全 文 ：紫罗兰与桂竹香原生质体培养及电激细胞融合的研究
黄家总1 , 冈田芳明2 , 傅家瑞3
(1.广东农垦科技中心 , 广东 广州 510640;
2.奈良县田原本高等农业学校 , 日本 , 奈良;
3.中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275)
摘　要:采用电激细胞融合的方法 , 对紫罗兰 Matthiola incana R.Br 与桂竹香 Cheiranthus cheiri L.原生质体培养
及电激细胞融合效率导入最适条件作了探讨。紫罗兰的子叶原生质体分裂初期培养最适条件:培养基为 1 2MS。
培养基组成中 , 蔗糖质量分数为 4%、 甘露糖醇浓度为 0.6 mol L。加入谷酰胺酶无机态氮源时 , 效果明显。 次
之 , 加入植物生长调节物质 1 mg L BA也达到高分裂率。再者 , 添加玉米素时效果也甚好。根据原生质分离前的
子叶在 5 ℃预处理分裂率最高 , 培养温度 24 ～ 30 ℃为宜。电激细胞融合 (singlepairs)产生效率高的条件为:紫
罗兰原生质体密度 1×10个 mL , 高周波电强度 1 MHz , 150 V cm , 脉冲幅 70 μs;桂竹香原生质体密度 1×10 个
mL高周波电强度 1 MHz , 100 V cm , 脉冲幅 30 μs。
关键词:紫罗兰 Matthiola incana R.Br;桂竹香;原生质体;电激;细胞融合
中图分类号:Q945　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2003)03-0064-05
　　紫罗兰 Matthiola incana R.Br 原产地中海 。属
于十字花科植物 , 是当今世界花卉消售量中较大切
花品种之一。但其花色单调 , 仅有白色 、浅黄色 ,
青紫色 , 红紫色系品种。目前价值高 , 需求量大的
是紫罗兰深黄色的切花品种。为了培育深黄色的紫
罗兰切花新品种 , 日本等国作了大量的研究工作 ,
尚未见取得成功的报道。
桂竹香 Cheiranthus cheiri L.与紫罗兰同科 , 不
同属。原产地中海。桂竹香花色为深黄色 、橙色 。
但花茎短作为切花不如紫罗兰 。把桂竹香的深黄色
花的遗传基因导入紫罗兰 , 培育出新花色的属间新
品种为本研究目的。
1　材料和方法
1.1　材　料
紫罗兰与桂竹香种子由日本 TAKII种子公司提
供。用 φ=1%次亚盐酸钠 20 min对紫罗兰种子进
行消毒。然后用灭菌水连续 3次洗净 , 采用 1 2 MS
基本培养基 , 加入 20 g L 蔗糖 、 100 mg L 肌醇 、
500 mg L Kazamino acid 、 pH 5.5 , 在无菌条件下播
种。经 3 ～ 4 d后发芽 , 7 ～ 15 d子叶完全展开时作
为供试材料。
1.2　原生质体的分离及精制步骤
将子叶细切至1 mm大小 , 放入0.6 mol L 甘露
糖醇溶液里 , 用体积分数为 0.1% cellulase RS 、
0.1% Macerozyme R_10 、 0.01% Pectolyse Y23 及
0.5%dextran KHSO4 溶解后酶液里浸泡 , 在 24 ℃
暗室静置16 ～ 17 h后分离处理 。接着用 40μm 尼龙
筛过滤 , 过滤后从 50%与 20%溶液层的上层中取
样 100 g , 离心处理 6 min , 把形成含有原生质体层
取出 , 置入含有 0.6 mol L甘露糖醇的 1 2 MS培养
基 , 再进一步取样 100 g 进行离心处理 2 min后洗
净 。原生质体培养基采用 1 2 MS +20 g L 蔗糖+
100mg L肌醇+500 mg L Kazamino+0.6 mol L man-
nitol+1.0 mg L BA或 BM 培养基+NAA 1.0 mg L。
1.3　培养条件的控制
采用直径 3 cm 的培养皿。培养密度为 5×104
个 mL。在 24 ℃暗室并荧光灯下3 000 lux 培养 。从
培养后第1周对原生质体分裂状况进行调查 , 每处
理抽样 2个培养皿 , 每个培养皿最少具有 250个原
生质体以上 , 分裂率=分裂原生质体 原生质体总
数×100%。
从 BM 培养基中除去 NH4NO3 分别加入蔗糖 、
甘露糖醇 、 谷酰胺酶以及植物生长调节物质等培养
观察。
收稿日期:2002-06-16
基金项目:广东省自然科学基金资助项目 (980737)
作者简介:黄家总 (1956年生), 男 , 副研究员;E_mail:hjzong@163.net
　第 42 卷　第 3 期
2003年　5 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vol.42　No.3
May　2003 　
1.4　紫罗兰与桂竹香的电激细胞融合法
采用紫罗兰Little Zemu white 与桂竹香 Alldouble
种子 。在无菌播种后 10 d 幼苗叶原生质体分离 ,
取出含有原生质体部分 , 用 2.5 mmol L CaCl2 , 0.6
mol L甘露糖醇 (桂竹香 0.7 mol L)溶液混合 , 取
100 g 离心处理 2 min后洗净 , 作为融合时所用溶
液。采用细胞电激融合装置 (岛津 SSH_1), 及
SHAPP SSH_CO2 (容积 0.4 mL 、 电极间隔 1 mm)。
本实验进行对原生质体融合的影响主要物理条件作
探讨 。
2　结果和分析
2.1　紫罗兰的子叶原生质体的初期培养
2.1.1　蔗糖质量分数的影响　蔗糖质量分数为 0 、
1%、 2%与 4%的培养基中的结果见图 1 。w=4%
蔗糖原生质体分裂率最高 , 达 25.1%。蔗糖的质
量分数低 , 分裂率也低。
图 1　蔗糖浓度紫罗兰原生质体分裂的影响
Fig.1　Effects of sucrose on protoplast separation of stock
2.1.2　预处理与培养基的 NH4NO3 及培养温度的
影响　结果见图 2。首先 , 培养基中添加 1 2浓度
NH4NO3区比无添加分裂率高 , 从预处理看在 30 ℃
培养条件下无添加 NH4NO3 无预处理分裂率为 0。
预处理区分裂率为 10.3%。与其它区比较 , 预处
理比无处理分裂率高 2倍以上。从培养温度可见 ,
24 ℃的比 30 ℃的分裂率高 。用含有 1 2 浓度
NH4NO3培养基进行预处理 , 在 24 ℃条件下培养 ,
分裂率为最高 , 即 17.6%。
2.1.3　预处理温度与甘露糖醇浓度的影响　预处
理温度5 ℃、 25 ℃与甘露糖醇浓度 0.6 mol L 、 0.8
mol L 组合处理结果 , 见图 3 。甘露糖醇浓度 0.6
mol L比 0.8 mol L与 5 ℃比 25 ℃分裂率高约 2倍 。
分裂率最高 5 ℃处理 、甘露糖醇浓度 0.6 mol L 培
养基中培养 , 即达 22.9%。
2.1.4　预处理与添加谷酰胺酶及培养光照的影响
添加 30 mol L谷酰胺酶培养基的原生质体培养 1周
图 2　预处理与培养基的 NH4NO3 及培养温度
对紫罗兰原生质体分裂的影响
Fig.2　Effects of pre_treatment , medium NH4NO3 and
temperature separation on the protoplast separation of stock
图 3　预处理温度与甘露糖醇对
紫罗兰原生质体分裂的影响
Fig.3　Effects of pre_treatment temperature and
mannito concentration on stock protoplast separation
全部死亡。预处理与添加 10 mol L谷酰胺酶 , 无论
是暗室或明室分裂率都超过 20%。无预处理明室
条件下 , 添加谷酰胺酶比无添加的分裂率高。从光
照培养可见暗室与明室条件下没有明显差异 。用 5
℃预处理 , 添加 10 mol L谷酰胺酶 , 在暗室中培养
下 , 分裂率为最高 , 达 23.3%。
2.1.5　植物生长调节物质的影响　结果见表 1。添
加 1.0 mg L BA 比 5.0 mg L BA分裂率高。而添加
0.5 mg L 玉米素时 , 与 NAA 的浓度没有关系 , 其
分裂率基本一样 , 比 5.0 mg L BA 区分裂率高。最
高分裂率区 1.0mg L BA与 0.5 mg L NAA组合 , 达
29.7%。
表 1　BA 、玉米素与NAA对原生质体分裂的影响
Tab.1　Effects of BA , Zeatin and NAA on Protoplast separa
项目 ρ(NAA) (mg·L-1)
0 0.5 1.0
BA(1.0 mg L) 18.3 29.7 20.4
BA(5.0 mg L) 12.3 17.3 19.8
玉米素(0.5 mg L) 23.3 23.3 22.5
65　第 3 期 黄家总等:紫罗兰与桂竹香原生质体培养及电激细胞融合的研究
2.2　紫罗兰与桂竹香的电激细胞融合法
2.2.1　原生质体密度与高周波电强度对珍珠链
(pearlchain)状形成的影响　将紫罗兰的原生质体
密度分别调整为 5×104个 mL 与 1×105 个 mL。高
周波使原生质体排列叫 pearlchain , 2个原生质体并
在一起叫 Singlepair 。在原生质体密度相同的情况
下 , pearlchain 形成大致一样。但密度不同的情况
下 , 密度高的原生质体珍珠链状形成比率高 。密度
低的情况下 1个原生质体存在的比率占 60%左右 ,
密度高时 40%～ 50%, 同时 3 ～ 4个长珍珠链状形
成明显增加的倾向 (图略)。
根据桂竹香的原生质体密度调整为 1×105 个
mL 与 2×105 个 mL 的实验结果。桂竹香的子叶原
生质体比紫罗兰的小 , 所以采用密度高进行 , 其结
果与紫罗兰同样 。
本实验的目的 , 希望达到原生质体 1个与 1个
融合 , 形成 singlepair 比率高。紫罗兰原生质体密
度1×105 个 mL , 高周波电强度 1 MHz , 150 V cm 。
桂竹香原生质体密度 1×105 个 mL , 高周波电强度
1 MHz , 100 V cm的条件为最佳。
2.2.2　直流高电压脉冲时原生质体融合的影响　
结果见表 2 , 高压电脉冲条件下 , 对紫罗兰原生质
体融合与破损的影响 , 原生质体融合状况见图 4。
同样的脉冲电压情况下 , 脉冲幅越长原生质体的融
合 , 率越高但破损率也高 。脉冲电压 2.0 kV cm ,
脉冲幅70 μs条件下 , 原生质体破损率达 43.67%。
同样的脉幅 , 脉冲电压大些 , 融合率有高的倾向 ,
破损率也高 。2个原生质体融合率最高时 , 脉冲电
压 1.5 kV cm , 脉冲幅 70 μs 条件下 , 融合率为
3.46%。
表 2　直流脉冲与脉冲幅对紫罗兰
原生质体融合与破损的影响
Tab.2　Effects of VDC and PW on fusion and
destruction of stock protoplast 1×105个 mL
I
(kV·cm-1)
脉冲幅μs 多细胞融合率 %
2 细胞融
合率 %
非融合% 破损率%
30 0 0.34 84.29 15.36
10 50 0.10 0.50 81.00 18.39
70 0 1.15 73.75 25.10
30 0 1.78 67.76 30.46
15 50 0 2.68 62.13 35.19
70 1.18 3.46 65.64 30.71
30 0.39 2.33 61.26 36.02
20 50 0.19 2.89 55.52 41.67
70 0.10 2.33 53.90 43.67
　　桂竹香的原生质体融合状况见表 3。脉冲电压
图 4　紫罗兰原生质体的融合状况
Fig.4　The fusion condition of stock protoplast
与脉冲幅大时与紫罗兰的结果同样 , 即融合率与破
损率高 , 但比紫罗兰融合率高 , 3个以上融合比率
增加。
在脉电压2.0 kV cm , 脉冲幅70μs条件下 , 原
生质体破损率达 33.84%, 比紫罗兰低 10%。2个
原生质体融合率最佳条件为脉冲电压 2.0 kV cm ,
脉冲幅 30μs , 融合比率达 16.6%。
表 3　直流脉冲与脉冲幅对桂竹香
原生质体融合与破损的影响
Tab.3　Effects of VDC and PW on fusion and destruction
of wallflower protoplast 1×105 个 mL
I
(kV·cm -1)
脉冲幅μs 多细胞融合率 %
2细胞融
合率 %
非融合% 破损率%
30 2.06 9.35 74.21 14.21
10 50 2.16 11.96 68.43 17.45
70 2.87 13.38 64.44 19.31
30 1.63 9.80 57.35 31.22
15 50 2.23 10.00 55.67 32.19
70 1.87 10.40 48.23 39.50
30 3.23 16.16 55.15 25.45
20 50 3.47 12.37 54.40 29.40
70 1.72 12.73 54.40 33.81
3　讨　论
Hosoki等关于紫罗兰原生质体再分化的研究报
告中结论 , 从种子的愈伤组织分离出原生质体 , 改
变MS培养基中 (200 mg L NH4NO3)的大量元素 ,
Ringe.Nitsch的微量元素 , 改变维生素溶液 (0.5
mg L烟酸 , 0.4 mg L 维生素 B1), 添加 0.2 mg L、
2，4_D 1 mg L NAA 、 1 mg LBA 、 w =8.1%甘露糖
醇 、 1%葡萄糖及 1%蔗糖进行培养 , 分裂诱导 , 经
过细胞团及愈伤组织形成。9%～ 11%形成不定芽。
本实验中 , 蔗糖质量分数为 4%时 , 分裂率高 (图
1)。可见子叶原生质体的初期培养高质量分数的蔗
糖是必要的。根据西尾等[ 2] 的报告 , 紫罗兰与同科
羽衣甘蓝的叶肉原生质体的培养 , 采用 1 2 MS 培
66 中山大学学报 (自然科学版) 第 42 卷　
养基添加 NH4NO3 质量浓度为 0 、 100 、 200 、 400 、
800 、 1 600及 3 200 mg L 时 , 羽衣甘蓝叶肉原生质
体的培养添加NH4NO3 100 mg L或 200 mg L的分裂
率最高。紫罗兰原生质体培养 , 添加 NH4NO3 400
mg L 时比无添加分裂率高 (图 2)。培养基中氮源
可从 KNO 、 NHNO 及其之各种氨基酸考虑。根据
Kamada等[ 3] 研究报告 , 在诱导红萝卜的愈伤组织
不定芽时 , 在未含有无机态氮源MS 培养基中改变
基酸氮源 , 添加谷酰胺酶(0.1 、0.5 、1 、5 、10 、20及30
mg L),效果明显 。Weatherhead等[ 4] 在马铃薯的花粉
培养时 , 采用含有谷酰胺酶或天安冬酰胺的培养
基 , 形成不定芽 。本实验在无添加谷酰胺酶的 BM
培养基与未含有无机态氮 BM 培养基中添加 10 及
30 mol L 谷酰胺酶比较结果。添加 10 mol L 谷酰胺
酶的培养基分裂率最高。作者认为 , 还有其它几种
氨基酸 (谷酰胺酶酸 、 天门冬酰胺 、 天门冬酰胺
酸 、丙氨酸等), 对原生质体分裂也有一定的作用
效果 。
关于预处理结果 , 根据Arai等[ 5]采用香石竹叶
肉原生质体培养研究报告 。叶片或植物体自体的 5
℃左右低温处理及用水或 ABA 溶液浸渍预处理 ,
能促使细胞团形成。所以 , 原生质体的分裂活性的
原因 , 被认为预处理发生膜蛋白的变化 。Mokapatra
等[ 6] 在苜宿的实生在低温及 ABA溶液处理 , 进行 2
次元电泳研究结果。预处理的各个凝胶体与无处理
的实生膜蛋白的的差异发生突变现象 , 低温或
ABA处理 , 形成新的多肽酶链。本实验采用水浸
渍的方法进行预处理 , 结果增强子叶自体的硬度 ,
容易切割 。培养时获得非常高的分裂率 。又进一步
低温5 ℃预处理比 25 ℃处理结果更加明显 (图 3)。
植物生长调节剂物质对原生质体的分裂有明显
作用 。西尾等[ 7]采用含有NAA与 BA的培养基对椰
菜原生质体培养的结果 。含有 5 mg L NAA 与 0.2
mg L 或 0.5 mg L BA 的培养基分裂率高 。添加 0.2
mg L NAA 时 , 与 BA 浓度没有关系 , 未见分裂现
象。这说明原生质体分裂率与 NAA浓度变化相关 ,
而BA 浓度影响小。本实验的紫罗兰情况来看 ,
NAA的影响也比 BA大 (表1)。添加0.5mg L NAA
与1 mg LBA分裂率高。
细胞融合育出细胞杂种的技术是常用交配受精
不可能组合获得杂种 。一般采用长田[ 8] 聚乙烯醇
(PEG)处理方法 , 高 pH Ca 法。另有电激融合法 ,
Zimmermann
[ 9] 曾作过论述。这种方法操作容易 , 短
时间内可能达到大量融合 , 没有毒性 , 与 PEG 比
较有很多所长的优点 。
电激融合法分两阶段操作 。首先 , 采用高周波
电强度 (一般 0.5 ～ 1.5 MHz , 100 ～ 300 V cm 的范
围), 原生质体珍珠链状形成后再用高电压脉冲作
用融合。三浦等[ 10] 研究发现 , 烟草叶肉原生质体
采用固定的电强度 100 V cm , 用波数 0.25 、 0.5 、
1 , 2 MHz 的改变 , 用 0.25 MHz 时原生质体不泳
动 , 0.5 MHz时边转动边泳动。1及 2 MHz时不转
动会泳动 , 并形成良好的珍珠链状。本实验采用周
波数1 MHz固定进行。
根据山口等[ 11] 香石竹与翟麦融合结果 , 原生
质体的悬浊液中对珍珠链状形成影响的抵抗值进行
调查 , 采用 0.5 mol L 的甘露糖醇的悬溶液 , 1×
10
5个 mL、 1 900 Ψ, 2×105 个 mL 、 130 Ψ, 4×105
个 m、 1 200 Ψ, 珠链状形成良好。采用 0.5 mol L
的甘露糖醇+CPW盐液时 , 抵抗值 50 Ψ以下不发
生融合 。本实验原生质体悬溶液为 2.5 mol L 盐化
钙+0.6 mol L (0.7 mol L)甘露糖醇 , 紫罗兰原生
质体密度 5×104 及 1×105 个 mL , 桂竹香 1×105
及 2×105 个 mL 分别融合的结果 , 发现原生质体泳
动迅速 。紫罗兰在 150 V cm , 桂竹香 100 V cm 的
作用下 , 不管哪种密度原生质体配对融合率都最
高 。本实验对紫罗兰与桂竹香分别进行 , 实际上两
者的原生质体混合 , 电强度低的条件下 , 作者认为
原生质体受损伤很小 , 为下一步两者原生质体融合
摸索出成功条件。
珍珠链 (pearlchain)形成后融合频率取决于高
电压脉冲的电强度与脉冲幅 。根据西尾等[ 2] 椰菜与
小松菜原生质体的融合结果 , 2.35 kV cm , 30μs的
脉冲2次作用时融合率较高。形成愈伤组织 , 再分
化成不定芽。2.35 kV cm , 30 μs 的脉冲增加 3次
时 , 造成原生质体大量破坏 。本实验为了达到 2个
原生质体融合的目的。2个原生质体的融合率最佳
条件 , 紫罗兰 1.5 kV cm , 70 μs , 脉冲 1次;桂竹
香 2.0 kV cm , 30μs , 脉冲 1次。融合时膜破坏的
必要电压 , 一般与原生质体半径为反比例 。桂竹香
原生质体比紫罗兰的小 , 所以融合时考虑采用高电
压脉冲较紫罗兰所需的高。Bate[ 12] 根据 Nicotiana
属的原生质体融合情况 , 高电压脉冲的电强度 1.0
～ 20 kV cm 之间融合率无差异 , 高电压强度 2.0
kV cm原生质体3个以上融合率增高。达到目的的
2个的融合率下降。本实验发现 , 桂竹香 2.0 kV
cm时 , 2个原生质体及 3个以上的融合率均高 。从
这方面考虑 2种原生质体融合的最佳条件 , 采用低
电强度 , 即紫罗兰 1.5 kV cm的条件。本实验中桂
竹香比紫罗兰融合率低 , 作者认为原生质体分离时
受到各种因素的影响。所以注意分离技术的严格操
作 , 同时还可以提高紫罗兰的融合率 。
67　第 3 期 黄家总等:紫罗兰与桂竹香原生质体培养及电激细胞融合的研究
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Research into Stock and Wallflower Protoplast and Electrical Cell Fusion
HUANGJia_zong1 , OKADA Yoshiaki2 , FU Jia_rui 3
(1.Science and Technology Center of GuangDong Agriculture and Farm , Guangzhou 510507 , China;
2.Nara Tabaramoto High Agricultural School , Japan;
3.School of Life Sciences ,Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract:Through the electrical cell fusion of the stock and the wallflower , the optimum conditions of the early_period
cultivation of protoplast and the optimum conditions which lead effectively to cellular fusion.The results were as follows:
As a condition of early_period cultivation that increases the separation of seedling protoplast of the stock , by cultivation in
a basic culture medium that made up 1 2MS , a sucrose concentration of 4% and a mannitol concentration of 0.6%, it
was the most appropriate.In addition , when adding inorganic nitrogen to glutamine , it got an excellent result.And when
adding plant_growth regulators BA as 1 mg L it achieved a high rate of separation.Plus , the effects of the addition of
zeatin(maize factor)was good.Due to pre_treatment of seedlings prior to protoplast separation , the rate of separation
achieved was high.The suitable temperature ranged from 24 ℃ to 30 ℃.The conditions which gave rise to a high
proportion of single pairs through the medium of electrical cell fusion were stock protoplast density of 1 ×105 , high
electrical field intensity of 1MHz , the pulse voltage in 1.5 kV cm and pulse width in 70 s;wallflower protoplast density
of 1×105 units mL , high electrical field intensity of 1 MHz , 100 V cm the pulse voltage in 2.0 kV cm and pulse width
in 30μs.
Key words:Matthiola incana R.Br;Cheiranthus cheiri L.;protoplast;electrical;cell fusion
68 中山大学学报 (自然科学版) 第 42 卷