全 文 ：长寿花快繁及试管苗开花研究
罗 娅 ,汤浩茹 ,邓涛艳 ,郑春艳　(四川农业大学林学园艺学院 ,四川雅安 625014)
摘要　[目的 ]探讨长寿花试管苗培养及诱导开花的关键技术。 [方法]以长寿花带芽茎段为材料 ,研究HgCl2消毒时间、植物生长调节
剂配比对外植体污染率 、增殖效果及试管苗开花的影响。 [结果 ] HgCl2 消毒 8min效果最好 , 污染率为 20%,明显低于不消毒的
77.77%;培养基中 6-BA添加量为 2.8mg/L时 ,试管苗明显高于添加量为 1.0、1.5、2.1mg/L的处理 , IAA对丛芽增殖影响不明显 ,但添
加量过高抑制丛芽增殖。增殖培养基中植物生长激素的最佳组合为:0.30mg/LIAA +2.1mg/L6-BA+0.6mg/LGA3;NAA添加量为
2.0 ～ 4.5mg/L时 ,均能诱导花芽分化 ,诱导率为 5.5%～ 35.6%,单独使用 GA3不能诱导试管苗开花 ,但GA3 与NAA配合使用可使试
管苗提前 15d开花。 [结论]诱导长寿花试管苗增殖及开花的最佳培养基分别为 MS+0.30mg/LIAA +2.1 mg/L6-BA+0.6mg/L
GA3和 MS+2.5mg/LNAA。
关键词　长寿花;快繁;试管开花
中图分类号　S682.1+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)06-02389-02
StudyonRapidPropagationofKalanchoeblossfeldianaandFloweringofItsPlantlet
LUOYaetal　(ColegeofForestryandHorticulture, SichuanAgriculturalUniversity, Yaan, Sichuan625014)
Abstract　[ Objective] ThestudywastoexplorekeytechniquesonplantletculturingofKalanchoeblossfeldianaandinducingitflowering.
[ Method] UsestemwithbudsofK.blosfeldianaasthematerial, theefectsofdisinfectiontimebyHgCl2 , ratioofplantgrowthregulatoroncontaminationrate, propagationeffectandplantletfloweringwerestudied.[ Result] TheefectwasthebestwhendisinfectedbyHgCl2 for8
min, bywhichthecontaminationratewas20%, beingobviouslylowerthanthatoftreatmentwithoutHgCl2disinfection(77.77%).Whenad-ditionamountof6-BAwas2.8mg/Linthemedium, theheightofplantletwasobviouslyhigherthanthatofothertreatmentsinwhich6-BA
additionamountwere1.0, 1.5, 2.1mg/L.resp..TheefectofIAAonpropagationofclumpybudswasnotobvious, butithadinhibitionon
propagationofclumpybudswhenitsadditionwastoomore.Theoptimumhormonecombinationinmediumwas0.30mg/LIAA+2.1mg/L
6-BA+0.6 mg/LGA3.WhenadditionamountofNAAwas2.0-4.5mg/L, itcouldinduceflowerbudtodiferentiateandtheintroductionratewas5.5%-35.6%.WhenGA3 wasusedalone, itcouldnotinducefloweringofplantlet, butwhenGA3 wasusedcombiningwithNAA,
thefloweringtimeofplantletadvanced15 d.[ Conclusion] TheoptimummediaforinducingproliferationandfloweringofK.blosfeldiana
wereMS+0.30mg/LIAA+2.1 mg/L6-BA +0.6mg/LGA3 andMS+ 2.5mg/LNAAresp.Keywords　Kalanchoeblossfeldiana;Rapidpropagation;Tubeflowering
基金项目　四川省重点实验室专项(07ZZ023)。
作者简介　罗娅(1979-), 女 ,四川宜宾人 ,博士 ,讲师 , 从事果树生物
技术及抗寒生理研究。
收稿日期　 2008-11-26
　　长寿花(Kalanchoeblosfeldiana)又名圣诞伽蓝菜或寿星
花 ,为景天科伽蓝菜属多年生肉质草本植物 [ 1] 。因其花期
长 ,耐干旱 ,易栽培 ,装饰效果好 ,现已成为一种极具发展潜
力的 “新品种花卉 ”。长寿花普通繁殖方法为茎段及叶片扦
插 ,因受季节限制 ,其繁殖系数往往很低 ,利用离体繁殖可增
大繁殖系数 ,做到周年供应 [ 2] 。陈玉梁和支小刚 [ 3] 、张瑞姿
和郭晓霄 [ 4] 、冯林剑等 [ 5]曾先后对长寿花进行了组织培养研
究 ,但有关长寿花试管苗开花的研究尚未见报道。一般情况
下 ,植物必须达到某种成熟阶段才能开花 [ 6] ,多数研究表明 ,
植物离体成花规律与整体成花规律基本相似 ,试管组培苗因
具有成花率高 、重复性好 、技术稳定等优点而被大量用于成
花研究。笔者以长寿花带芽茎段为材料 ,探讨外植体培养体
系的建立 、外植体增殖及试管苗诱导开花等关键技术 ,以期
为长寿花成花研究和开花试管苗的商品化生产提供技术指导。
1　材料与方法
1.1　试验材料　供试材料为四川农业大学园艺系地栽高茎
型长寿花植株 。
1.2　试验方法
1.2.1　材料的消毒处理。剪取幼嫩的带芽茎段 ,用流水冲
洗 30 min以上 ,用 75%乙醇处理 10 s,在 0.1%HgCl2中分别
进行 0、7、8、9、10min消毒处理 ,再用无菌水冲洗 3次 ,用滤
纸吸干水分后接种于 MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L
的启动培养基中。 28 d后统计各个消毒处理的污染外植体
数 ,并计算污染率(污染外植体数 /接种外植体数)。
1.2.2　培养材料的增殖培养。在超净工作台上 ,取 1.0 cm
左右单节茎段分别接种于 MS+IAA(0.2、0.25、0.3、0.35
mg/L)+6-BA(1.0、1.5、2.1、2.8 mg/L)+GA3 0.6 mg/L共
16个处理的增殖培养基中(表 2),每处理接种 25个外植体 ,
重复 3次 ,培养 40d后统计增殖倍数(丛生芽数 /成活外植体
数)和有效苗高(≥0.5cm的丛生苗),筛选出最佳植物生长
调节剂的添加量 。
1.2.3　试管苗成花培养。将增殖后生长较好的苗切割下来
分别接种到 MS+GA3 1.0 mg/L, MS+NAA2.0 mg/L+GA3
1.0mg/L, MS+NAA(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/L)
共 9个处理的培养基中(表 3),每处理接种 25个外植体 ,重
复 3次 ,观察花芽生长状况 , 65 d后统计花芽诱导率(诱导出
花芽外植体数 /成活外植体数)。
1.3　培养基和培养条件　试验均用 MS为基本培养基 ,其中
附加蔗糖 30.0 g/L,琼脂粉 7.0g/L, pH值 5.8,培养温度(25
±1)℃,光强 2 500 lx,光周期 16 h/d。
1.4　数据统计　试验数据采用 DPSv3.01进行统计分析。
2　结果与分析
2.1　HgCl2不同消毒时间对外植体污染率的影响　由表 1
可知 ,不使用 HgCl2消毒时 ,长寿花外植体污染严重 ,污染率
高达 77.77%。随着 HgCl2处理时间的延长 ,污染率明显下
降 ,但外植体的成活率也逐渐降低 。外植体的污染主要是由
材料本身的内生菌引起的 ,因此结合污染率与成活率 2个指
标来看 , HgCl2处理 8 min效果最好 。同时选用幼嫩茎段作
外植体可明显降低污染率。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(6):2389-2390, 2394 责任编辑　常俊香　责任校对　傅真治
表 1　HgCl2不同消毒时间对长寿花外植体污染率的影响
Table1　EffectsofdiferentHgCl2 disinfectiontimeonpolutionrate
ofKalanchoeblossfeldianaexplant
HgCl2消毒时间∥min
HgCl2 disinfection
time
接种外植体
数∥个
Explantnumbers
污染外植体
数∥个
Polutionnumbers
污染率∥%
Polutionrate
0 81 63 77.77
7 83 41 49.40
8 80 16 20.00
9 80 13 16.25
10 78 10 12.83
2.2　植物生长调节剂对长寿花增殖的影响　由表 2可知 ,
不同生长调节物质配比的培养基都可使茎段增殖为丛芽 ,培
养 40 d后试管苗最大增殖倍数可达 7.2倍。方差分析表明 ,
6-BA在长寿花增殖培养中对增殖倍数和苗伸长的影响强于
IAA。F检验结果显示 , 6-BA对苗伸长生长的影响极显著 ,
6-BA和 IAA对长寿花增殖倍数的影响不显著 ,说明长寿花增
殖形成丛生芽对培养基中生长调节剂的适应性较广。随
6-BA浓度增加 ,苗高逐渐增加 ,当 6-BA浓度为 2.8 mg/L时 ,
丛苗显著高于 6-BA浓度为 1.0、1.5、2.1 mg/L的 3个处理;
IAA浓度过高抑制丛芽增殖。因此综合考虑增殖倍数和有
效苗高 2个指标 , IAA0.30 mg/L, 6-BA2.1mg/L和 GA3 0.6
mg/L是诱导丛芽增殖较合适的生长调节物质(PGR)配比。
表 2　植物生长调节物质组合对长寿花增殖的影响
Table2　Effectsofcombinationsofplantgrowthregulatorsonprolif-
erationofKalanchoeblossfeldiana
培养基编号
Mediumno.
生长调节物质∥mg/L
Growthregulators
IAA 6-BA GA3
增殖倍数
Multiplied
times
有效苗高∥cm
Heightofefective
shoots
1 0.20 1.0 0.6 5.2 0.5
2 0.20 1.5 0.6 5.6 0.5
3 0.20 2.1 0.6 5.7 0.6
4 0.20 2.8 0.6 5.9 0.7
5 0.25 1.0 0.6 5.7 0.7
6 0.25 1.5 0.6 6.0 0.7
7 0.25 2.1 0.6 6.3 0.6
8 0.25 2.8 0.6 6.9 0.7
9 0.30 1.0 0.6 6.4 0.7
10 0.30 1.5 0.6 6.8 0.8
11 0.30 2.1 0.6 7.2 0.8
12 0.30 2.8 0.6 6.7 0.9
13 0.35 1.0 0.6 6.5 0.8
14 0.35 1.5 0.6 6.9 0.9
15 0.35 2.1 0.6 6.4 0.9
16 0.35 2.8 0.6 6.6 1.1
2.3　不同浓度 NAA与 GA3配合对长寿花试管苗开花的影
响　由表 3可知 , NAA添加量在 2.0～ 4.5 mg/L范围内均能
诱导花芽分化 ,诱导率为 5.5% ～ 35.6%,而当 NAA浓度大
于 2.5 mg/L时 ,花芽诱导率下降 ,当 NAA浓度达到 5.0
mg/L时 ,花芽诱导率为 0。当 NAA为 2.0 mg/L时 ,在培养
基中添加 1.0 mg/LGA3也能诱导花芽分化 ,且花芽形成较
早 ,但花朵较小 ,说明 GA3具有催花的作用。单独使用 1.0
mg/LGA3则不能诱导开花。综合考虑花芽诱导率和花芽生
长状况等因素 , MS+2.5 mg/LNAA为诱导花芽分化的适宜
培养基 。在试验过程中 ,试管苗通常在成花培养基中培养 40
d后 ,花芽露白 ,花蕾开始挺起 , 65 d左右开放。
表 3　不同生长调节物质(PGR)浓度对花芽诱导的影响
Table3　EfectsofdifferentPGRconcentrationoninductionofflower-
buds
试验号
No.
PGR浓度∥mg/L
PGRConcentration
花芽生长状况
Growthcondition
offlower-buds
花芽诱导率∥%
Inductionof
flower-buds
17 NAA2.0 +++ 32.3
18 NAA2.5 +++ + 35.6
19 NAA3.0 +++ 26.6
20 NAA3.5 ++ 22.3
21 NAA4.0 ++ 9.0
22 NAA4.5 + 5.5
23 NAA5.0 - 0
24 NAA2.0+GA3 1.0 ++ 32.3
25 GA3 1.0 - 0
　注:“ -”表示未诱导出花芽;“ +、 ++、 +++、 ++++”表示花
芽生长状况。
　Note:“ -” indicatesnoneflower-buds;“ +, ++, +++, ++++”
indicatethegrowthconditionofflower-buds.
3　结论与讨论
长寿花组织培养主要以其叶片 、茎尖和茎段为外植体。
叶片在快繁体系建立过程中 ,需经愈伤组织诱导 、不定芽分
化 、不定芽伸长等阶段 ,所需时间较长 ,变异率较高 [ 7] ,而茎
尖 、茎段作外植体时只需促进其原有芽的增殖和生长 ,快繁
体系的建立所需时间相对较短。该试验以长寿花茎段为外
植体 ,培养 5d左右开始抽发侧梢 , 30d左右即可成苗。在外
植体建立阶段 ,茎段污染现象较明显 ,用 0.1%的 HgCl2消毒
8min可得到较好的控制 ,污染率为 20%。长寿花茎段外植
体中的内生细菌潜伏较深 ,在培养初期不易被肉眼察觉 ,随
着继代次数增加 ,菌量逐渐累积 ,才在培养基上大量显现出
来 ,这与 Kritzinger等 [ 8]的研究结果一致 。因此在利用长寿
花茎段进行组织培养时要特别注意内生菌污染情况的发生 ,
选用幼嫩茎段或茎尖作外植体可减少内生菌污染 。
在增殖培养过程中使用了 IAA、6-BA和 GA3 3种生长调
节物质 ,结果表明 ,在培养基中添加 IAA0.2 ～ 0.3mg/L能促
进试管苗伸长与生长 ,若 IAA浓度过高(0.35 mg/L)则抑制
试管苗增殖。
离体条件下 ,植物开花基因的表达和植物对环境刺激的
反应均受植物体内和体外植物激素的调控 ,所以 ,植物激素
对植物试管开花起着重要的作用 [ 9] 。不同种类的植物激素
和浓度配比对试管苗开花的影响差异较大 [10] 。该试验中 ,
试管苗在 MS+2.0 mg/LNAA+1.0 mg/LGA3培养基中花
芽生长较差 ,花芽诱导率与单独使用 2.0mg/LNAA时相同 ,
并且单独使用 GA3时不能诱导出花芽 ,说明 GA3 诱导花芽
分化的能力较差。但 NAA和 GA3组合却使花朵的开放时间
提前了 15 d,说明 GA3具有催花作用 ,这与 Franklin等 [ 11]报
道认为 GA3能快速启动花芽形成的结论一致。该试验中 ,
NAA浓度在 2.0 ～ 4.5mg/L时均能诱导花芽形成 ,且浓度为
2.5mg/L时诱导率最高 ,为 35.6%, NAA浓度为 5.0 mg/L
(下转第 2394页)
2390 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
不适;光照不足等都会造成黄化现象的出现 。
4.2　解决方法
(1)配制母液和培养基的制作过程中 ,要检查仪器设备
是否准确 ,还要认真细致地核对每项称量的每一个环节。
(2)配制培养基时切记不要忘记加糖。
(3)及时转接培养物 。
(4)使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况。
(5)适当调节 pH值 、激素配比和无机盐浓度 。
(6)控制培养室内的温度;适当增加光照。
(7)在培养基中添加抗生素类物质如青霉素 、链霉素 、头
孢霉素等 ,有时也会出现幼苗黄化现象 ,应适当减少用量或
停止使用。
5　变异率高的问题
植物组织培养的重要目的是保存种质资源 ,避免基因的
丢失和毁灭 ,快速繁殖具有商业价值的花卉苗木。如果培养
过程中变异率太高 ,不仅不能为保存资源和培育优良的品
种 、类型提供基础保障 ,还会严重影响工业化生产的组培苗
的质量。
5.1　原始材料　必须有自己的种源地 ,而且 2 ～ 3年换新地
以防病原滋生 ,或在大田生产中寻找远离老种植区 、品种来
源清楚 、无检疫性病害 、种植管理水平高的种植区采种基地 。
通过定期观察筛选出具有原品种典型特征的优良单株 ,作为
组织快繁的原始材料。
5.2配方　最佳配方确定以后 ,不要随意改动 。即使根据材
料的生长情况需调整配方一些成分的比例或浓度 ,也只能逐
步微调 ,特别是激素类应避免急增 ,而且用量控制在安全范
围内 ,配药过程严格操作。
5.3　增殖代数　继代增殖的代数对变异率影响因品种或配
方的不同而异 。
5.4　愈伤组织　作为大批量商品化生产 ,为了保持良好品
种的农艺性状 、品质和产量经组培快繁后不变 ,要避免利用
愈伤组织诱导产生植株。实践证明 ,愈伤组织再生植株的变
异率相当高 。继代接种时 ,要把组织上的愈伤组织切除干
净。 2002年王刚在兰州百合和野百合 2种百合的组培试验
中 ,对外植体的初代诱导方式 、各个激素梯度下和不同继代
次数下的染色体做了系统的统计分析发现 ,诱导愈伤组织比
值接诱导不定芽的变异率高;高的细胞分裂素与生长素的配
比会提高两种组培苗的变异率;继代次数的增加也会导致变
异频率增加 [ 17] 。
参考文献
[ 1] 赵庆芳 ,曾小英 ,丁兰,等.晶体百合组织培养及快速繁殖的研究 [ J].
甘肃科学学报, 2003, 15(1):39-42.
[ 2] 孟杨,潘佑找,贾姗姗,等.湖北百合的组织培养技术研究 [ J].安徽农
业科学 , 2006, 34(17):4247-4248.
[ 3] 邢震,郑维列.多蕊金丝桃的组织培养 [ J].江苏农业研究, 2000, 21(1):
45-47.[ 4] 李群,杜文平,王米力,等.植物组织培养中控制污染技术研究[ J].四
川林业科技 , 1999, 20(4):22-25.
[ 5] 周俊辉 ,刘花全 ,罗慧君,等.玛丽安万年青茎段培养的污染防止 [ J].
仲恺农业技术学院学报, 2002, 15(4):43-48.
[ 6] 郭海滨 ,雷家军.卷丹百合鳞片及珠芽组织培养研究 [ J] .农业技术科
技, 2006, 22(2):72-74.
[ 7] 王丽娟 ,樊金萍 ,车代弟.卷丹百合组培快繁技术的研究 [ J] .国土与自
然资源研究 , 2006(2):94-95.
[ 8] 许婉芳 ,龚福生 ,萧华山.杀菌对金线莲组织培养中微生物污染的抑制
作用[ J].福建果树, 1999(4):6-7.[ 9] 黄小荣 ,杨开太.香水白掌的组织培养 [ J].广西林业科学, 2001, 30(1):
39-40.
[ 10] 周俊辉,杨妙贤,李春霞,等.在培养基中加入抗生素防止万年青茎段
培养污染的研究[ J].广西植物, 2005, 25(3):233-235.
[ 11] 杨薇红,张延龙,童斌 ,等.亚洲百合花器官的组培快繁技术研究[ J].
中国农学通报 , 2004, 20(5):193-195.
[ 12] 张红.库拉索芦荟组培中的褐变现象及防止 [ J].安徽农业科学, 2008,
36(6):2257-2258.
[ 13] 陈红 ,张绿萍.不同处理对刺梨花药愈伤组织诱导及褐变的影响[ J].
北方园艺 , 2008(7):215-217.[ 14] 赵伶俐,葛红 ,范崇辉 ,等.不同光照强度对蝴蝶兰组培中外植体褐化
的影响[ J].北方园艺, 2006(4):160-161.
[ 15] 刘非燕,郭达初.重瓣丝石竹试管苗玻璃化发生原因初探[ J].杭州大
学学报, 1996, 23(4):382-387.
[ 16] 张孝霖,刘雪红,段代祥,等.建立沾化冬枣离体再生体系的防褐化研
究[ J].安徽农业科学, 2007, 35(15):4444-4445.
[ 17] 王刚.百合组织培养及组织培养过程中的染色体行为 [ D].兰州:西北
师范大学 , 2002.
(上接第 2390页)
时不能诱导出花芽 ,说明适宜的 NAA浓度能诱导长寿花花
芽的形成 ,浓度过高则起抑制作用。
参考文献
[ 1] 黄海帆,李保印,李平.影响长寿花离体培养及植株再生的几个因素
[ J].中国农学通报 , 2004, 20(2):12-14.
[ 2] 邓群仙,张雅新,王冲.长寿花离体繁殖技术研究 [ J].四川农业大学学
报, 2005, 23(2):195-198.
[ 3] 陈玉梁,支小刚.长寿花叶盘离体培养及植株高效再生研究 [ J].中国
农业通报 , 2004, 20(5):33-34.[ 4] 张瑞姿,郭晓霄.长寿花叶片再生体系的研究 [ J] .山西林业科技 , 2005
(1):8-14.
[ 5] 冯林剑,贾东坡,张信栓.不同培养条件下长寿花叶片再生体系的构建
[ J].中国农学通报 , 2006, 22(5):79-81.
[ 6] 刘义存,周俊辉,白志川.试管开花的研究评述 [ J] .西南园艺, 2006, 34
(5):20-22.
[ 7] 邓秀新,胡春根.园艺植物生物技术[ M].北京:高等教育出版社, 2005:
21.
[ 8] KRITZINGEREM, VUURENRJ,WOODWARDB, etal.Eliminationof
externalandinternalcontaminantsinrhizomesofZantedeschiaaethiopica
withcommercialfungicidesandantibiotics[J].PlantCel, TissueandOr-
ganCulture, 1998, 52:61-65.
[ 9] 冯莹,林庆良.试管开花研究进展 [ J].北京农业 , 2007(12):46-49.
[ 10] 王光远,许智宏 ,蔡德发,等.铁皮石斛的离体开花 [ J].中国科学 C
辑, 1997(3):229-234.
[ 11] FRANKLING, PIUSPK, IGNACIMUTHUS.Factorsafectinginvitro
floweringandfruitingofgreenpea(PisumsativumL.)[ J].Euphytica,
2000, 115:65-73.
[ 12] LIUHM, LINGHUKY,FANGXB.Thestudyoninductionandprolifer-
ationoftubebulbsinLiliumbrowni[J] .AgriculturalScience＆Technol-
ogy, 2008, 9(1):18-20, 53.
[ 13] 陈梅 ,莫饶.长寿花离体快繁研究[ J] .安徽农业科学 , 2007, 35(32):36
-37.
[ 14] 林秀莲,赖钟雄,黄双龙,等.红花长寿花茎段及叶片的离体培养与快
速繁殖[ J].亚热带农业研究 , 2005, 1(2):1-5.
[ 15] JIANGQ, DONGL, NINGZY, etal.Establishmentofsomaticcelclones
inThesiumchinenseTurczanditsinvitrorootingtechnique[J] .Agricul-
turalScience＆Technology, 2008, 9(5):47-49, 52.
2394 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年