全 文 ：2009 Vol.10 No.4
绵枣儿核核糖体 DNA ITS序列扩增的研究
尚彩玲 1，丁开宇 2
（1.山西中医学院，山西 太原 030024； 2.云南大学生命科学院，云南 昆明 650091）
摘要 采用通用引物扩增绵枣儿核核糖体 DNA ITS序列，未得到目的条带。根据引物设计原则自行设计 12个引物，其
中只有使用引物对 PA3、D（ITS3），PA4、D（ITS3），PA4 、DO2扩增得到绵枣儿核核糖体 DNA ITS序列。
关键词 核核糖体；ITS序列；引物设计
中图分类号：R318 文献标识码：A 文章编号：1671-0258（2009）04-0052-03
Study on Nuclear Ribosomal DNA ITS Amplification of
Scilla scilloides（Lindl.）Druce
Shang Cailing, Ding Kaiyu
（1.Shanxi College of TCM, Taiyuan Shanxi 030024;2. College of Life and Sciences, Yunnan University, Kunming Yunnan 650091）
Abstract Universal primers were used to amplify nuclear ribosomal DNA ITS of Scilla scilloides（Lindl.）Druce,but they did
not work.Then 12 primers were designed according to the principle of primer-design and were used .Nuclear ribosomal DNA
ITS of Scilla scilloides（Lindl.）Druce was obtained using primers PA3 and D（ITS3）, PA4 and D（ITS3）, PA4 and DO2.
Key words nuclear ribosomal；ITS；primer design
［基金项目］国家自然基金资助项目（30270095）
［作者简介］尚彩玲，女，硕士，从事植物系统进化方面的研究
［收稿日期］2009-03-27
绵枣儿［Scilla scilloides（Lindl.）Druce］属于风信
子科多年生鳞茎植物，主要有 AA、BB和 AABB三
个细胞型，为多倍体复合体，其在形态、染色体数目
和生长节律上都发生了很大的变异［1-4］。在清楚了解
该复合体细胞型地理分布的基础上，使用分子技术
探讨各细胞型的地理分布和进化发展已是必然趋
势。本文试用绵枣儿核核糖体 ITS序列来解决风信
子科绵枣儿属的系统发育问题，绵枣儿核核糖体
ITS（internal transcribed spacer）区位于 18S和 26S基
因之间，中部被 5.8S一分为二，即 ITS1区与 ITS2区。
实验过程中发现 ITS区测序所使用的通用引物不能获
得满意的结果，因此设计新的引物和实验程序成为课
题的关键。本文能进一步为风信子科绵枣儿属的系统
发育研究提供依据，也可为近缘类群发育研究提供参
考和借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料来源
实验所用材料为绵枣儿（Baranardia japonic）
的叶片、种子。外类群选择的是虎眼万年青（Or－
nithogalum sp.）、石蒜（Lycoris sp.）。结果见表 1。
1.2 总 DNA提取
基因组 DNA的具体提取方法参照 Clark CTAB
微量分离 DNA法［5］，从硅胶干燥的叶片或新鲜的叶
片和鳞茎中提取。总 DNA经 0.5%的琼脂糖凝胶电
泳检查后，进行 PCR反应。
1.3 引物设计及选择
ITS的扩增引物为 ITS4、ITS5、C（ITS2）和 D
（ITS3）［6］，其余引物 P1、P2、P3、C02、D02、P1 兰、P2 兰、
PA2、PA3、PA4、PA5、PA6为自己设计。引物及中间
引物 C02、D02是根据绵枣儿相近类群和真菌的 18S
及 26S序列比对后设计；根据兰科（Orchidacea）植物
样品名称 采样地点 细胞类型 体细胞染色体数 凭证标本
黄山 安徽省黄山 BB 18
南京 江苏省南京市紫金山中山陵附近 AA 16 14
深圳 广东省深圳市 AA 16
舟山 浙江市舟山天福寺 BB 18
元宝山 辽宁省丹东市元宝山 AABB 34
杭州 浙江省杭州市宝石山 BB 18
广昌 18 江西省广昌市赤水乡马鞍庄 BB 18
神农架 湖北省神农架林区阳日镇 AABB 34
大庆 黑龙江省大庆市太康县敖林锡伯乡 AA 16 2、3
灵岩山 江苏省苏州市灵岩山 BB 18
文县 四川省汶川县 AA 16
表 1 实验所用材料来源
现代生物医学
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2009年 第 10卷 第 4期
扩增所用引物与绵枣儿相近类群的序列比较，在
18S基因及 26S基因上分别设计出 P1 兰、P2 兰；PA2
是 ITS5的同源引物；根据天门冬目植物与真菌的
18S序列的比较设计了两个简并引物 PA3、PA4 及
其同源引物 PA5、PA6。各引物的序列及在基因上的
位置如表 2和图 1所示。
1.4 PCR扩增
①首先选择通用引物扩增 ITS5、ITS4、C（ITS2）、
D（ITS3），扩增的程序是：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55
℃ 30 s，72 ℃ 1 min（35个循环）；72 ℃ 10 min。②选
择自制引物 P1、P2、P3与通用引物 D02、ITS4，扩增
的程序是：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，（52±10）℃ 30 s，
72 ℃ 1 min（35个循环）；72 ℃ 10 min。③选择自制
引物 P1 兰、P2 兰，退火温度 52 ℃。④选择引物 PA2、
ITS4，退火温度 52 ℃。⑤选择简并引物 PA3、PA4与
ITS4、D、D02搭配，退火温度 52 ℃。
1.5 产物纯化
PCR产物用 1％的琼脂糖凝胶在 TAE中电泳检
测，扩增产物用凝胶回收的方法回收。
1.6 PCR产物连接、转化和克隆
DNA 回收产物用 T4 DNA 连接酶连接，所用载
体是 DH5α。连接反应总体积为 10 μL，4 ℃下连接
过夜。转化后涂平板，挑选阳性单克隆摇菌。
1.7 序列测定
实验中用于测序的样品有胶回收产物、菌液、质
粒。序列测定在 AB377全自动测序仪上进行，这一
步由申能博彩生物有限公司和上海英骏生物有限公
司代为完成。
2 分析与讨论
用通用引物 ITS5、ITS4扩增，胶回收目的条带测
序，其结果是乱峰。后将 PCR产物连接、转化和克隆
后，选择一个单克隆测序，在 Genebank中比对后发现
为真菌的基因。再用引物对 C（ITS2）、ITS4与 ITS5、D
（ITS3）搭配扩增 ITS1与 ITS2，结果仍为乱峰。表明
通用引物对于绵枣儿这一特殊的类群不适用。
我们尝试了重新设计引物。首先，根据与相近类
群和真菌的 18S 及 26S 序列的比对，设计了引物
P1、P2、P3和中间引物 C02、D02。但扩增的效果太
差，无条带或是无目的条带。
接着根据兰科（Orchidacea）植物扩增所使用的
引物与绵枣儿相近类群的 18S及 26S基因比较设计
出一对同源引物 P1 兰、P2 兰，使用后黄山、南京、深
圳、舟山、元宝山绵枣儿的目的条带测序结果为两
种，即 600 bp与 200 bp左右序列。在 Genebenk中
比对后发现，600 bp 序列与 Phalaenopsis 属的植物
有 97% 相似，与 Calycanthus属的植物有 95%相似。
200 bp序列比对后调不出相似序列（即没有相似序
列的报道）。
引物对 P1 兰、ITS4搭配使用，得到杭州样品目
的条带，后进行分子克隆，送去 5个单菌落测序。结
果到 Genebank中比对，其中 3 个克隆与上述 200
bp左右序列是同源的，但相互之间存在变异。用
ITS5与 P2 兰搭配使用扩增的大庆样品，克隆后测
序，结果为真菌的序列。由此可以看出，引物 P1 兰、
P2 兰与通用引物搭配使用时，扩增底物非目的基因；
而直接用于扩增时，又调不出目的片断。但从中可以
得到一个重要信息，即通用引物在绵枣儿这个类群
的基因相应位置上有碱基变化（如图 2所示）。所以
一直以来，通用引物不能扩增出绵枣儿 ITS间隔区。
据此，实验做了两个改变：①设计了引物 PA2；
②在同等条件下重新提取了南京、深圳等样品及外
类群石蒜的总 DNA，用引物对 PA2、ITS4进行扩增，
得到目的条带。测序结果表明，南京和深圳样品仍为
真菌序列，而石蒜的序列与 Genebank 中石蒜科
注：PA3、PA4简并引物中 Y=T\C，W=T\A，R=G\A
引物名称 引物序列 碱基数
ITS5 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 22
ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 20
C 5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’ 20
D 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ 20
P1 5’-CATGCTCCGGTGAGGTGCTCG-3’ 21
P2 5’-TAGAATTCCCCGGTTCGCTTA-3’ 21
P3 5’-TCGCGAGAAGTCCACTCAAC-3’ 20
PA2 5’-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3’ 22
PA3 5’-GTCGCGAGAAGTYCAYWGAACC-3’ 22
PA4 5’-CCGRTGAAGTGTTCGGATCRC-3’ 21
PA5 5’-GTCGCGAGAAGTCCATTGAACC 22
PA6 5’-CCGGTGAAGTGTTCGGATCGC 21
P1 兰 5’-CCGATTGAATGGTCCCGRTGAAGTGTTCG-3’ 28
P2 兰 5’-CTATTCCCRGTTCGCTCGCCGTTWC-3’ 25
C02 5’-GTGAATTGCAGAATYCCGCG-3’ 20
D02 5’-CGCGGRATTCTGCAATTCAC-3’ 20
表 2 用于绵枣儿复合体扩增和测序的引物
图 1 用于扩增的引物在基因上的位置
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
A72 ……GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG……
· ·
· ·
图 2 绵枣儿类群在引物相应位置序列变异示意图
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神经副肿瘤综合征 （Paraneoplastic neurological
syndromes，PNS）在恶性肿瘤中发生率较低，占所有
肿瘤的比例不足 3%，多发于中老年，可影响神经系
统的任何部位［1］。对中老年人 PNS患者，应提高警
Cryptostephanus属植物的 ITS序列有 98% 相似，由
此可以肯定绵枣儿植物中有内生真菌的存在。
由此可见，实验成功的关键就体现在了设计引
物上。后来下载了所有天门冬目的序列和各类真菌
的序列（Genebank中），根据 18S序列的比对设计了
两个简并引物 PA3、PA4（由于天门冬目的 26S的序
列太少，所以没有设计 26S序列上的引物）。把引物
PA3、PA4与 ITS4、D、D02相互搭配使用并检测后，
选择用引物对 PA4、D扩增，得到神农架、广昌 18样
品的目的条带，测序结果表明是 ITS序列。
接下来为了排除污染，提取了绵枣儿种子的总
DNA。使用引物对 PA3、D，PA4、D，PA4 、D02扩增了
文县、灵岩山的绵枣儿，都得到目的条带。测序结果
比对后表明：用引物对 PA3、D和 PA4、D扩增的序
列为绵枣儿的 ITS序列。而用引物对 PA4、D02扩增
的条带，只有种子的序列为绵枣儿的基因，叶片的序
列是真菌基因。由此可以看出，种子中是没有内生真
菌的。故优选的实验材料是种子。
实际上，通用引物不能应用于本类群的主要原
因在于绵枣儿 18SrRNA 基因与互补引物 PA3’、5’
端存在两个碱基的差异，严重影响了反应过程中引
物与绵枣儿 18S基因的退火；且通用引物通用性极
强，会优先与真菌的 18S基因发生退火，因此应用于
本类群时只能扩增出真菌而不能扩增出绵枣儿的序
列。引物对 PA3、D，PA4、D不仅适用于绵枣儿 ITS
序列的 PCR扩增，估计能用于所有风信子科植物和
其他近缘类群 ITS序列的 PCR扩增。进一步研究拟
重新提取所有实验材料的核 DNA，并用新选择的引
物对进行扩增并测序，将能完成用核核糖体 ITS序
列来解决风信子科绵枣儿属的系统发育问题。
参考文献
［1］Sato D. Analysis of karyotypes in Scilla with special reference to the
origin of aneuploids［J］. Y Bot Mag，49（2）：289-305.
［2］Ding K Y，Ge S，Hong D Y. Cytotype variation and cytogeography of
Scilla sinensis（Louriro）Merrill（Hyacinthaceae）in China［J］. Hered－
itas，1998，129（2）：151-160.
［3］Ding K Y，Ge S，Yu Z H. Allozyme variation in the diploid（A genome）
populations of scilla scilloides （Hyacinthaceae）［J］. Plant Syst，
1999，218（2）：23-31.
［4］孙静贤. 绵枣儿（Scilla sinensis Merrill）多倍体复合体的分子进化
［D］. 云南大学硕士学位论文，2005.
［5］Clark M S. 植物分子生物学：实验手册［M］//顾红雅，瞿礼嘉主译.
北京：高等教育出版社，1998.
［6］White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequenc－
ing off ungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］//Innis M，
Gelfand D，Sinisky J，et al. PCR protocols：a guide to methods and
applications［M］. San Diego：Academic Press，1990：315-322.
以神经系统损害起病的副肿瘤综合征 60例回顾性分析
秦惠萍
（山西中医学院附属医院神经内科，山西 太原 030024）
摘要 目的：分析神经副肿瘤综合征（PNS）的临床症状特点，为早期诊断提供参考。方法：采用头颅 CT扫描、MRI以及
其他辅助检查确诊。结果：50例 PNS患者神经损害发生于肿瘤确诊之前，10例发生于肿瘤确诊之后。临床类型为脊髓损
害 10例、视神经脊髓炎 10例、亚急性联合变性 10例、脑卒中 20例、周围神经病 10例。结论：PNS临床表现形式多样，
自身免疫异常是其可能发病机制，中老年发病率高。早期诊断对及早发现潜在的恶性肿瘤，具有重要临床意义。
关键词 副肿瘤综合征；神经系统损害；PNS
中图分类号：R739.4 文献标识码：A 文章编号：1671-0258（2009）04-0054-02
［作者简介］秦惠萍，女，副主任医师，从事神经内科临床工作
［收稿日期］2009-04-01
现代生物医学
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