全 文 ：基于 ITS序列云南老虎须(Tacca chantrieri)居群遗传多样性的探讨
赵月梅1，2，张 玲2* (1．商洛学院生物医药工程系，中国中医研究院商洛中药材 GAP科研工程中心，陕西商洛 726000;2．中国科学院西
双版纳热带植物园，云南勐腊 666303)
摘要 ［目的］研究 9个云南老虎须居群的亲缘关系，为该种质资源的合理利用和保护提供理论依据。［方法］利用 ITS序列分析技术，
对采自云南省的 9个老虎须居群共 118个样品进行遗传多样性研究。［结果］9 个老虎须居群的样品的 ITS序列被分成了 2个大组，滇
南 4个居群聚为一组，滇东南的 5个居群聚为另一组。9个居群共 6个单倍型，两组之间无重合单倍型。［结论］老虎须的遗传多样性很
低，遗传变异主要存在于居群之间。这可能是因为云南分布的老虎须是以自交为主的植物，因此对老虎须进行迁地保护时应该是尽量
引种多个居群。
关键词 老虎须;ITS序列;遗传多样性
中图分类号 R282． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)34 －21014 －02
Discussion on Genetic Diversity of Tacca chantrieri Population in Yunnan Province Based on ITS Sequence Analysis
ZHAO Yue-mei et al (Biological Medicine Engineering Department of Shangluo University，Shangluo GAP Research Engineering Center
for Traditional Chinese Medicine，China Academy of Traditional Chinese Medicine，Shangluo，Shaanxi 726000)
Abstract ［Objective］The study aimed to investigate the genetic relationship among 9 populations of Tacca chantrieri in Yunnan Province and
provide the theoretical basis for the rational utilization and protection of the germplasm resources． ［Method］The ITS sequence analysis tech-
nology was used to make for the research on the genetic diversity of 118 samples collected from 9 populations of Tacca chantrieri in Yunnan
Province． ［Result］The samples from 9 populations were divided into 2 groups:one included 4 populations from the south of Yunnan Prov-
ince;another included the rest 5 populations from the southeast of Yunnan Province． There were 6 haplotypes in 9 populations and there was
noncoincidence haplotype between 2 groups． ［Conclusion］T． chantrieri showed a very low genetic diversity，the genetic variation was mainly
among populations． This may be attributed to that the T． chantrieri distributed in Yunnan Province is the plant with the self-pollination as the
main． Therefore，the more populations should be introduced as far as possible when T． chantrieri was made for the off-site preservation．
Key words Tacca chantrieri;ITS sequence;Genetic diversity
基金项目 中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-YW-Z-
0904)和科技部大科学装置工程项目(2009-LSF-GBOWS-
01)。
作者简介 赵月梅(1982 －) ，女，辽宁锦州人，助教，硕士，从事植物谱
系地理方面的研究。* 通讯作者，博士，副研究员，硕士生
导师，E-mail:zhangl@ xtbg． org． cn。
收稿日期 2011-02-07
老虎须(T． chantrieri)又名蒟蒻薯、大叶屈头鸡、老虎汤、
老虎花、山大黄［1］，分类学上属于薯蓣科(Dioscoreaceae)蒟蒻
薯属(Tacca) ，是热带雨林中一种引人注目的多年生草本植
物。其花型、花色独特，胡须状的小苞片长几十厘米，紫黑
色，飘逸下垂，形如虎须，整个花序看上去像一张老虎的面
孔，故名为“老虎须”。老虎须根茎入药，性凉味苦，能清热解
毒，消炎止痛，主治胃及十二指肠溃疡、高血压、肝炎、胃痛、
烫伤烧伤、疮疡等，具有重要的药用价值［2］。老虎须分布区
很广，主要在印度东北部、孟加拉、缅甸、泰国、老挝、越南、柬
埔寨、马来半岛和我国滇、桂、粤、琼等省区。由于他具有特
殊的花型、花色等特点已被园艺工作者大量运用于园林营
造，同时由于其重要的药用价值也促使其被过度采挖，加之
目前自然环境日益遭到破坏，使得老虎须的生境也处于濒危
状态。至 1992年该物种被国家列为保护植物［3］。
转录间隔区(ITS)存在于高度重复的核糖体 DNA中，位
于 18S和 26S基因之间，由 5． 8S基因分为 ITS1 和 ITS2 两个
区段，ITS序列变异较快，可以提供丰富的变异位点和信息位
点，已经被证实它是许多植物类群系统分类与进化的重要分
子标记［4］。笔者通过对云南省 9个居群的老虎须样品的 ITS
序列变异性的比较来研究这些老虎须样品在进化上的亲缘
关系，以期为该物种的合理利用和保护提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料来源 研究选取了云南省老虎须分布区的共 9个
居群的样品，材料来源见表 1。
表 1 老虎须居群信息
Table 1 Population descriptions of T． chantrieri
编号
No．
种群缩写
Abbrev-
iation
取样数
Sample
size
地理位置
Position
海拔
Altitude
m
单倍型组成
Haplotype
composition
1 坝沙河 BSH 14 22°53 N，101°56 E 680 ～960 H1
2 古林箐 GLQ 10 22°45 N，103°58 E 700 ～1 200 H3
3 芹菜塘 QCT 10 22°40 N，104°01 E 680 ～780 H3
4 野象谷 14 22°10 N，100°51 E 760 H2
5 田蓬 TP 10 23°12 N，105°32 E 900 H4
6 望天树WTS 20 21°37 N，101°35 E 680 H1
7 小黑江 XHJ 20 23°21 N，100°55 E 800 H1
8 麻栗坡 MLP 10 22°58 N，104°51 E 800 H5
9 德隆 DL 10 23°17 N，105°50 E 600 H6
1． 2 DNA的提取 DNA提取采用 CTAB法提取全基因组
DNA［5］，将 DNA溶于 TE溶液中，终浓度大约为 50 ng /μl。
1． 3 ITS 序列的扩增与测定 PCR 扩增反应在 PERKIN
ELMER(PE)9700型 PCR仪上进行。ITS片段扩增反应程序
采用:97 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 2 min，54 ℃退火 1． 5
min，72 ℃延伸 1 min。32 个循环后，72 ℃延伸 7 min。扩增
反应采用 20 μl的反应体系:包括 30 ～ 60 ng 的模板 DNA，2
μl 10 × buffer，0． 5单位的 Taq DNA聚合酶(5 U /μl) ，1． 5 μl
的 MgCl2(25 mmol /L) ，1． 5 μl的 dNTPs(10 mmol /L) ，正反向
引物各 2 μl(5 μmol /L) ，再添加蒸馏水至 20 μl。采用通用
引物 ITS5: (5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3) ，ITS4:
(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) (引物由上海生物工程
公司合成) ;扩增得到的 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合
格后，用上海生物工程技术服务有限公司的纯化试剂盒纯化
并测序。鉴于 ITS5端存在着测序难度，所以采用 ITS4 端单
责任编辑 夏静 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(34):21014 － 21015，21036
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.34.218
向测序。
1． 4 序列分析 采用 BIOEDIT［6］进行序列查看;用 Clustal
X 2． 0［7］进行序列比对并人工校正，用 DnaSP 计算单倍型类
型、单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π) ;用 MEGA 4． 0［8］
进行系统发育分析，并以自展法进行检测，共循环 1 000 次;
采用邻接法(Neighbor-Joining)构建严格一致的树;然后用
Kimura双参数模型构建单倍型之间序列差异的矩阵。
2 结果与分析
2． 1 老虎须 ITS 序列多态性分析 对老虎须 ITS 片段测
序，获得 582 bp碱基对。其中 G + C含量为 63． 3%，118个样
本共检测到多态性核苷酸变异位点 10 个(占全部碱基数目
的 1． 72%) ，信息位点 9个(表 2) ，序列中 1个插入 /缺失，其
余均为碱基之间的转换或颠换，转换 /颠换(R)为 1． 25。
表 2 老虎须 6种单倍型 ITS变异位点信息
Table 2 Variable sites of the aligned sequences of the ITS in 6 haplo-
types of T． chantrieri
单倍型
Haplotypes
位点 Site
38 72 119 198 268 295 481 510 554 580
H1 A G G C － T G G C A
H2 A G G C － T C G C A
H3 G A C A － T C A C G
H4 G A C C － T C A C G
H5 G A C A G G C A T G
H6 G A C C － T C A T G
2． 2 个体间的多态性分化、遗传距离及系统树的构建 根
据对 9个居群共 118个样本的分析，共产生 6种单倍型。单倍
型H1分布于滇南 3个居群中，即H1为 XHJ，BSH和WTS 3个
居群的共享单倍型;H2 为 YXG 居群特有单倍型;H3 为 GLQ
和 QCT两个居群共享;H4只分布于 TP居群;H5为 MLP居群
独有单倍型;H6为 DL居群独有单倍型，NJ树中聚成两大组的
各居群之间无共享单倍型(表 1)。单倍型之间的核苷酸变异
率为0． 2% ～1． 6%(表3)，平均0． 75%。单倍型多样性(Haplo-
type diversity)指数和核苷酸多样性(Nucleotide diversity)指数
分别为:h = 0． 732(0． 032)和 π = 0． 006 52(0． 000 27)。由
MEGA4． 0生成的 NJ树可知:6个单倍型聚成 2大组，H3，H4，
H5，H6聚为一组(组Ⅰ);H1，H2聚为另一组(组Ⅱ)，结合单倍型
所在居群的位置，即:位于滇东南的 5 个居群 GLQ，TP，QCT，
MLP，DL5个居群聚为一组(组Ⅰ)，位于滇南的 4 个居群 BSH，
XHJ，WTS，YXG聚为一组(组Ⅱ)(图 1)。
表 3 老虎须各单倍型间基因序列差异
Table 3 Squence divergence among haplotypes of T． chantrieri
单倍型 Haplotypes 1 2 3 4 5 6
1 H1
2 H2 0． 002
3． H3 0． 012 0． 010
4． H4 0． 010 0． 009 0． 002
5 H5 0． 016 0． 014 0． 003 0． 005
6． H6 0． 012 0． 010 0． 003 0． 002 0． 003
3 讨论
该研究利用 ITS序列变异得知该序列碱基的转换 /颠换
(R)为 1． 25，小于 2，说明碱基替代已达到饱和［9］，这可能是
图 1 基于 ITS区基因序列构建无根 NJ树
Fig． 1 Unrooted neighbour-joining (NJ)tree based on ITS se-
quence
由于某些位点发生了多次转换替代，转换出现了饱和现
象［10］;序列中 G + C含量达到 63． 3%，说明该序列保守性很
强;单倍型间的核苷酸平均变异率为 0． 75%，处于较低的遗
传变异水平;滇南的 3个居群 BSH，WTS和 XHJ共同享有单
倍型 H1，滇东南的 GLQ 和 QCT 2 个居群共同享有单倍型
H3，其余居群均为各自的独有单倍型，而居群之内单倍型多
样性均为 0，说明变异均存在于居群之间，所以在制定保护政
策时要尽量兼顾到更多的小居群，不能只保护数量大的居
群，以防止其遗传多样性的降低。利用 MEGA4． 0构建 NJ树
得知云南老虎须居群遗传结构的特点:滇东南的 5 个居群
GLQ，QCT，TP，MLP和 DL亲缘关系较近，聚为一组(组Ⅰ) ;滇
南的4个居群XHJ，BSH，YXG和WTS之间亲缘关系较近，聚
为另一组(组Ⅱ) ，两组无共享单倍型，遗传距离最大。这一结
果与张玲等用 ISSR得出的结论相符［11］，有可能是与居群所
在的地理和生态环境等下列原因有关:(1)朱华针对云南热
带 －亚热带植物区系的分布格局根据植物类群上的相似性
证明了滇西、滇南地区与滇东南地区原属于不同的大陆板
块［12］，因此研究中位于滇南的 4 居群亲缘关系较近，而位于
滇东南的 5居群亲缘关系较近;(2)老虎须是以自交为主的
植物［13］，这种繁殖方式也使得居群之间遗传变异更大，形成
共享单倍型的机会减少;(3)老虎须多生长在林下小溪边等
阴湿的环境，这种生境导致大部分种子只能通过小溪等水路
传播，相对风力，动物等传播方式来讲，可传播的范围要小的
多。以上几点均可以导致目前云南老虎须居群之间交流的
局限性。
ITS序列解决了很多被子植物不同分类等级的遗传分化
问题［14 －17］，研究结果也证明 ITS序列适用于老虎须物种种内
不同居群之间的遗传关系的研究，因此该序列对于研究老虎
须居群甚至该属的其他物种种内、种间的系统发育问题都具
有一定的参考意义。
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(下转第 21036页)
5101239 卷 34 期 赵月梅等 基于 ITS序列云南老虎须(Tacca chantrieri)居群遗传多样性的探讨
2 结果与分析
2． 1 菌株形态及染色特征 在温度 37 ℃的 THB固体培养
基中培养 24 h后，菌落生长良好，平板上菌落形态均为圆形、
微凸、表面光滑、半透明、灰白色，直径约 0． 5 ～ 1 mm。液体
培养物以长链为主，有大量絮状沉淀生成于试管底部。挑取
单个菌落进行革兰氏染色镜检，显微镜下呈蓝紫色，链长短
不一，单个或成对分布，多数呈 3 ～5个短链排列，少数为 6 ～
10个长链排列，为革兰氏阳性链球菌。
2． 2 溶血性试验结果 通过点接种，分离菌株在绵阳血平
板上大部分无溶血现象，菌落周围无溶血环，溶血阴性为 γ
型溶血链球菌，仅少数呈现弱的 α溶血(图 1)。
2． 3 种属鉴定结果 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电
泳图谱中在约 500 bp处有 1条特异性亮带，与预期片段大小
相符(图 2) ，可确定扩增出的 PCR 产物为 16S rDNA。将
PCR产物回收纯化后送交大连宝生物工程公司进行测序，共
测得部分 16S rDNA碱基序列为 557 bp。BLAST结果表明所
得序列与猪链球菌的同源性最高达 99%。从图 3可以看出，
该菌株属于猪链球菌 2型。
2． 4 毒力因子的检测结果 设计 7对引物来检测毒力因子
的分布。ef、mrp和 sly一直被认为是猪链球菌的 3 种重要毒
力因子，但毒力因子 mrp 只在目的片段附近出现弱的表达。
其他毒力因子表达明显，毒力因子分布结果为:cps2J + /
orf2 + / fbps + / sly + /mrp － / ef + /gdh +，扩增出的片段大小与预期
目的基因一致(图 4)。
注:M． DL5000 Marker;1 ～7分别为 cps2J、orf2、fbps、sly、mrp、ef、gdh +。
Note:M． DL5000 Marker;1 － 7 are cps2J，orf2，fbps，sly，mrp，ef
and gdh．
图 4 毒力因子的 PCR鉴定结果
Fig． 4 Detection of the virulence genes by PCR
3 小结
该试验将常规菌种鉴定方法与 16S rDNA序列分析技术
相结合。16S rDNA 序列同源性分析结果表明，分离菌株与
猪链球菌同源性高，同源率最高达 99%，并确定该分离菌株
为猪链球菌 2型。
猪链球菌 2型致病力的差异与该菌株的毒力因子有着
密切的联系［7］，猪链球菌的致病力存在个体差异，致病力的
大小有强弱之分［8］。毒力因子 mrp和 ef 在强毒株中检出率
很高，在非致病菌株中检出率很低，因此 mrp 和 ef 常被认为
是猪链球菌 2型高致病性的标志［9］。曾巧英等［10］研究表明
mrp可单独作为猪链球菌 2型的毒力因子。该试验选取 7种
主要毒力因子对分离菌株进行 PCR检测，除mrp的表达较弱
外，均检测到其他 6 种毒力因子。赵冉等［11］研究表明在 25
株国内致病性猪链球菌 2型分离株中 96%(24 /25)具有毒力
基因型 cps2J + /orf2 + / fbps + / sly + /mrp － / ef + /gdh +。方勤美
等［6］研究表明我国猪链球菌毒力因子的主要基因型是同时
具备这 7种毒力因子。该试验中分离菌株与猪链球菌 2 型
的多数致病株毒力性分布情况相一致［3］，可为下一步研究该
分离菌株的致病机理奠定基础。
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