实大蝎子草水层部位能抑制 LPS
诱导的巨噬细胞 iNOS表达 ,减少 NO和 TNF-α的分泌 , 缓解炎
症反应 , 为其进一步的深入研究奠定实验基础。但是 , 本实验只
是在细胞水平验证大蝎子草乙酸乙酯部位对 LPS诱导的炎症
介质表达进行初步探讨 ,其作用机制有待于进一步深入研究。
参考文献
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phage-derivedtumornecrosisfactor-alphagenerationduringachronicpolyar-
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2008;22(8)∶ 1030～ 1034
InhibitedeffectsofHerbaGirardiniawaterextractonexpressionofiNOSandTNF-α
inmacrophagesinducedbyLPS
ZhiNa, TaoLing1 , ShenXiangchun
(1 ResearchDivisionofPharmacology, GuiyangMedicalColege, Guiyang　550004;
2 DepartmentofPharmacyandBiopharmaceutics, GuiyangMedicalColege, Guiyang　 550004)
　　Objective:ToinvestigatetheinhibitedefectsofofHerbaGirardiniawaterextractoninduciblenitricoxidesynthase(iNOS)expression
inmacrophages, andnitricoxide(NO)andtumornecrosisfactor-alpha(TNF-α)excretioninmacrophagesinducedbylipopolysaccharide
(LPS).Methods:ThemodelwasreproducedbyLPSstimulatingmacrophagesincultureinvitro.InducedNOSwasdetectedbyimmuocyto-
chemistrymethod, NOcontentsinmediumwereassayedbyGriessmethod, andtheTNF-αcontentsinmediumweremeasuredbyindirect
MTTmethod.Resutls:InducedNOSexpressionofmacrophages, NOandTNF-αcontentsinmediumofmacrophagesaresignificantlyin-
creasedafterthestimulationbyLPS.HerbaGirardiniawaterextractcanremarkableamelioratetheindexes.Conclusion:HerbaGirardinia
waterextractinhibitstheinflammatoryreactionatcelllevel.
Keywords　HerbaGirardinia, macrophage, inducedNOS, lipopolysaccharide(LPS), induciblenitricoxidesynthase(iNOS), tumornec-
rosisfactor-alpha(TNF-α)
补肾方药对皮质酮致损伤大鼠胸腺细胞周期相关基因表达的影响＊
龚张斌 ,金国琴＊＊
(上海中医药大学基础医学院 , 上海 　201203)
　　摘　要　目的:研究补肾益气方对皮质酮致损伤大鼠胸腺细胞周期和 p16、CDK4、IL-2Rα表达的影响。方法:1×10-5M皮质
酮处理新生乳鼠胸腺细胞。 PI染色结合流式细胞术分析细胞周期分布;RealtimePCR和 Westernblotting法检测 p16、CDK4、IL-2Rα
的表达变化。结果:胸腺细胞经皮质酮处理后 , 显著阻滞于 G1期;p16表达显著升高 , CDK4、IL-2Rα表达降低(P<0.05)。与皮质
酮组比较 , 补肾益气组 G1期细胞数量减少 , S期细胞数量升高(P<0.01);p16基因表达降低 , IL-2Rα表达升高;CDK4表达无明显
变化。结论:补肾益气方能抑制 p16的表达 ,缓解皮质酮对胸腺细胞周期的抑制作用 ,提高胸腺依赖性免疫功能。
　　关键词　补肾益气方;胸腺细胞;细胞周期
41中药药理与临床 2010;26(3)
＊ 资助项目:1.国家自然基金(30873317), 2.上海市教育委员会重点学科建设项目(J50301), 3.上海市教委基金(No.06cz011)　＊＊通讯作者