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收稿日期: 2016-08-
基金项目: 国家自然科学基金青年项目(31201335)和安徽省自然科学基金青年项目(1308085QC51)共同资助。
作者简介: 郭雪梅，硕士研究生。E-mail：1175030129@qq.com
* 通信作者: 张 梁，博士，副教授。E-mail：zhangliang@ahau.edu.cn
安徽农业大学学报, 2016, 43(6): 1-
Journal of Anhui Agricultural University


HPLC-MSn对普洱茶各萃取组分与茶褐素中化学成分的分析

郭雪梅，梁玉红，陈 欣，张 梁*
(安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室，合肥 230036)

摘 要：普洱茶是一类具有多种保健功效的后发酵茶，茶褐素是其重要的功能成分。茶褐素是普洱茶在渥堆过
程中形成的一类结构非常复杂的混合物。茶褐素的主要成分是一类黄烷-3-醇的微生物代谢产物，其中以 Puerins
I-VIII 为代表。本研究利用系统的有机溶剂萃取，获得普洱茶不同萃取物和茶褐素组分，对获得的组分进行多酚
类成分分析，发现在茶褐素部位未检出 EC、GC、ECG，其中可可碱含量明显高于其他萃取部位。釆用高效液相色谱
-质谱联用法（LC-MSn）对普洱茶各萃取组分和茶褐素组分进行成分分析，比较普洱茶茶褐素与其它萃取物之间的
化学成分差异，发现了茶褐素部位的主要标志性代谢产物普洱茶素。
关键词：普洱茶；茶褐素；LC-MSn；成分分析
中图分类号：S 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2016)06000000

Analysis of chemical compounds of theabrowine from pu-erh tea using HPLC-MSn

LIANG Yuhong, GUO Xuemei, CHEN Xin, ZHANG Liang
(State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

Abstract: Pu-erh tea is a kind of post-fermented tea products, the bioactive polyphenols and theabrownine of
which possess varieties of healthcare functions. Theabrownine is a type of structurally complicated tea pigments,
which are formed during the piling fermentation of ripened pu-erh tea.The different fractions and theabrownine of
ripened pu-erh tea were separated using organic solvents’ extraction, and subsequently were compared polyphe-
nols chemically using high-performance liquid chromatography. EC, GC and ECG were not detected in the the-
abrownine，However, Theabrownine of theabrownine is higher than other extractions.The puerines were identified
as the special component in theabrownine by using high-performance liquid chromatography coupled mass spec-
trum (LC-MSn).
Key words: Pu-erh tea; theabrownine; LC-MSn; composition analysis

普洱茶是中国云南省特有的后发酵黑茶品种。
普洱毛茶在经过加水-渥堆-翻堆-装袋-出袋-晒干等
工序，让其快速红转而成为普洱熟茶[1]。渥堆是普
洱熟茶加工过程中一道重要工序，它促进了茶叶内
含物的转化以及茶褐素的生成，形成了普洱熟茶独
有的品质特征。经过渥堆之后，茶多酚尤其是其中
的儿茶素物质显著地降低，但是没食子酸成分含量
明显升高[2]。李连喜等[3]对茶褐素进行研究，结果
发现茶褐素是一类十分复杂的化合物，除含有多酚
类成分的氧化聚合、缩合产物外，还含有蛋白质、
氨基酸、糖类、核酸等结合物。Gong 等[4]人利用
CP-Py-GC-MS[4]（热解气相色谱光谱分析）方法对
普洱茶茶褐素的成分进行分析，结果发现其主要成
分有生物碱、酚类、含氮化合物、烃类、酮类、呋
喃、乙醇、脂肪酸、酯类和胺类等。吕海鹏[5]对普
洱茶的化学成分进行分析，测定了普洱茶中的儿茶
素、咖啡碱、茶多糖、蛋白质等化合物的含量，结
果发现普洱中的儿茶素主要是以非酯型的儿茶素形
式存在，其中表儿茶素(EC)含量较高。
利用传统分析天然产物化学的手段和波谱解析
技术，我们前期在普洱茶中发现了一类属于黄烷-3-
醇的微生物代谢产物 Puerins I-VIII[6]。此外，我们
DOI：10.13610/j.cnki.1672-352x.20161205.006 网络出版时间：2016-12-05 09:28:19
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20161205.0928.012.html
2 安 徽 农 业 大 学 学 报 2016 年

还利用各种色谱、波谱技术对普洱茶的化学成分进
行了分离纯化，鉴定了普洱熟茶中的 11 个黄酮类化
合物。研究发现普洱茶素 Puerins I-VIII 属于黑茶中
儿茶素的微生物转化成分，属于黑茶的标志性代谢
产物。一般认为茶褐素是黑茶，尤其是普洱茶中的
特异性成分。但是，茶褐素组分的化学成分与这些
普洱茶素类成分是否具有关联，尚缺少细致的研究。
为了探明茶褐素部分的化学成分结构及其组成，我
们用液相色谱-质谱联用（LC-MSn）对茶褐素部位
的化学成分进行了分析，并且通过与普洱茶其它非
茶褐素部位的成分进行对比，鉴定了茶褐素部位的
主要标志性代谢产物-普洱茶素。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究收集的普洱茶是由黎明茶厂提供。样品
批号为勐海熟茶 2010 八角亭 7590 熟饼。在生产过
程中，茶叶鲜叶经过杀青、柔捻、晒干制成晒青毛
茶，再经后发酵、蒸揉、成型制成普洱茶成品。
1.2 仪器与试剂
Waters 高效液相色谱仪（配有 Waters 1525
Binary HPLC 泵，Waters 2707 自动进样针，Waters
2489 UV/Visible 检测器），（Waters 公司，美国）；
色谱柱 Agilent SB- aq C18（4.6×250 mm，5 µm），
（Agilent Technology 公司，美国）。TSQ Vantage 三
重四极杆液相色谱-质谱联用仪（Thermo Fisher 科
技公司，美国），包括 UltiMate3000、UHPLC、自
动进样器、柱温箱及 TSQ 质谱仪。KQ-500DE 型数
控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
AB104-N 电子分析天平（ Mettler Toledo 公司，瑞
士）；EYELA 旋转蒸发仪（东京，日本）；AV400 型
核磁共振仪（Bruker 公司，美国）；VORTEX-GENIE2
漩涡混合器（Scientific Industries 公司，美国）；无
水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，以上试剂
均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇，
乙腈均为色谱纯。
1.3 样品的制备
取普洱茶 5 kg，粉碎，无水乙醇浸提 2 次，料
液比 1:5，浸提 24 h，抽滤，无水乙醇溶液减压浓缩
得到浸膏 A。茶渣用 90 ℃水浸泡 6 h，抽滤，滤液
分别用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂
依次萃取 2 次，减压浓缩分别得到二氯甲烷浸膏 B、
乙酸乙酯浸膏 C、正丁醇浸膏 D；水相减压浓缩，
加入无水乙醇，静置 24 h，抽滤，收集沉淀干燥后
即为茶褐素 F，将水相继续减压浓缩，得到浸膏 E。
准确称量无水乙醇部位、二氯甲烷部位、乙酸
乙酯部位、正丁醇部位、水相部位、茶褐素样品各
10 mg，1 mL 50%甲醇溶液溶样，先混漩 3 min，然
后超声 20 min，13000 r·min-1 离心 10 min，取上清
液，将上清液稀释 5 倍，经 0.22 µm 微孔滤膜过滤
后进样分析。
1.4 各萃取物测定的 HPLC 条件
按照文献[7]建立的茶多酚类成分的分析方法，
对主要的化合物进行了含量测定。HPLC 条件：流
动相 A 为 0.2%甲酸水溶液，流动相 B 为乙腈。运
行时间为 60 min，梯度洗脱条件如下：甲酸水(A)-
乙腈(B) (V/V)，95:5~70:30（0~60 min）；流速为 1.0
mL·min-1，检测波长为 278 nm，柱温为 30 ℃，进
样量 5 µL，测定各个萃取物组分和茶褐素主要化学
成分的含量。
1.5 UPLC-MS 分析
UPLC 条件：流动相 A 为 0.05 %甲酸水，流动
相 B 为乙腈，梯度洗脱条件：0~2 min，A：95%；
2~9 min，A：95%~72%；9~11 min，A：72 %~10 %；
11~13 min，A：10 %；13~17 min，A：10 %~95%。
检测波长：280 nm，柱温 30 ℃±5，流速 0.3
mL·min-1，进样量为 5 µL。质谱条件：电喷雾离子
源（ESI）；源电压 3.5 Kv，毛细管温度 325 ℃，毛
细管电压 35 Kv，壳气压 172.375 kPa，辅助气压
82.74 kPa；采用全离子扫描方式，扫描范围（质荷
比，m/z）100~2000。
1.6 茶褐素中普洱茶素的分离纯化和鉴定
将茶褐素部位样品通过 HPD700 大孔吸附树
脂，用醇水作为洗脱剂，洗脱梯度分别是 5%、10%、
15%、20%、50%和 95%的乙醇。减压浓缩各层洗
脱剂下的溶液，取 20%乙醇洗脱下的干燥物质。用
纯水溶解样品，将该物质通过 ODS 反相柱，分别用
20%、40%、60%、80%和 100%的甲醇洗脱。将各
梯度下的溶液减压浓缩。将 20%梯度下的干燥物质
用纯水溶解，将该物质通过 HPLC 进行分离制备。
HPLC 条件：流动相 A 为甲醇，流动相 B 为水，梯
度洗脱条件：0~12 min，A：25~48；12~18 min，A：
48~60；18~30 min，A：60~85；30~35 min，A：85~25；
35~45 min，A:25。检测波长：254 nm，流速：1
mL·min-1，进样量：50 µL，温度 30℃。
2 结果与分析
2.1 普洱茶各萃取物和茶褐素的主要成分
热水提取普洱茶获得普洱茶水提取物，之后依
次采用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得
43 卷 6 期 梁玉红等: HPLC-MSn对普洱茶各萃取组分与茶褐素中化学成分的分析 3


到二氯甲烷（B）、乙酸乙酯（C）和正丁醇（D）
萃取物。普洱茶各组分的提取率结果如图 1 所示，
二氯甲烷提取物（B）含量最高，占茶叶干重的
6.04%，主要成分是咖啡碱和其他脂溶性物质；乙
酸乙酯萃取物主要含有黄酮醇类成分、儿茶素、以
及茶黄素类物质；正丁醇属于亲水性有机溶剂，主
要用于萃取水溶性成分，包括糖苷类、水溶性色素
等（表 1）。各个萃取物的提取率依次为二氯甲烷（B）
>茶褐素（F）>无水乙醇（A）>水相部位（E）>正
丁醇（D）>乙酸乙酯（C）。



A.无水乙醇萃取部位；B.二氯甲烷萃取部位；C.乙酸乙
酯萃取部位；D.正丁醇萃取部位；E.水相部位；F.茶褐素。
下同
A.fractions of EtOH extracts; B.fractions of dichloro-
methane extracts; C.fractions of ethyl acetate extracts; D. frac-
tions of n-butyl alcohol extracts; E.fractions of aqueous phase;
F.theabrownin. The same below
图 1 各个部位成分的提取率
Figure 1 The extraction rate of each part

表 1 各个萃取部位中主要化合物的含量
Table 1 The contents of major compounds in individual
extract part %
A B C D E F
GA 21.13 0.35 1.93 0.74 2.22 1.77
可可碱
Theobromine
12.11 10.15 16.41 6.50 31.41 31.76
EC 21.07 30.72 10.38 1.09 8.52 0.00
CAF 0.01 7.23 1.13 1.15 1.17 0.85
GC 0.00 0.00 1.69 0.00 0.78 0.00
ECG 0.06 0.00 0.14 0.00 0.00 0.00

2.2 各个萃取物与茶褐素主要成分的 LC-MSn 分
析结果
利用 LC-MS n 对各种萃取物进行成分分析，结
果如表 2 和图 2 所示。LC-MS n 分析发现无水乙醇
中主要化学成分为没食子酸、羟基-甲氧基取代苯丙
酸、表儿茶素等，属于酚酸类化合物。与其他萃取
物相比，LC-MS n 分析发现了茶褐素中特有的质谱
信号。离子碎片峰也能够提供重要的信息。可以通
过这些离子碎片信号对一些缺少标准物质对照的色
谱峰进行推导。例如，在 7.80~8.96 min 的时间段内
检测到[M-H]- m/z 416.13，通过分析发现此化合物的
分子量 MW 为 417，经过与已报到文献相比，其分
子量 MW 与 PuerinesⅤ-Ⅷ的分子量相同。LC-MSn
对[M-H]- m/z 416.13 进行碰撞诱导解离（CID），二
级碎片离子 m/z 372.21，354.19，330.20，271.10，
219.06，这些碎片离子与 PuerinesⅤ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ的
碎片离子相同 [6]，进一步验证了茶褐素部位中
PuerinesⅤ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ的存在。


图 2 各个萃取部位化学成分的 LC-MS 的 TIC
Figure 2 The total ion chromatography of LC-MS of each
extract part

我们发现茶褐素部位的物质是由槲皮素，山奈
酚还有大量的糖构成的。在此过程中茶褐素部位的
物质是可以结合 1 到 4 个不同糖苷元，形成一系列
以槲皮素和山奈酚为母核的黄酮氧苷的化合物。
Peak 11 准分子离子峰为[M-H]- m/z 463.08，其
分子量为 464。以[M-H]- m/z 463.08 为母离子，通过
CID获得其二级碎片离子m/z 301.03（-146/鼠李糖）。
推断其标志性离子 m/z 301.14 为槲皮素的准分子离
子峰。可以推导 Peak 11 化合物含有槲皮素母核，1×
鼠李糖基团。
Peak 14 准分子离子峰为[M-H]- m/z 739.16，其
分子量为 740，以[M-H]- m/z 739.16 为母离子，通
过 CID 获得其二级碎片离子 593.16（-146/鼠李糖），
m/z 447.32（-146/鼠李糖），m/z 284.95（葡萄糖-H2O）
推断其标志性离子 m/z 284.95 为山奈酚的准分子离
子峰。可以推导 Peak 14 化合物含有山奈酚母核，2×
鼠李糖基团和 1 葡萄糖缩水基团。
Peak 16 准分子离子峰为[M-H]- m/z 609.14，其
分子量为 610。以[M-H]- m/z 609.14 为母离子，通过
CID 获得其二级碎片离子 m/z 463.0（-146/鼠李糖），
4 安 徽 农 业 大 学 学 报 2016 年

表 2 普洱茶各组分中主要化学成分的 LC-MS 结果
Table 2 The identification of compounds from individual extract part of ripened pu-erh tea
编号
No.
保留时间/min
Rt Negative m/z
分子量
MW MS
n
1 0.96 390.90[2M-H], 194.95[M-H] 196 176.93, 158.81
2 1.42 237.0[M+CH3CHCHCOOH-H ], 339.03[2M-H], 169.01[M-H] 170 124.90
3 7.06 579.15 [2M-H], 289.07 [M-H] 458 248.96, 180,97, 146.96, 129.97, 112.98
4 8.60 883.17[2M-H], 441.08[M-H] 442 331.11, 289.03, 271.04, 168.93
5 10.67 723.50[M+HCOOH-H], 713.47[M+2H2O-H] 678 677.44, 451.36,225.10
6 11.53 603.07[2M-H], 301.06 [M-H] 302 179.02, 150.97
7 11.46 949.06[M-H] 950 903.58, 677.49, 451.6
8 12.31 421.18 [M-H] 422 375.18, 301.21, 227.04
9 3.24 611.14[2M-H], 304.99[M-H] 306 221.12, 178.98, 168.97
10 4.24 579.15[2M-H], 335.07[M+HCOOH-H], 289.07[M-H] 290 288.96
11 9.01 463.08[M-H] 464 301.03
12 9.73 447.09[M-H] 448 284.01
13 11.57 603.07[2M-H], 301.06 [M-H] 302 179.02, 150.97
14 12.60 739.16[M-H] 740 593.16,447.32, 284.95
15 8.16 631.06[M+CH3CHCHCOOH-H],563.14[M-H] 564 473.07,443.17, 353.13,383.09
16 8.87 609.14[M-H] 610 463.00, 301.08
17 9.40 593.15[M-H] 594 549.13, 447.13, 285.01
18 11.23 901.23[M-H] 902 755.23, 609.20, 301.14
T1 0.95 191.05[M-H] 192 126.95,84.82
T2 7.80 416.13[M-H] 417 372.21,
T3 8.32 400.14[M-H] 401 356.17
T4 8.58 400.14[M-H] 401 356.17
T5 8.96 400.14[M-H] 401 356.17
T6 9.69 447.09 [M-H] 448 323.04,301.03,284.05,255.03
T7 12.38 571.08[2M-H], 285.04[M-H] 286 419.10, 284.98
T8 12.56 327.21 [M-H] 328 309.19, 291.19, 229.13, 221.01, 171.00

A B C D E F Identification 鉴定
1 1 1 1 Hydroxy-methoxy-phenylpropionic acid
2 2 2 2 2 Gallic acid
3 3 3 EC
4 4 ECG
5 5 5 5 5 5 Unknown
6 Quercetin
7 7 Unknown
8 Unknown
9 EGC
10 10 C
11 Quercetin-glucopyranoside
12 Quercetin-rhamnoside
13 Quercetin
14 Kaempferol-rhamnopyranosyl-glucopyranosyl- glucopyranoside
15
16 Quercetin-rhamnopyranosyl-glucopyranoside
17 Kaempferol-rhamnopyranosyl-glucopyranoside
18 Quercetin- rhamnopyranosyl-rhamnopyranosyl-rhamnopyranosyl-glucopyranoside
T1 Phenolic acid
T2 puerinsⅤ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ
T3 puerinsⅠ、Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ
T4 puerinsⅠ、Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ
T5 puerinsⅠ、Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ
T6 Quercetin-rhamnopyranoside
7 Kaempferol
T8 Kaempferol-rhamnopyranosyl-glucopyranosyl-glucopyranoside
43 卷 6 期 梁玉红等: HPLC-MSn对普洱茶各萃取组分与茶褐素中化学成分的分析 5




图 3 Peak18 的色谱峰的质谱裂解碎片解析
Figure 3 Elucidation of peak18 by mass fragments

m/z 301.14（鼠李糖+葡萄糖-H2O）推断其标志
性离子 m/z 301.14 为槲皮素的准分子离子峰。通过
对碎片离子的分析，可以推导 Peak 16 化合物含有
槲皮素母核，1×鼠李糖基团和 1 葡萄糖缩水基团。
Peak17 准分子离子峰为[M-H]- m/z 593.15，其
分子量为 594。以[M-H]- m/z 593.15 为母离子，通
过 CID 获得其二级碎片离子 m/z 447.13（-146/鼠李
糖），m/z 284.95（葡萄糖-H2O）推断其标志性离子
m/z 284.95 为山奈酚的准分子离子峰。可以推导
Peak 17 化合物含有山奈酚母核，1×鼠李糖基团和 1
葡萄糖缩水基团。
Peak18 准分子离子峰[M-H]- m/z 901.23，其分
子量为 902。以[M-H]- m/z 901.23 为母离子，通过
CID获得其二级碎片离子m/z 755.23（-146/鼠李糖），
m/z 609.2（-146/鼠李糖），m/z 301.14（鼠李糖+葡萄
糖-H2O）推断其标志性离子 m/z 301.14 为槲皮素的
准分子离子峰。通过对碎片离子的分析，可以推导
Peak 18 化合物含有槲皮素母核，3×鼠李糖基团和 1
葡萄糖缩水基团。其推导过程如图 3 所示。
2.3 茶褐素组分中普洱茶素的分离鉴定
普洱茶素：C21H23NO7；白色无定型粉末；ESI­MS
在正离子模式下给出的离子峰为[2M+ H ]+ m/z:
802.3，[M+ H ]+m/z:402.1 结合 1H-NMR 数据得出其
分子式C21H23NO7。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6 )：
δ 4.50 (1H , brs , H-2 )，3.81 (1H , dd , J= 7.5 , 13.0
Hz , H-3 ) ，2.41 (1H , dd , J =3.5 ,1.5 Hz , H-4 ) ，
2.70 (1H , dd , J = 3.5 ,16.4 Hz , H­4 )，6.74 (1H , s ,
H­6 ) ，6.65 (1H , d , J=2.0 Hz, H­2′ ) ，6.63 (1H ,
dd , J = 2.0 ,8.0 Hz , H­6′ )， 2.12 (2H , m , H­3″ ) ，
2.40 (2H , m , H-4″ ) ，5.15 (1H , s , H-5″ )，2.47 (2H ,
m ,H-6″ ) ，0.84 (3H , t , J =6.9 Hz , H-7″ ) ，将其参
考数据与文献[7]对比，确定其结构为 puerinsⅠ。
3 讨论
就普洱茶各萃取组分进行 HPLC 成分分析，发
现茶褐素部位的成分与其他各萃取组分区别很大，
茶褐素部位的化学成分比较复杂。茶褐素部位中存
在大量的糖的信号，我们想通过一定的方法除去里
面的糖，以便发现其中一些潜在的含量低、但结构
新颖的化学成分。其中普洱茶素就是其中之一。茶
褐素的分离难度大，也造成现在对茶褐素的研究深
度较浅，希望通过分析对比可以对茶褐素做进一步
的研究。
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pounds of Chinese dark teas formed in the post- fermenta-
tion process provide significant antioxidative activity[J].
Food Chem, 2014, 152: 539-545.