全 文 ：收稿日期:2011 － 05 － 30
作者简介:徐莲芝，女(1988 －) ，本科生
基金项目:金华市科技局一般项目(2009 － 2 － 020)
* 通讯作者
小果短柱茶花粉离体培养系统的研究
徐莲芝，廖芳蕾*
(浙江师范大学生化学院，浙江金华 321004)
摘要:山茶的短柱茶组是优良种质资源，有必要对小果短柱茶(Camellia confusa Chang 1941)的花粉萌发和花粉管生长的
生理特性进行研究。本文研究了花粉生活力、培养温度及 pH对小果短柱茶花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明:最适
离体萌发培养基为 5%蔗糖、0． 003%的硼酸，0． 005%的氯化钙和 12%的 PEG － 6000，培养温度在 20℃左右，培养基的 pH值为
6． 5。当天早上采摘的花粉生活力很强，不论是早上、中午还是晚上培养其萌发率均达到 80%以上。
关键词:小果短柱茶;花粉萌发;花粉管生长;pH;温度
中图分类号:Q943． 1 文献标识码:A 文章编号:1006 － 8376(2011)03 － 0038 － 05
短柱茶组隶属于山茶科山茶属，全世界共 l6 种
1 变种，我国产 13 种 1 变种。该组中有一些种类，
如小果短柱茶(Camellia confusa Chang 1941)作为优
良的种质资源而受到关注［1］。花粉萌发、花粉管生
长是高等植物有性生殖过程中的一个重要环节。花
粉是受精中的关键环节［2］。研究影响短柱茶组花
粉萌发和花粉管生长的因素能为人工授粉和进行相
关试验研究时提供依据。
花粉萌发率是研究花粉生活力的一项重要指
标，花粉萌发培养基主要成分是蔗糖和硼酸。蔗糖
的作用是提供合适的渗透压和花粉管形成所需能
量，硼酸的作用是促进花粉管的萌发［3，4］。不同植
物花粉萌发所需要的培养基种类和浓度不同。基本
培养基的基础上应添加其他促进花粉萌发的物质，
如 Ca(NO3)2、MgSO4、KH2PO3、VB1、PEG(聚乙二
醇)等［5，6］。
花粉萌发和花粉管生长与萌发时的环境条件密
切相关。温度在花粉萌发过程中起着重要的作用。
拟南芥花粉萌发的最适温度范围是 18℃ ～ 24℃［7］．
温度过高可降低花粉的萌发率［8，11］。花粉具有调节
培养基 pH到最适合其萌发的能力［9］，但培养基的
pH超出花粉的调节范围，花粉萌发就会受抑制。不
同植物最佳萌发、生长 pH 不尽相同［9 ～ 11］。确定花
粉萌发的最适温度和最适 pH 值对花粉离体萌发系
统的建立有重要意义。
本研究以小果短柱茶(Camellia confusa Chang
1941)为材料，建立了短柱茶组适合的花粉离体萌
发培养体系，为该茶组的生殖生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
小果短柱茶采自金华市下张家村国际山茶园种
植基地(Camellia confusa Chang 1941)。植株均为健
康、无病虫害。
1． 2 花粉的采集
实验材料的采集一般在早上 9 点左右，此时花
粉数量最多。
每次实验均采集当天开裂但尚未散粉的新鲜花
药，放入装有硅胶的硫酸纸小袋中;再迅速带回实验
室，放入液体培养基，置于 25℃恒温培养箱中恒温
培养。
1． 3 花粉的离体萌发测定
本实验采用液体培养基，以蔗糖、硼酸、氯化钙、
PEG －4000 为培养基组分［12 ～ 14］。经过预实验最终
确定液体培养基的组分为蔗糖、硼酸、氯化钙、PEG
－6000(表 1)。在配置培养基时，因为硼酸比较难
溶以及硼酸和氯化钙的浓度很小，所以首先分别配
置 0． 1%的硼酸母液和氯化钙母液。
表 1 液体培养基组分
组分 蔗糖 硼酸 氯化钙 PEG － 6000
质量分数 /% 15 0． 003 0． 005 12
培养花粉时，用洗净的镊子夹住带有花粉的花
药，在盛有液体培养基的塑料培养皿中来回搅拌数
次，将花粉洗入液体培养基中，最后放入培养箱恒温
培养，一定时间后取出来观察。将培养一定时间的
氨基酸和生物资源 2011，33(3) :38 ～ 42
Amino Acids ＆ Biotic Resources
DOI:10.14188/j.ajsh.2011.03.019
花粉每隔 1 h置于显微镜下观察，物镜放大倍数为 5
倍，观察花粉的萌发情况。每个装片随机选取 5 个
视野(每个视野花粉不少于 30 粒)进行观察，统计
每个视野的萌发花粉数量和花粉粒总数(以花粉管
长度大于花粉半径为萌发花粉) ，并计算萌发率。
1． 4 花粉活力测定
将当天采集到的小果短柱茶花粉放入现配的液
体培养基中，以 1 个花药:1mL液体培养液的比例在
25℃的生化培养箱中培养 2 h。从早上 9 点开始培
养花粉，每隔 2 h培养一批，直到晚上 7 点为止。每
隔 1 h要观察一次并统计每个视野的萌发花粉数量
和花粉粒总数，计算萌发率。
1． 5 花粉离体萌发的最适培养温度
将当天采集到的小果短柱茶花粉放入现配的液
体培养基中，以 1 个花药:1mL液体培养液的比例在
生化培养箱中培养 3 h。培养温度设了 5 个梯度，分
别为 5℃、10℃、15℃、20℃、25℃。每隔 1 h 要观察
一次并统计每个视野的萌发花粉数量和花粉粒总
数，计算萌发率。显微镜下拍照，测量花粉管的长
度，统计不同温度下花粉管生长的平均长度。采用
Image J测定花粉管长度，在EXCEL软件中统计分
析并作图。
1． 6 花粉离体萌发的最适 pH
将当天采集到的小果短柱茶花粉放入现配的不
同 pH(见表 2)的液体培养基中，以 1 个花药:1mL
液体培养液的比例在 20℃生化培养箱中培养 3 h。
每隔 1 h要在 5 倍显微镜下拍照，测量花粉管的长
度，统计不同 pH 下花粉管生长的平均长度。3 h
后，用 pH计测量含有花粉的液体培养基的 pH 值。
用 0． 1%氢氧化钠调碱，用 0． 1%盐酸调酸。
表 2 不同 pH对花粉萌发的统计分析
实验编号 原始 pH值 实验 pH值 3h后测量的 pH值
A 6． 73 5． 63 6． 45
B 6． 67 6． 67 6． 69
C 6． 51 7． 14 6． 73
D 6． 53 8． 07 6． 85
2 结果与分析
2． 1 温度对花粉离体萌发的影响
在 5℃、10℃、15℃、20℃和 25℃这 5 个温度梯度
下离体培养小果短柱茶花粉的实验，发现花粉离体萌
发的萌发率受温度影响极大。如图 1、图 2 所示。
图 1 不同培养温度下小果短柱茶花粉萌发率
图 2 不同培养温度下花粉管平均长度分析
单一的观察图 1 可以发现随着培养时间的延
长，花粉萌发率提高，3 h 之后花粉萌发率均达到
80%以上，特别是在 15℃、20℃、25℃的温度下恒温
培养 1 h便可达到 80%的萌发率。再结合图 2 可以
发现，培养时间达到 3 h 时，5℃和 10℃条件下的花
粉管平均长度分别只有 134． 8 μm 和 399． 1 μm，可
·93·徐莲芝等: 小果短柱茶花粉离体培养系统的研究
以说生长相当缓慢，而其他培养温度下的花粉管平
均长度都较长，在 20℃和 25℃的花粉管平均长度都
已超过了 1500 μm．因此，温度对花粉萌发的影响可
总结为:小果短柱茶花粉萌发的适宜温度在 15℃ ～
25℃之间，它既保证了花粉离体萌发的萌发率，又保
证了花粉管的生长速度．
2． 2 pH对花粉离体萌发的影响
通过测量现配的液体培养基的 pH 值发现，液
体培养基的 pH在 6． 50 左右。用 0． 1%氢氧化钠和
0． 1%盐酸调节酸碱性，使液体培养基达到实验所需
的 pH范围内。通过实验发现，花粉萌发一段时间
后，培养基的 pH值发生变化，有成弱酸性中性的趋
势。如表 2、图 3．
从表 2 中可以发现:将 pH 值从 6． 73、6． 67、
6． 51、6． 53 分别调为 5． 63、6． 67、7． 14、8． 07 后培养
小果短柱花粉 3 h 后，培养基的 pH 值分别变为
6． 45、6． 69、6． 73、6． 85，即回归到弱酸性。则可推
断，小果短柱茶花粉在萌发的过程中会释放出某种
物质来调节 pH值最终达到最适的 pH生长值;一旦
液体培养基的 pH 值超过了花粉的自我调节能力，
花粉便会不萌发或者在花粉管的末端出现胼胝质导
致生长停止。
图 3 不同 pH的液体培养基对花粉管生长的影响
从图 3 也可以看出，当液体培养基的 pH 值达
到 5． 63(即 A)时，小果短柱茶花粉管的生长受到抑
制，3 h后花粉管的平均长度只有 313． 0 μm，只能抵
得上另外三个 pH 值(即 B、C、D)下生长 1 h 的长
度。而且编号 B、C 和 D 内的花粉在培养 3 h 后花
粉管长度均超过 1400 μm。综合表 2 和图 3 可知，
编号 A的花粉虽然在 3 h 之内将 pH 调回至 6． 45，
但由于长时间的处在酸性条件下花粉管生长受到影
响，甚至停止生长，最终平均长度只有 313． 0μm。
因此，我们的结论为使用培养基本身的 pH(即 6． 5
左右) ，最适合短柱茶组的花粉管生长。
2． 3 花粉离体培养的最适培养基
结合山茶组其他离体萌发系统(数据未显示) ，
本次试验调整不同硼酸浓度，建立小果短柱茶的花
粉离体萌发系统。如表 3 所示。
表 3 花粉萌发率统计分析
试验号 蔗糖 /% 硼酸 /% 氯化钙 /% PEG － 6000 /% 1h萌发率 /% 2h萌发率 /% 3h萌发率 /%
1 5 0． 001 0． 005 12 75． 9 40． 5 81． 67
2 5 0． 002 0． 005 12 75． 0 69． 7 74． 36
3 5 0． 0025 0． 005 12 84． 0 86． 6 91． 7
4 5 0． 003 0． 005 12 86． 05 89． 64 93． 2
5 5 0． 0035 0． 005 12 0 84． 3 88． 4
6 5 0． 004 0． 005 12 0 0 76． 7
由表 3 可以发现，当硼酸浓度是在 0． 003%时
花粉的萌发率最高，高达 93%以上。因此花粉离体
萌发的最适培养基比例为 5%蔗糖 + 0． 003%硼酸
+ 0． 005%氯化钙 + 12% PEG －6000。
本次实验所采用的液体培养基的配方为 5%的
蔗糖、0． 003%的硼酸，0． 005%的氯化钙和 12%的
PEG －6000，培养温度在 20℃左右，培养基的 pH 值
为 6． 5。
2． 4 常温保存的花粉实验时间的影响
在早中晚不同时间取常温保存的花粉，在离体
·04· 氨基酸和生物资源
萌发培养基中培养，分别计算培养 1 h和 2 h的萌发
率。从图 4 中可以观察到，不论是早上、中午还是晚
上培养小果短柱茶花粉，其萌发率均达到 80%以
上，并且彼此之间对花粉最终的萌发率都不会有太
大的影响，可以说明小果短柱茶花粉的活力在早上
下午晚上均很强，试验可在任意时间点开始。但因
为花粉的保存会对花粉的萌发率产生影响，所以实
验一般都在花粉采集回到实验室就开始花粉相关特
性的研究，以减少外因对实验现象及实验结果的影
响。
图 4 不同培养时间下小果短柱茶花粉萌发情况
3 讨论
伴随着新技术的出现，花粉管的研究由早期通
过改变培养基的组成，测量花粉的萌发率和花粉管
的生长速率演变为目前的用荧光标记、显微观察等
试验监测方法观测花粉管动态的变化。但是，受各
种因素的限制，在柱头、花柱上研究花粉管的萌发与
生长较为困难，本实验室通过测量花粉的萌发率和
花粉管的长度来反映温度、pH值与花粉活力及花粉
管生长速度之间存在的相关性，但是花粉离体萌发
能否真实的反应花粉在自然条件下的特点，还需要
进一步验证。
忽略其他因素，单一改变温度来研究温度对花
粉离体萌发的影响，能够准确的反映温度与花粉萌
发之间的高度相关性，为以后研究花粉萌发提供参
考资料。
同样 pH对花粉萌发的影响得出的结论对以后
的花粉离体萌发研究中有一定的参考价值，但 pH
影响花粉萌发的分子机制目前还不清楚。如 Filek
等发现，矮牵牛花(Petunia hybrida)的柱头、花柱上
存在 pH梯度，柱头部分趋向酸性，并且一旦授粉，
柱头的酸性更强。小果短柱茶的试验结果与短牵牛
花的结果类似，所有这些结果似乎都暗示花粉的正
常萌发需要在一个最佳的 pH 条件下进行，推测花
粉对培养基 pH的调节或许是引起花粉“群体效应”
的一个因素［15］。
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Research on Pollen in vitro Germination
of Camellia confusa Chang
XU Lian － zhi，LIAO Fang － lei
(Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China)
Abstract:It is necessary to study the pollen germination and pollen tube growth in Camellia confusa Chang．
The effects of pollen viability，temperature and pH on the pollen germination and pollen tube growth were detected．
The results showed that the best in vitro germanation medium was 5% sucrose，0． 003% boric acid，0． 005% calci-
um chloride and 12% of the PEG － 6000 and incubation temperature around 20 ℃ and the medium pH value of
6． 5． Pollen picked in the morning kept a strong viability． Whether in the morning，afternoon or evening，their ger-
mination rates were all above 80% ．
Key words:Camellia confusa Chang 1941;pollen germination;pollen tube growth;pH;temperature
·24· 氨基酸和生物资源