全 文 ：植物资源与环境学报　2010, 19(1):38-42
JournalofPlantResourcesandEnvironment
外源激素对杜衡叶柄愈伤组织诱导与分化的影响
郭忠仁 , 李乃伟 , 束晓春 , 孙银凤 , 陆小清 , 汤诗杰①
〔江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园), 江苏 南京 210014〕
摘要:以杜衡(AsarumforbesiiMaxim.)叶柄为外植体 ,采用 L9(34)正交实验设计分别研究了培养基中外源激素的种
类及质量浓度对杜衡叶柄愈伤组织诱导和分化的影响 , 并据此筛选出适宜的诱导及分化培养基。结果表明:在杜
衡叶柄愈伤组织的诱导过程中 , 培养基中细胞分裂素的种类(1.00 mg· L-1 6-BA、1.00 mg· L-1KT和 1.00 mg·
L-1ZT)和 NAA质量浓度(0.00、0.10和 0.30mg· L-1)的影响效应均不显著 , 而 2, 4 -D质量浓度(0.10、0.50和
1.00 mg· L-1)则有显著影响(P<0.05);在愈伤组织的分化培养过程中 , NAA(0.10、 0.30和 0.50 mg· L-1)的影
响效应大于 6-BA(1.00、3.00和 5.00 mg· L-1)和 IBA(0.01、0.05和 0.10 mg· L-1)。综合比较结果显示 , 适宜
于杜衡叶柄愈伤组织诱导的培养基为添加 1.00mg· L-1 6-BA、0.30mg· L-1NAA和 1.00mg· L-1 2, 4-D的 MS
培养基(含 6.5 g· L-1琼脂和 30 g· L-1蔗糖 , pH5.8 ～pH6.0),在此培养基上愈伤组织诱导率达到 83.33%,且愈
伤组织生长速度快 、颗粒紧密;适宜于杜衡愈伤组织分化和不定芽增殖的培养基为添加 3.00 mg· L-1 6-BA、0.10
mg· L-1IBA和 0.30 mg· L-1NAA的 MS培养基(含 6.5 g· L-1琼脂和 30 g· L-1蔗糖 , pH5.8 ～ pH 6.0), 在此培
养基上愈伤组织的分化率最高(达到 53.33%), 增殖系数也最高(3.13)。
关键词:杜衡;叶柄;愈伤组织;诱导;分化;外源激素
中图分类号:Q943.1;S567.23+9.043　　文献标志码:A　　文章编号:1674-7895(2010)01-0038-05
Efectsofexo-phytohormonesoninductionanddifferentiationofcalusfrom Asarum forbesi
petiole　GUOZhong-ren, LINai-wei, SHUXiao-chun, SUNYin-feng, LUXiao-qing, TANGShi-jie①(InstituteofBotany, JiangsuProvinceandtheChineseAcademyofSciences, Nanjing210014, China),
J.PlantResour.＆Environ.2010, 19(1):38-42
Abstract:UsingpetioleofAsarumforbesiMaxim.asanexplant, efectsoftypeandconcentrationofexo-
phytohormonesinculturemediaoninductionanddiferentiationofcaluswereresearchedbyL9(34)orthogonalexperiment, andthesuitableinductionanddiferentiationmediawerealsoselectedonthebasisoftheresearchresults.TheresultsshowthatininductionprocessofcalusfromA.forbesipetiole,
cytokinintype(1.00mg· L-1 6-BA, 1.00mg· L-1 KTand1.00 mg·L-1 ZT)andNAAconcentration
(0.00, 0.10 and0.30mg· L-1)inmediahavenoobviousefects, but2 , 4-Dconcentration(0.10,
0.50and1.00 mg·L-1)hasasignificantefect(P<0.05).Indiferentiationprocessofcalus, efect
ofNAA(0.10, 0.30 and0.50 mg· L-1)isstrongerthanthoseof 6-BA(1.00 , 3.00 and5.00
mg·L-1)andIBA(0.01, 0.05and0.10mg·L-1).Thecomprehensiveanalysisresultsshowthatthe
optimalmediumsuitableforcalusinductionfromA.forbesipetioleisMSmediumadded1.00 mg·L-1
6-BA, 0.30 mg· L-1 NAAand1.00 mg· L-1 2 , 4-D(containing6.5 g· L-1 agarand30 g· L-1sucrose, pH5.8-pH6.0).Andinthismedium, inductionrateofcalusreaches83.33% andcalusgrowsfastandformscompactcelmasses.Theoptimalmediumsuitableforcalusdiferentiationand
propagationofadventitiousbudofA.forbesiisMSmediumadded3.00mg· L-1 6-BA, 0.10 mg·L-1
IBAand0.30 mg·L-1 NAA(containing6.5g·L-1 agarand30g·L-1 sucrose, pH5.8-pH6.0).Andthediferentiationrateofcalusisthehighestwithapercentageof53.33%, andthemultiplication
收稿日期:2009-09-27
基金项目:江苏省科技基础设施建设计划项目(BM2006104)
作者简介:郭忠仁(1960—),男 ,江苏南京人 ,硕士 ,研究员 ,主要从事果树育种和观赏园林植物资源研究。
①通信作者 E-mail:eucommia2003@yahoo.com.cn
coeficientisalsothehighestwithavalueof3.13intheoptimaldiferentiationmedium.
Keywords:AsarumforbesiMaxim.;petiole;calus;induction;diferentiation;exo-phytohormone
　　杜衡(AsarumforbesiMaxim.)又称南细辛 ,为马
兜铃科(Aristolochiaceae)细辛属(AsarumL.)多年生
草本植物 ,是珍贵的中药材之一 [ 1] 。杜衡全草均可
入药 ,具有散寒止咳 、祛风止痛的功效 ,主要药物成分
是黄樟醚(safrole)和少量的丁香油酚(eugenol)。杜
衡不仅是一种重要的药用植物 ,还是国家二级保护动
物 ———中华虎凤蝶(LuehdorfiachinensisLeech.)喜食
的植物 ,在江苏南京的紫金山区域 ,中华虎凤蝶的寄
主即为杜衡[ 2] 。由于具有很高的药用价值 ,近年来
野生杜衡资源遭到过度采挖 ,植株数量越来越少 ,严
重威胁了中华虎凤蝶的生存 ,使中华虎凤蝶的种群数
量显著减少 。因此 ,扩大杜衡的种群数量 、解决杜衡
人工繁殖及种植问题 ,不但能有效保护杜衡药用资
源 ,而且也可以为中华虎凤蝶提供充足的寄主及食
源 ,为保护中华虎凤蝶提供基础有效的措施。在此过
程中 ,杜衡快速繁育是亟待解决的难题之一 ,研究杜
衡的组织培养技术对解决这一难题具有非常重要的
实际意义。
有关杜衡及其同属植物组织培养方面的研究报
道尚不多见 。李洪林等 [ 3]以嫩芽为外植体对杜衡的
组织培养过程进行了研究 ,获得了杜衡芽增殖 、壮苗
和生根的培养基配方;王金平等 [ 4]则以叶柄为外植
体对杜衡的组织培养技术进行了研究;周建中 [ 5] 则
以茎尖为外植体进行了杜衡离体繁殖技术的研究 。
虽然通过这些研究均获得了杜衡的增殖培养基和生
根培养基的配方 ,但对培养基中最佳的外源激素配比
尚未作系统的分析和比较 。
作者以杜衡叶柄为外植体 ,采用 L9(34)正交实
验设计研究了不同外源激素种类及质量浓度对杜衡
愈伤组织诱导和分化的影响 ,以获得最适宜于杜衡愈
伤组织诱导和分化的外源激素配比 ,为杜衡的快速繁
育提供理论基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
供试的杜衡母株于 2009年 4月取自江苏镇江宝
华山 ,将其在江苏省 ·中国科学院植物研究所(南京
中山植物园)的日光温室内盆栽 2个月后 ,取当年生
叶柄作为外植体进行实验。
1.2　方法
1.2.1　外植体的前处理及表面消毒　将杜衡叶柄用
清水冲洗干净后 ,用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗
干净 ,再用自来水漂洗 3 ～ 5次 ,然后在摇床上用稀释
50倍的 84消毒液振荡消毒 15 ～ 20 min;流水冲洗
20 ～ 30 min后 ,将外植体置于无菌操作台上 ,用体积
分数 75%乙醇消毒 50 ～ 60 s,然后立即用质量体积
分数 0.1%HgCl2消毒 12 min,最后用无菌水洗涤 4
次 ,每次振荡 3 ～ 5min。用灭菌镊子将消毒好的叶柄
放在无菌表面皿中 ,再用灭菌刀片将叶柄切成长度为
0.5 ～ 1.0 cm的小段 ,供接种。
1.2.2　愈伤组织的诱导培养　通过 L9(34)4因素 3
水平正交实验设计 9个杜衡叶柄愈伤组织诱导培养
基激素组合。 4个因素分别为细胞分裂素种类 、NAA
质量浓度 、2, 4-D质量浓度和空列。其中 ,细胞分裂
素种类的 3个水平为 6-BA、KT和 ZT,质量浓度均
为 1.00mg·L-1;NAA质量浓度的 3个水平为 0.
00、 0.10和 0.30 mg· L-1;2, 4-D质量浓度的 3个
水平为 0.10、0.50和 1.00 mg· L-1。以 MS培养基
为基本培养基 ,除上述激素组合外 ,培养基中还含
6.5 g·L-1琼脂和 30g·L-1蔗糖 , pH5.8 ～ pH6.0。
将已灭菌的叶柄外植体接种到 9种诱导培养基
上 ,黑暗培养 24 h后进行正常的光照培养 ,光照时间
16 h· d-1 ,光照度 2 000 lx,培养温度 23 ℃ ～ 26 ℃。
每瓶 2个外植体 ,每种培养基接种 15瓶 ,并设 3次重
复 。每天观察愈伤组织的诱导情况 ,培养 20 d后统
计愈伤组织的诱导率。
1.2.3　愈伤组织的分化培养　通过 L9(34)4因素
3水平正交实验设计 9个杜衡愈伤组织分化培养基
激素组合 。 4个因素分别为 6 -BA质量浓度 、NAA
质量浓度 、IBA质量浓度和空列 。其中 , 6-BA质量
浓度的 3个水平为 1.00、3.00和 5.00mg·L-1;NAA
质量浓度的 3个水平为 0.10、0.30和 0.50mg· L-1;
IBA质量浓度的 3个水平为 0.01、0.05和 0.10mg·
L-1。以 MS培养基为基本培养基 ,除上述激素组合
外 ,培养基中还添加了 6.5 g· L-1琼脂和 30 g· L-1
蔗糖 , pH5.8 ～ pH6.0。
将诱导出的杜衡叶柄愈伤组织切成面积约为
39　第 1期　　　　　　　　　　　郭忠仁等:外源激素对杜衡叶柄愈伤组织诱导与分化的影响
0.5cm2的方块 , 接种到 9种分化培养基上 , 置于温
度 23℃ ～ 26 ℃、光照时间 16 h· d-1 、光照度 2 000
lx的条件下培养。每瓶接种 2块愈伤组织 ,每种培养
基接种 15瓶 ,并设 3次重复 。每天观察愈伤组织的
分化情况 ,培养 15 d后统计愈伤组织的分化率。
1.3　数据分析
通过正交设计助手Ⅱv3.1对实验数据进行统计
和分析 。
2　结果和分析
2.1　诱导培养基中的外源激素种类和质量浓度对杜
衡叶柄愈伤组织诱导的影响
在愈伤组织诱导培养基上培养 7 d后 ,杜衡叶柄
外植体开始弯曲;培养 10d后 ,有些外植体的两端开
始长出颗粒状愈伤组织。诱导培养基中外源激素种
类和质量浓度对杜衡叶柄愈伤组织诱导影响的正交
实验结果及方差分析结果见表 1和表 2。结果显示 ,
在添加了不同激素组合的诱导培养基中杜衡愈伤组
织的诱导率和生长情况有明显差异。极差 R值分析
结果表明 ,诱导培养基中细胞分裂素种类 、NAA质量
浓度和 2 , 4-D质量浓度对杜衡叶柄愈伤组织诱导
均有一定的影响(R值 >空列 R值),其中以 2, 4-D
质量浓度的影响最为明显 。
　　实验选用的 3个细胞分裂素(6-BA、KT和 ZT)
均为植物组织培养研究中常用的细胞分裂素 [ 6 -7] 。
根据表 1中不同细胞分裂素种类间的 K值及表 2中
的 F值均可发现 ,在诱导培养基中添加 1.00 mg·
L-1 6-BA、1.00mg· L-1KT或 1.00 mg· L-1ZT,对
杜衡叶柄愈伤组织诱导的影响效应均不明显。
NAA是重要的植物生长素之一 ,在植物离体培
养过程中的主要作用是诱导愈伤组织的形成和促进
根的发育[ 8] 。由表 1中不同质量浓度 NAA的 K值以
及表 2中的 F值均可看出 ,质量浓度在 0.00 ～ 0.30
mg· L-1范围内 , NAA对杜衡叶柄愈伤组织诱导率的
影响不显著 ,但 NAA与一定质量浓度(0.50 ～ 1.00
mg· L-1)的 2, 4-D组合则对杜衡叶柄愈伤组织诱
导的促进作用更明显。在未添加 NAA的诱导培养基
(Y7)中 ,杜衡叶柄愈伤组织诱导率最高(97.78%),
但愈伤组织的生长状况较差;而在添加 NAA的 Y3
(0.30mg·L-1NAA)、Y5(0.10 mg· L-1NAA)和 Y9
(0.30mg· L-1NAA)培养基中 ,杜衡叶柄愈伤组织
的诱导率也较高 ,均在 66%以上 ,但在 Y5培养基中
愈伤组织的生长状况较差 ,只有在 Y3和 Y9培养基
中愈伤组织颗粒比较致密 ,这种愈伤组织易于分化。
2, 4-D是植物组织培养中常用的生长激素之一 ,
一定浓度的 2, 4-D能促进植物愈伤组织的诱导 ,且
诱导效果较好 [ 9-11] 。由表 1和表 2可见 ,在添加了
0.10mg· L-1 2, 4-D的诱导培养基(Y1、 Y6和 Y8)
中 ,杜衡愈伤组织的诱导率较低 ,均在 23%以下 ,
表 1　杜衡叶柄愈伤组织诱导培养基中外源激素种类及质量浓度的正交实验结果
Table1　Theresultoforthogonalexperimentontypeandconcentrationofexo-phytohormonesininductionmediumofcalusfromAsarumforbesii
Maxim.petiole
编号
No.
因素和水平 1)　Factorandlevel1)
A B C D
诱导率 /%
Induction
rate
愈伤组织生长状况
Growthstatusofcalus
Y1 6-BA 0.00 0.10 16.67 生长慢 ,未玻璃化 Growslowly, novitrification
Y2 6-BA 0.10 0.50 50.00 生长慢 ,未玻璃化 Growslowly, novitrification
Y3 6-BA 0.30 1.00 83.33 生长快 ,颗粒致密 Growfast, celmasscompact
Y4 KT 0.00 0.50 58.89 生长慢 ,未玻璃化 Growslowly, novitrification
Y5 KT 0.10 1.00 75.56 生长较快 ,颗粒疏松 Growfast, celmassloose
Y6 KT 0.30 0.10 18.89 生长快 ,颗粒致密 Growfast, celmasscompact
Y7 ZT 0.00 1.00 97.78 生长快 ,玻璃化严重 Growfast, vitrificationserious
Y8 ZT 0.10 0.10 22.22 生长慢 ,颗粒疏松 Growslowly, celmassloose
Y9 ZT 0.30 0.50 66.67 生长快 ,颗粒致密 Growfast, celmasscompact
K1 0.500 0.578 0.193 0.530
K2 0.511 0.493 0.585 0.556
K3 0.622 0.563 0.856 0.548
R 0.122 0.085 0.663 0.026
　1)A:细胞分裂素种类(质量浓度为 1.00mg· L-1)　Cytokinintype(concentration1.00mg· L-1);　B:NAA质量浓度　ConcentrationofNAA(mg· L-1);C:2, 4-D质量浓度 Concentrationof2, 4-D(mg· L-1);D:空列 Blank.
40 　　　　　　　　　　植 物 资 源 与 环 境 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷　
表 2　杜衡叶柄愈伤组织诱导培养基中外源激素种类及质量浓度正交
实验结果的方差分析
Table2　Varianceanalysisoforthogonalexperimentresultontype
andconcentrationofexo-phytohormonesininductionmediumofcalusfromAsarumforbesiMaxim.petiole
因素 1)
Factor1) SS DF F2)
A 0.027 2 0.153
B 0.012 2 0.068
C 0.667 2 3.774＊
误差 Error 0.710 8
　1)A:细胞分裂素种类(质量浓度为 1.00 mg· L-1)Cytokinintype
(concentration1.00mg· L-1);B:NAA浓度 ConcentrationofNAA
(mg· L-1);C:2, 4-D浓度 Concentrationof2, 4-D(mg· L-1).　2)＊:P<0.05.
K值和 F值也最小;而在添加了 1.00mg· L-1 2, 4-D
的诱导培养基(Y3、 Y5和 Y7)中 ,杜衡叶柄愈伤组织
的诱导率较高 ,均在 75%以上 , K值和 F值也最大 ,且
达到显著水平(P<0.05)。结果显示 ,在诱导培养基
中添加较高质量浓度的 2, 4-D有利于杜衡叶柄愈伤
组织的诱导 。
从愈伤组织的诱导率和生长情况两方面来看 ,比
较理想的杜衡叶柄愈伤组织诱导培养基为 Y3培养
基 ,即添加 1.00 mg· L-1 6-BA、0.30 mg· L-1NAA
和 1.00 mg· L-1 2, 4 -D的 MS培养基(含 6.5 g·
L-1琼脂和 30 g·L-1蔗糖 , pH5.8 ～ pH6.0)。在该
培养基中 ,杜衡叶柄愈伤组织诱导率可达到 83.33%,
且诱导出的愈伤组织生长较快 、颗粒致密 。
2.2　分化培养基中外源激素种类和质量浓度对杜衡
叶柄愈伤组织分化的影响
杜衡叶柄愈伤组织转入分化培养基培养 15d后 ,
有部分愈伤组织的周围或上部开始分化出不定芽。
分化培养基中外源激素种类及质量浓度对杜衡叶柄
愈伤组织分化及不定芽增殖影响的正交实验结果见
表 3。由表 3可以看出 ,在激素配比不同的 9种分化
培养基上 ,杜衡叶柄愈伤组织的分化率不同 ,且增殖
系数有较大差异 。
正交实验结果(表 3)显示 ,在 NAA质量浓度均为
0.30mg·L-1的 3组分化培养基(F2、F5和 F8)中 ,杜
衡叶柄愈伤组织的分化率较高 ,均在 45%以上;而在 6
-BA质量浓度均为 3.00 mg· L-1的 3组分化培养基
(F4、F5和 F6)中 ,杜衡叶柄愈伤组织不定芽的增殖系
数较高。其中 , 以添加了 0.10 mg· L-1 IBA的分
化培养基 (F5)的分化效果最好 (分化率达到
53.33%)、增殖系数最高(达到 3.13,即平均每块愈
伤组织可分化出 3.13个不定芽),且在此培养基中分
化培养 20d后即可形成具有完整茎叶的健康小植株 。
把这些基部带有愈伤组织块的植株切割分离 ,接种到
新的配方相同的分化培养基上 ,则会从植株基部的愈
伤组织上不断分化出不定芽 ,继而长成新的小植株 ,
因此 ,可以把该培养基作为杜衡叶柄愈伤组织分化及
增殖的培养基。
直观分析结果表明 , NAA对杜衡叶柄愈伤组织分
化的影响大于 6-BA和 IBA。虽然 IBA对杜衡叶柄
愈伤组织分化的贡献不大 ,但有报道显示[ 12-13] , IBA
在其他植物的组织培养过程中起到促进植物生根的
作用 ,有利于植物的壮苗 。因此 , IBA与 NAA组合使
用 ,可使杜衡叶柄愈伤组织分化产生的试管苗的生长
状况更好 。 6-BA为细胞分裂素 ,能促进细胞分裂 ,
有利于愈伤组织的形态建成 [ 14] ,所以对愈伤组织不
定芽的增殖有一定的促进作用 。
对愈伤组织分化率和不定芽增殖系数 2个指标
进行综合分析 ,结果表明 ,添加 3.00 mg·L-1 6-BA、
0.30 mg· L-1NAA和 0.10 mg· L-1IBA的 MS培养
基 (含有 6.5g· L-1琼脂和 30 g· L-1蔗糖 , pH5.8
～ pH6.0)为杜衡叶柄愈伤组织分化及不定芽增殖
的最佳培养基。在该分化培养基上 ,杜衡叶柄愈伤组
织的分化率和不定芽的增殖系数均量高 。
表 3　杜衡叶柄愈伤组织分化培养基中外源激素种类和质量浓度的正
交实验结果
Table3　Theresultoforthogonalexperimentontypeandconcen-
trationofexo-phytohormonesindiferentiationmediumofcalusfrom
AsarumforbesiMaxim.petiole
编号
No.
因素和水平 1)　Factorandlevel1)
A B C D
分化率 /%
Diferenti-
ationrate
增殖系数
Multipli-
cation
coeficient
F1 1.00 0.10 0.01 16.67 1.40
F2 1.00 0.30 0.05 50.00 1.47
F3 1.00 0.50 0.10 23.33 1.57
F4 3.00 0.10 0.05 20.00 2.33
F5 3.00 0.30 0.10 53.33 3.13
F6 3.00 0.50 0.01 26.67 2.75
F7 5.00 0.10 0.10 20.00 2.00
F8 5.00 0.30 0.01 45.56 2.00
F9 5.00 0.50 0.05 25.56 2.25
K1 0.300 0.189 0.296 0.319
K2 0.333 0.496 0.319 0.322
K3 0.304 0.252 0.322 0.296
R 0.033 0.307 0.026 0.026
　1)A:6-BA质量浓度 Concentrationof6-BA(mg· L-1);B:NAA质
量浓度 ConcentrationofNAA(mg· L-1 );C:IBA质量浓度
ConcentrationofIBA(mg· L-1);D:空列 Blank.
41　第 1期　　　　　　　　　　　郭忠仁等:外源激素对杜衡叶柄愈伤组织诱导与分化的影响
3　讨论和结论
大多数情况下 ,在植物组织培养过程中只用生长
素 2 , 4-D就可成功地诱导植物外植体产生愈伤组
织 ,通常采用的质量浓度范围为 0.001 ～ 10mg·L-1。
但在只含 2, 4-D的培养基上诱导出的植物愈伤组织
比较松软 ,多呈玻璃化状态 ,一般不易分化 ,且再生频
率很低 。将 2, 4-D与 NAA组合使用 ,不仅能使愈伤
组织变得比较致密 、质地较硬 、颗粒状结构增多 ,且易
于愈伤组织的分化 ,提高了植株的再生频率[ 15] 。据
此 ,作者通过 L9(34)正交实验筛选出适宜于杜衡叶
柄愈伤组织诱导的培养基为添加 1.00mg· L-1 6-
BA、0.30 mg· L-1 NAA和 1.00 mg· L-1 2, 4-D的
MS培养基(包含 6.5 g· L-1琼脂和 30 g· L-1蔗糖 ,
pH5.8 ～ pH6.0)。
通过 L9(34)正交实验筛选出适宜于杜衡叶柄愈
伤组织分化和不定芽增殖的培养基为添加 3.00
mg·L-1 6-BA、0.10 mg· L-1IBA和 0.30 mg· L-1
NAA的 MS培养基(含 6.5 g· L-1琼脂和 30 g· L-1
蔗糖 , pH5.8 ～ pH6.0)。 NAA可以促进愈伤组织的
分化 ,使分化率提高;6-BA是愈伤组织分化过程中
常用的植物激素 ,可以使愈伤组织分化出较多的不定
芽 ,且芽密 、呈丛状 ,但不定芽细高且瘦弱;而 IBA可
以弥补 6-BA的这一缺点 ,起到壮苗的作用 ,且能促
进试管苗的生根 。因此 ,在愈伤组织分化培养基中同
时添加适量的 6-BA、NAA和 IBA这 3种外源植物激
素 ,对杜衡叶柄愈伤组织分化以及不定芽增殖均具有
良好的促进效应 。
本研究结果为产业化生产杜衡提供了理论指导 ,
不仅对杜衡药用功能的进一步开发利用具有重要价
值 ,也对珍稀动物———中华虎凤蝶的保护工作具有实
际意义 。
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