全 文 ：文章编号:1006-1126 (2007)02-0089-04
药用植物六角莲基因组 DNA提取方法
作者简介:李军集 (1980-), 男 , 助理工程师 , 从事林产业化工研究。
通讯作者:刘海龙 (1980-), 男 , 助理工程师 , 从事植物组织培养和保护生物学研究。
李军集1 , 廖和发2 , 刘海龙1 , 3
(1.广西林业科学研究院 , 南宁　530001;2.湖北省大悟县林业局 , 大悟　432800;
3.浙江大学生命科学学院 , 杭州　310029)
摘　要:以硅胶干燥的六角莲叶片为试材 , 对基因组 DNA 提取方法进行了研究。通过对 CTAB法的改良 , 提取
的六角莲总 DNA含多糖 、 蛋白质 、 色素 、 RNA等杂质较少 , A260/A280=1.86 , 完全能满足对六角莲进行分子
生物学试验的要求。该提取方法同样适用于同属其它 3 种植物。
关键词:六角莲;八角莲属;基因组 DNA;I SSR
中图分类号:Q781
Extract Method of DNA Genome of a Medical Plant Dysosma pleiantha
LI Junji1 , LIAO Hefa2 , LIU Hailong1 , 3
(1.Guangxi Forestry Research Institute , Nanning 530001;
2.Dawu County Forestry Depar tment , Hubei Province 432800;
3.Life Science College of Zhejiang University , Hangzhou 310029)
Key Words:Dysosma pleiantha;Dysosma Wood;DNA Genome;ISSR
　　六角莲是小檗科 (Berberidaceae)八角莲属
(Dysosma)植物 , 根状茎作药用 , 具清热解毒 ,
抗蛇毒之功效。近年来的研究表明 , 该属植物具有
抗癌活性 , 特别是用于治疗食道癌 、子宫癌 。六角
莲作为该属著名药材 , 用药量大 , 但分布区狭小 ,
仅限于我国东南沿海及台湾 , 资源量有限 , 已知居
群数不多 , 加上逐年不断采挖 , 种源正日趋减少及
趋向濒危〔1〕。为加强对其的保护 , 针对六角莲的
许多基础性研究正在全面展开 , 包括居群的遗传结
构 、 稀有的原因及机制 、 繁育系统等 , 这些研究有
利于制定六角莲就地和迁地保护策略 , 有利于对濒
危物种六角莲的进一步复壮打下基础〔2-3〕 。
分子生物学的实验方法被大量应用于这些基础
性研究中 , 如限 制性酶切 片段长 度多态性
(RFLP)、 随机扩增多态性 DNA (RAPD)、 串联
重复序列 (SSR)、 扩增酶切片段长度多态性
(AFLP)等 , 这些方法已广泛用于生物学研究的
各个领域 , 在这些技术的实验过程中 , DNA 质量
是影响实验的关键因素之一〔4-5〕 。由于六角莲组
织细胞内富含多糖 、蛋白质 、色素等复杂次生化合
物 , 给基因组 DNA的提取造成极大困难。目前已
发表多种从植物组织中提取 DNA的方法 , 但针对
六角莲既简便又经济的高纯度 DNA 提取方法仍需
要进一步探索和改进。
试验以六角莲的硅胶干燥叶片为提取材料 , 采
用 CTAB法进行 DNA 的提取 , 在实验过程中 , 对
CTAB法的提取程序也进行了改进 , 结果获得了高
得率 、高纯度的 DNA 。
第 36 卷　第 2 期
2007 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　
广 西 林 业 科 学
Guangxi Forestry Science
　　　　　　　　　　　　　　　Vol.36　No.2
Jun.2007
1　材料与方法
1.1　实验材料
采集来自浙江天目山 、福建建宁县 、江西三清
山的 3个野生居群的约 60 个个体的六角莲叶片 ,
用硅胶干燥保存 。
1.2　DNA 提取及纯化
DNA提取步骤:
1)取干燥的叶片约 0.1 g 置于 DNA 粉碎管 ,
加入 PVP 粉 , 加入磨样用小珠。在 Fastprep 植物
组织破碎仪上震荡 20 s , 仪器参数为 Speed 2.0。
2)在粉碎好的材料中立即加入 65℃预热的
2 mL CTAB 提取缓冲液 [ 含 2%β -巯基乙醇] ,
摇匀 , 65℃水浴 30 min , 每隔 5 min左右摇动离心
管。
3)将离心管取出 , 加入等体积的氯仿:异戊
醇 (24∶1), 摇匀 15 min , 10 000 r/ s离心 15 ～ 20
min。
4)取上清加入 1/10体积的 CTAB/NaCl , 摇
匀后加入等体积氯仿:异戊醇 (24∶1), 用手轻摇
15 min , 10 000 r/ s离心 15 ～ 20 min。
5)取上清加入 1/2体积 5 mol/L NaCl , 然后
加入 1倍体积-20℃预冷的异丙醇 , 轻轻摇动混匀
两相 , -20℃静置 2 h (或过夜), 待 DNA 析出 ,
10 000 r/ s离心约 10 min , 弃水相 。
6)70%乙醇洗涤 2 次 , 无水乙醇洗涤 1 次 ,
去乙醇 , 风干 。
7)用 400 μL 高盐 TE溶解 DNA , 在 DNA 完
全溶解后 , 加入 RNA酶 2 μL (10 mg/ml), 37℃
保温 30 min 。
8)加等体积氯仿:异戊醇 (24∶1), 摇匀成乳
白色 , 10 000 r/ s离心 15 ～ 20 min。
9)取上清加入 1/4体积的 3 mol/L NaAc (pH
5.2)和两倍体积的无水乙醇 , 轻轻摇匀 , 静置于
-20℃2 h (或过夜), 直到出现 DNA 絮状沉淀 ,
10 000 r/ s离心 5 min。弃上清 , 用 500 μL 70%乙
醇洗涤 2次 , 500 μL 无水乙醇洗涤 1次 , 去乙醇 ,
风干 。
10)100 μL TE缓冲液溶解 DNA 沉淀 。1%琼
脂糖凝胶电泳检测 , 冷藏于-20℃备用。
1.3　DNA的检测方法
1.3.1　D (λ)法
取 2 μL DNA样品稀释 50倍后在紫外分光光
度计上测定 OD 260 nm 和 OD 280 nm 。
1.3.2　电泳分析
将提取的 5 种 DNA 样品在 1%琼脂糖凝胶
(含 EB)上电泳 , 上样量为 3 μL , 反应混合物在
0.5×TBE缓冲液中 120 V 电泳 40 min。电泳结果
在 EPSON (Japan)紫外自动成像仪上照相记录。
根据 DNA带的亮度来估计其浓度 , 认为琼脂糖凝
胶电泳检测结果比紫外分光比色检测结果更可靠。
图 1　六角莲 DNA凝胶电泳图
　　1-2 为完全按照本文描述的 DNA提取方法提取得到的 DNA;3-4 两个样品在步骤 (9)中仅加入 1/ 10 的 NaAc , 在
步骤 (5)没有加入 NaCl;5-6 为没有做过纯化的样品 , 即在步骤 (7)结束后就直接用 TE 溶解。 7-8 为试剂盒方法提取
的 DNA;9-10 在步骤 (7)未加入 RNA 酶。
1.3.3　ISSR分析
ISSR反应在 PE480PCR仪上进行 , 所用引物
为 sangon公司合成的引物 UBC 854∶(TC)8 RG 。
PCR反应体系总体积 25 μL:50 ng 模板 DNA;
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0.4μM 引物;1.25 U Taq聚合酶;buf fer 2.5μL;
4种 dNTP 各 0.2 μM;2.0 mM M gCl2 , 用纯水补
充至 25 μL。ISSR PCR 扩增程序如下:94℃预变
性 5 min;94℃变性 45 s , 54℃退火 45 s , 72℃延
伸 90 s , 44个循环;72℃延伸 10 min;最后在4℃
保存 。DNA扩增产物以 0.5×TBE缓冲液为介质 ,
制备含 0.2%溴化乙锭的 2.0%琼脂糖凝胶 , 100
V 电泳 1.5 ～ 2.5 h 。电泳结果在紫外灯用 EPSON
(Japan)紫外自动成像仪上照相记录 。
2　实验结果
2.1　DNA 样品纯度及得率
A260/A280比值平均为 1.86。说明以六角莲
叶片为材料所提取 DNA 样品中多糖 、蛋白质 、植
物色素和酚类物含量较低 , DNA 纯度高 , 完全满
足进一步分子生物学操作的要求。
2.2　DNA样品的电泳
从基因组 DNA的电泳结果来看 , 1 ～ 2提取到
的 DNA 总带清晰 , 无拖尾 、降解现象 , 且总带亮
度大 , 说明 DNA 量较多;3 ～ 4两个样品的多糖未
除净 , 孔与总带之间区域亮度大;5 ～ 6 两个样品
含杂质太多 , DNA 总带跑不出孔 , 导致孔内亮度
大;7 ～ 8 两个样品 , DNA 降解严重 , 且 DNA 总
带亮度小 , 表明提取到的 DNA 量少;9 ～ 10 两个
样品的 RNA带明显 , RNA 未除去 (图 1)[ 6]　。
2.3　DNA的 ISSR分析
由六角莲叶片提取 DNA 的 ISSR分析结果可
以看出 , 获得了清晰稳定的图谱 , 说明提取 DNA
完全可用于 PCR分析 , 这进一步证明提取的 DNA
纯度较高 , 从扩增图谱来看 , 同一群体内的不同个
体之间存在一定的多态性 , 说明 ISSR标记可用于
遗传多样性分析和鉴定 。
图 2　提取 DNA在浙江天目居群的 23 个个体中的 ISSR扩增结果
3　讨论
1)本提取方法在步骤 5 中加入 NaCl , 步骤 9
中加入了比常规CTAB多 2 ～ 3倍的NaAc , 这些盐
类物质在除去多糖方面的作用很大[ 7] , 同时异丙
醇 、 乙醇的分级沉淀作用也利于多糖的去除 。
2)另外六角莲植物体内含有酚类 、 萜类等次
生代谢产物 , 本实验用 PVP (磷酸吡哆醛)作为
吸附剂 , 与这些次生代谢物质形成一种不溶的络合
物 , 以去除次生代谢物质;以 β -巯基乙醇为抗氧
化剂 , 它提供的 SH ——— (巯基)与多酚类物质竞
争氧 , 因而有效的防止了酚氧化成醌 , 避免褐
变[ 8-9] 。
3)该法提取 DNA 过程中 , 要保证水浴时间
充足 、 温度适当 、不时摇动溶液 , 使核 DNA 释放
完全 , 可增加得率。此外 , 在步骤 5与步骤 9中延
长-20℃时的冰冻时间可以增加 DNA沉淀量 , 同
样有利于增加得率 , 这对于微量提取尤为重要 。
4)在步骤 7 与步骤 10 中需用乙醇洗涤 , 若
DNA 不易见 , 易倒出 , 则可每洗完一次后 ,
10 000 r/ s离心 1 min , 使 DNA 再次附在管底 , 然
后倒掉洗涤液。特别是在步骤 10 中 , 经纯化的
DNA 量更少 , 体积更小 , 肉眼不易见。
5)在 DNA 提取过程中 , 采用乙醇沉淀析出
DNA , 以及用 70%乙醇去洗涤 DNA 沉淀 , 在风
干时要使其中的乙醇挥发完全 , 否则会影响下一步
的结果。
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(上接第 88页)
4　小结
1)在退化土壤上种植竹子 , 通过施肥均可获
到较高的产量。各地可根据用竹需要来选择适宜当
地生长的经济竹种 , 从产量高低来看 , 粉单竹是 3
个竹种中最理想的生态经济竹种 , 此竹可用于编织
业 、 制浆业 , 目前原竹市场供不应求 , 因此值得大
力推广 。试验的 3 个因素对竹子产量的影响程度:
抚育措施>竹种>种植密度 , 这为今后竹子造林提
供可参考的栽培模式 。
2)通过种植竹子 , 迅速 、 有力地控制水土流
失 , 退化的土壤疏松程度 、保水能力等理化性质得
到良好改善 , 土壤肥力逐步得到恢复 , 达到良好的
土壤荒漠化治理效果 , 因此在今后土壤荒漠化治理
中可考虑应用竹子这一具有立竿见影功能的植物种
类。
3)本试验使用的配方肥中磷 、 钾含量较低 ,
不足竹林生长所需 , 因此 , 竹林的配方施肥应首先
进行土壤养分测定 , 然后考虑不同竹种对各种养分
的需求量 、竹种的吸收养分能力以及预期产量确定
肥料养分比例 、施肥量 、施肥时间 , 使施肥的投入
获到最大收益 。
致谢
参加本项目野外工作的还有梁容芬 、 黄道平 、 蒋敏华
等 , 在此一并致谢。
参考文献
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