全 文 ：第 21卷　第 3期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vo l. 21　No.3
2006年　6月 　　　　　　　　　　 Journa l o fYunnanA griculturalUniversity　　　　　 Jun. 2006
　收稿日期:2005 - 09 - 14　
*基金项目:云南省自然科学基金重点项目资助(2003C0007Z)　　　　**通讯作者
　作者简介:周杨(1980 -), 男 ,湖南长沙人 , 在读研士研究生 ,主要从事食品生物技术研究。
不同年代云南普洱茶 DNA提取分离方法初探*
周　杨 1 ,龚加顺1** ,和志娇 2 ,和根强3
(1. 云南农业大学食品科学技术学院 , 云南 昆明 650201;
2.云南农业大学 ,云南省植物病理重点实验室 , 云南 昆明 650201;
3.云南省潞西市农业局经济作物推广站 ,云南 潞西 678400)
摘要:以不同年代(贮藏时间)的云南普洱茶为原料 , 通过改进的 CTAB方法来提取分离云南普洱茶总 DNA, 试
验表明 , 所采用的经改进的 CTAB DNA微量提取法 ,可以得到高质量的云南普洱茶 DNA。建立了适合云南普洱
茶 DNA的提取方法 ,为进一步研究云南普洱茶贮藏年代的遗传图谱奠定了基础。
关键词:云南普洱茶;CTAB DNA提取法;DNA
中图分类号:S 571. 1. 032　　文献标识码:A　　文章编号:1004 -390X(2006)03 -0396 - 03
Study on Extraction and Separation of
DNA s of Yunnan Pu-erh Tea in D ifferentYears
ZHOU Yang
1 , GONG Jia-shun1 , HE Zh i-jiao2 , HE Gen-q iang3
(1. Facu lty of Food Science and Techno logy, Yunnan Ag ricu ltu ra lUniversity, Kunm ing 650201, China;
2. Key Labo ra to ry for P lant Patho logy o f Yunnan P rov ince, Yunnan Ag ricu ltu ra lUniversity, Kunm ing 650201, China;
3. S ta tion for Popularizing Econom ic C rops, Agricultura l Bureau of Lux i, Luxi 678400, China)
Abstract:To ta lDNA from Yunnan pu-e rh tea in d iffe rent yea rs is ex tracted and separated through im-
p roved CTAB me thod. Resu lts indicate tha t the h igh qua lity DNA from Yunnan pu-erh tea can be ob-
tained w ith the new method and this builds a foundation of fu rther research o f geneticmap aboutYun-
nan pu-e rh tea years.
Key words:Yunnan pu-erh tea;CTAB DNA method;DNA
　　云南是茶树 [Camellia sinensis (L. )O. Kuntze]
的原产地中心 ,茶树种质资源的数量和质量在世界
上占有绝对优势 [ 1] 。云南茶叶中以普洱茶最为有
名 。 “普洱茶”一词因茶叶集中在普洱境内加工 、
集散贸易而得名 。它是以云南大叶种制成的优质
晒青毛茶为原料 ,经渥堆后发酵和陈化工序而制
得 ,形成了普洱茶干茶色泽褐红 、条索肥壮重实 、耐
贮耐泡 ,茶汤红浓明亮 、陈香显著 、滋味浓醇回甘 ,
叶底褐红柔软的品质特点[ 2] 。一直以来普洱茶有
越陈越好的说法 ,在流通领域 ,越陈的普洱茶市场
价格也越高 [ 3] 。因此普洱茶的贮藏年代成了市场
炒作的热点 ,许多商人以新茶代替陈茶 ,谋取暴利 ,
使普洱茶市场出现价格混乱 。如何制定普洱茶质
量标准和建立有效的品质 、年代鉴定方法 ,帮助消
费者正确认识普洱茶 ,规范普洱茶市场是一些急待
解决的问题 ,也是广大茶叶科学工作者的一个努力
方向 。
近年来 , 随着分子生物学的发展 , 遗传物质
DNA的检测由于简便 、快捷 、灵敏 ,不受环境条件
的影响等特点广泛用于茶树的遗传研究领域 。但
大多数是以茶树的新鲜嫩叶为材料探讨茶树品种
资源的遗传多样性方面的研究 ,至今未见以云南普
DOI牶牨牥牣牨牰牪牨牨牤j牣issn牣牨牥牥牬牠牫牴牥x牗n牘牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牪牳
洱茶为原料 ,特别是以不同贮藏时间的成品普洱茶
为原料 ,对其遗传物质变化及贮藏时间关系的研究
报道。为了探讨云南普洱茶 DNA遗传物质与贮藏
年代的关系 ,本试验研究了不同年代 (贮藏时间)
的云南普洱茶遗传物质 DNA的提取方法。
1　材料与方法
1. 1　材料
云南普洱茶八级 (1984年 )、云南普洱茶晒青
一级(1989年 )、云南普洱茶晒青十级 (1989年 )、
云南普洱茶 79072 、云南普洱茶 (新工艺 , 2001
年 )、云南普洱茶新茶 (2004年 )、云南普洱茶新茶
(2004年 06月 19日 )、云南普洱茶四翻样 (发酵
40 d后的第 4次取样 , 2004)等 8个样品 。所用试
剂均为分析纯。
1. 2　方法
1. 2. 1　总 DNA提取
总 DNA提取方法主要参照 AHRENS等的方
法 [ 4] ,并加以改进 , 改进后的 CTAB法具体步骤如
下:
(1)样品处理:成年茶叶打磨成粉 ,烘箱 45℃
烘干至衡重;
(2)取经干燥后的茶样粉末各 0. 3 g,放入预
先经过冷处理的研钵中 ,用液氮冷冻后充分研磨;
(3)将细粉末转移到 1.5mL的 Eppendo rf管
中 ,加入 0.6mL预热到 60℃的 CTAB DNA提取缓
冲液 (2%CTAB , 1.4 mo l /L N aC l, 20 mmo l /L ED-
TA , 100mmo l /L Tris-HC l pH 8.0, 0.2%α-巯基乙
醇 , 2%PVP),在 60℃水浴中保温提取 30m in;
(4)从水浴中取出离心管 , 加入等体积
氯仿∶异戊醇 (24∶1),抽提 30m in;
(5) 12 000 r /m in离心 8m in,取上清液转移至
另一新离心管中 ,重复 (3), (4)步直至蛋白质除
尽;
(6)加入等体积氯仿∶异戊醇 (24∶1),抽提 30
m in;12 000 r /m in离心 8 m in,取上清液 (重复 1
次 );
(7)每管中加入 2倍体积预冷的无水乙醇
(100%)和 1 /10体积的 3 mo l /L醋酸钠 ,混匀 , -
20℃保持至少 30m in,使核酸沉淀 , 14 000 r /m in离
心 10m in,弃上清液;
(8)沉淀经 2次 70%乙醇洗涤 ,真空干燥;
(9)沉淀溶解于 100 μL灭菌双蒸水中或 100
μL TE缓冲液中 (10 mmo l /L T ris-HC l pH 8.0;1
mmol /L EDTA pH 8.0);
1. 2. 2　琼脂糖凝胶电泳
取 1μL DNA经 0.7%琼脂糖凝胶电泳 ,恒压
120V , 电流 75 A ,电泳时间为 1 h。 EB 染色 20
m in,观察电泳结果 ,计算 DNA浓度。
2　结果与分析
由于与其它作物基因组 DNA相比 ,茶叶中多
酚类物质含量比较丰富 ,加上蛋白质等会对 DNA
提取质量有影响 。采用一般植物 DNA CTAB法提
取效果不是很好 ,条带不清晰 ,如图 1所示。
采用改进的 CTAB法 ,提取过程中重复改进的
CTAB法中的步骤 (3)和 (4),提取到云南普洱茶基
因组 DNA ,如图 2所示。结果表明 ,用一般的提取
植物 DNA的 CTAB法提取效果不是很好 ,得到很
少量的 DNA ,且条带不清晰。而采用改进的 CTAB
法来提取不同年代 (贮藏时间 )的云南普洱茶
DNA ,可得到高相对分子量的云南普洱茶 DNA , 电
泳检查得到精确性高 、重复性好的迁移带型 。 1μL
粗提物含有 30 ng云南普洱茶 DNA ,其中样品 6号
为 15 ng, 条带相对不够亮 。这符合进行遗传分析
时 ,对 DNA纯度的要求可以低一些 ,而其它要求如
DNA的产量则显得更为重要的要求 。通过改进方
法提取得到的 DNA完全可以满足进一步的随机扩
397第 3期　　　　　　　周　杨 ,等:不同年代云南普洱茶 DNA提取分离方法初探
增多态性分析试验要求。本试验用的 DNA提取方
法具有以下特点:(1)取样简单 、用量少;(2)适合
大批量普洱茶样 DNA的快速提取;(3)与一般的
提取植物 DNA的 CTAB法相比 ,提取缓冲液中加
了 0.2%α-巯基乙醇 ,并在抽提过程中重复改进
的 CTAB法中的步骤 (3)和 (4),能有效的降低
DNA粗提物中的蛋白质 、多糖 、单宁和色素等
杂质。
3　讨论
本试验所选用的普洱茶原料有时间上的跨度 ,
如云南普洱茶八级(1984年)、云南普洱茶新茶
(2004年),有经发酵过的茶和没有经过发酵的茶 ,
如未发酵的云南普洱茶晒青一级 (1989年)、云南
普洱茶晒青十级 (1989年 ),也有加工工艺不同的
茶 ,如云南普洱茶 (新工艺 , 2001年),但从图 2可
以看出普洱茶样品基因组 DNA之间差异性不显
著 ,也没有呈现出 DNA降解的梯度条带 ,因此 ,用
普洱茶总 DNA电泳检测来判断普洱茶贮藏年代是
不可行的 ,难用于市场陈年普洱茶年代的鉴别 。但
能否通过进一步的 RAPD技术对相同品种 、不同年
代的云南普洱茶基因组多态性进行研究 ,深入探讨
遗传物质变化与贮藏年代的关系值得研究 。本研
究采用的改进的 CTAB法 ,可为今后进一步研究
RAPD技术应用于云南普洱茶 DNA遗传物质与贮
藏年代关系研究提供了基础。
[参考文献 ]
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398 云南农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　第 21卷