全 文 ：第 36卷 第 3期 西 南 林 业 大 学 学 报 Vol． 36 No． 3
2016年 6月 JOUＲNAL OF SOUTHWEST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Jun． 2016
doi:10． 11929 / j． issn． 2095－1914． 2016． 03． 009
牛角瓜组培快繁过程中生理生化指标的变化
唐军荣1，2 郑 元1 刘惠民1 马焕成1 陈 诗1 刘忠美1
(1． 西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南 昆明 650224;
2． 西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650224)
摘要:以牛角瓜组培苗为材料，对牛角瓜组培快繁过程中不同阶段的几种生理生化指标进行了测
定，为其组培器官发生的调控提供依据。结果表明:牛角瓜增殖和生根过程中的形态变化与
SOD、POD、CAT活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量存在一定的相关性;在增殖过程中 SOD 活
性变化先升后降，POD活性变化规律总体呈现下降趋势，CAT 的活性变化呈现上升趋势，可溶
性蛋白含量变化先降后升，可溶性糖含量呈上升趋势。在生根过程中 SOD、POD 和 CAT 酶的活
性变化趋势基本一致，总体呈现“上升—下降—上升”，可溶性蛋白含量总体变化趋势为“升高
—下降—缓慢升高”，可溶性糖含量总体变化趋势为先缓慢升高，后又缓慢下降。
关键词:牛角瓜;抗氧化酶活性;可溶性蛋白;可溶性糖;组培快繁
中图分类号:S723．1 文献标志码:A 文章编号:2095－1914(2016)03－0049－05
Changes of Physiological and Biochemical Index of
Calotropis gigantea in the Process of Tissue
Culture and Ｒapid Propagation
Tang Junrong1，2，Zheng Yuan1，Liu Huimin1，Ma Huancheng1，Chen Shi1，Liu Zhongmei1
(1． Key Laboratory of State Forestry Administration for Biodiversity Conservation in Southwest China，Southwest Forestry University，
Kunming Yunnan 650224，China;2． Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement ＆ Propagation in Universities
of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China)
Abstract:Taking tissue culture seedling of Calotropis gigantea as the material，some physiological-biochemical
index were studied during different growth periods in the process of tissue culture and rapid propagation，and it pro-
vided the basis for the regulation of the morphology of plants organs． The results were as follows:There were some
relationships between the morphosis and the activity of SOD，POD，CAT and the content of soluble sugar and solu-
ble protein in the stage of proliferation and rooting． During the proliferation stage，SOD activity was first increased
and then decreased，and POD activity showed a declining tendency as a whole，and CAT activity showed an in-
creasing tendency，and the content of soluble protein was firstly decreased and then increased，and the content of
soluble sugar was increased． During the rooting stage，activity of SOD，POD and CAT showed a same tendency of
“rise-fall-rise”，and the content of soluble protein was firstly increased，then decreased and finally increased slow-
ly，and the content of soluble sugar was firstly increased slowly and then decreased slowly．
Key words:Calotropis gigantea;anti-oxidant enzyme activity;soluble protein;soluble sugar;tissue culture
and rapid propagation
收稿日期:2015－10－14
基金项目:国家林业局林业公益性行业项目 (201304810)资助;西南林业大学云南省省级重点学科 (林学)资助;西南地区生物多样
性保育国家林业局重点实验室开放基金资助。
第 1作者:唐军荣 (1982—)，男，讲师。研究方向:植物快繁和育种。Email:306740911@ qq．com。
通信作者:刘惠民 (1957—)，男，教授。研究方向:经济林培育。Email:hmliu@ swfc．edu．cn。
牛角瓜 (Calotropis gigantea)属萝藦科 (Ascle-
piadaceae)牛角瓜属 (Calotropis)直立灌木，产于
云南、四川、广西和广东等省区，生长于低海拔
向阳山坡、旷野地及海边［1］。牛角瓜的光合特性
研究显示，牛角瓜对高温、高光照具有较强的耐
性［2］，其种子采用水浸处理能有效提高种子发芽
率［3］。牛角瓜的果实纤维属天然纤维，是一种新
型生态环保的纺织材料，具有广阔的开发前景［4］。
植物生长是通过细胞分裂和伸长完成的，不同
的生长发育时期，其生理生化方面的性质也会发生
相应的变化，对组培苗形态发生过程中生理生化的
变化研究，有助于观察分析组培过程中组织的形成、
分化、发育。目前，对该项研究已有较多报道，如
周洁［5］通过研究沙棘(Hippophae rhamnoides)组培苗
生根的生理生化机制，为提高沙棘组培苗生根率提
供了重要依据;张有铎等［6］对菜用大黄 (Ｒheum
rhaponticum )组培苗不同生根培养阶段的形态指标
和生理指标进行了观察研究，探讨了生理生化指标
与组培苗移栽成活率之间的关系;郎贤波［7］对树莓
(Ｒubus corchorifolius)茎段增殖和发根过程中主要生
理指标变化与形态发生的相关性进行了探讨，对树
莓的组培苗生产具有积极指导意义。对于牛角瓜的
组培研究，李克烈等［8］以牛角瓜的叶片为外植体，
开展了牛角瓜的组织培养研究，通过叶片诱导出愈
伤组织，最后分化出不定芽，试管苗生根培养后，
其移栽成活率可达 85%以上，而关于牛角瓜组培过
程中的生理生化指标研究则未见相关报道。试验以
前期建立的牛角瓜离体快繁体系为基础，分析牛角
瓜组培过程中不同时期生理生化指标的变化，探讨
牛角瓜组培过程中这些生理生化指标与增殖、生根
的关系，为牛角瓜组培苗的离体再生提供理论依据，
并为进一步遗传转化和倍性育种奠定坚实的基础，
同时也对其他木本植物形态建成条件的探索，调
控离体器官形态发生等具有实际意义。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
在牛角瓜组培过程中的增殖和生根阶段，分
别取组培苗作为试验材料。
1. 2 方法
1. 2. 1 样品采集
1)增殖阶段:增殖培养基为 MS+1. 0 mg /L
6-BA+0. 1 mg /L NAA+30 g /L白砂糖+5. 1 g /L 琼脂
粉，pH为 5. 8。每瓶接种 4 枚茎段，在相同条件
(光照、温度)下进行培养，分别在接种后第 20 d
(不定芽形成)、30 d (不定芽伸长生长)和 40 d
(不定芽木质化)时进行取样，称取完后备用。试
验重复 3次，取样 3次。
2)生根阶段:生根培养基为 1 /2MS+0. 2 mg /L
IBA+15 g /L白砂糖+5. 1 g /L 琼脂粉+0. 1 g /L 活性
炭，pH值为 5. 8，培养条件同上，每瓶接种 4 株。
生根培养分别于接种时第 14 d (不定根形成)、24 d
(不定根伸长生长)和 30 d (不定根木质化)时进行
取样，称取完后备用。试验重复 3次，取样 3次。
1. 2. 2 测定方法
具体方法［9－10］:超氧化物岐化酶 (SOD)、过
氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶 (CAT)的活性采用
分光光度计法测定，可溶性蛋白含量采用紫外吸
收法测定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定。
1. 2. 3 数据处理
试验数据采用 Excel 2003 和 SPSS 17. 0 进行统
计分析。
2 结果与分析
2. 1 增殖过程中生理生化变化
2. 1. 1 增殖过程中 SOD、POD、CAT的酶活性变化
牛角瓜在增殖时，根据形态变化大致划分为 3
个部分，20 d以前以不定芽形成为主，在 21 ～ 30 d
时以不定芽的伸长生长为主;在 31～40 d时以营养
物质积累为主。外部形态及内部的酶活性都发生
着相应的变化，见图 1。
由图 1可知，SOD呈倒“V”字型变化，不定芽
的伸长生长阶段时 SOD活性最高，这说明牛角瓜在
形成不定芽时，细胞内产生的活性氧少，而对超氧
阴离子自由基等活性氧具有清除能力的 SOD活性也
低。当处于伸长生长阶段时超氧阴离子自由基等活
性氧含量增加，诱导 SOD 酶的活性相应达到最大，
因而更好的诠释了 SOD与不定芽的形成和伸长生长
关系紧密。POD 在整个增殖阶段一直呈下降趋势，
在启动阶段，芽原基已经大量形成，不定芽开始大
量产生，此时 POD活性最高，POD能使组织中所含
的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度。
因此，随着芽体的伸长生长，增殖过程的不断进行，
POD活性开始出现下降，表明组培苗在前期活动较
为剧烈，不断进行新芽的分化。而 CAT含量随着培
养时间的增长则表现出缓慢上升的趋势，表明随着
CAT活性的增加，其对 H2O2的清除能力也在增加，
能够减少细胞内的活性氧，使组培苗免受伤害。
05 西 南 林 业 大 学 学 报 第 36卷
图 1 牛角瓜增殖阶段的酶活性变化
Fig. 1 The changes of enzyme activity in the proliferation stage
2. 1. 2 增殖过程中可溶性蛋白含量变化
可溶性蛋白含量变化见图 2。在不定芽形成
期，蛋白质含量最高，说明此时增殖材料代谢活
跃，为不定芽的分化提供充足的蛋白质;随着不
定芽的生长，此时，蛋白质大量消耗，含量开始
快速下降，到最后趋于平稳，表明体内共需达了
平衡。蛋白质是细胞的重要组成成分，在细胞的
生命活动中起重要作用。在不定芽形成期，新的
蛋白质还没有合成，而细胞启动所需的物质是由
细胞内原有可溶性蛋白质转变而来;随着不定芽
的生长，对蛋白质的消耗量增加，从而使得牛角
瓜可溶性蛋白质含量呈下降趋势;到后期，牛角
瓜的不定芽生长缓慢，木质化程度增加，细胞合
成的大量蛋白质超过了不定芽的需要量，即可溶
性蛋白含量呈现出上升趋势。
图 2 增殖过程中可溶性蛋白含量变化
Fig. 2 The changes of soluble protein content
in the process of proliferation
2. 1. 3 增殖过程中可溶性糖含量变化
可溶性糖是光合作用的初级产物，也是植物
体内多糖、蛋白质等大分子化合物合成的基础，增
殖过程中可溶性糖含量变化见图 3。由图 3 可知，
在牛角瓜增殖过程中，牛角瓜组培苗可溶性糖含
量变化先趋于平缓，后期表现出快速上升。糖类
物质在增殖过程中的变化，将直接反映牛角瓜在
形态结构上的变化情况，在不定芽形成及伸长生
长阶段，可溶性糖的消耗和产生基本维持平衡，
后期含量逐渐升高，可能是随着组培苗的生长发
育，可溶性糖得到大量的积累。
图 3 增殖过程中可溶性糖含量变化
Fig. 3 The changes of soluble sugar content
in the process of proliferation
2. 2 生根过程中生理生化变化
2. 2. 1 生根过程中 SOD、POD、CAT的酶活性变化
将增殖结束后的牛角瓜组培苗进行生根培养，
在生根过程中形态变化见表 1，酶活性变化见图 4。
酶活性的总体变化趋势为先升后降，最后再上升。
当无根组培苗接种到生根培养基后，原有的生长状
态被打破，导致 SOD活性升高;随着不定根的形成
和伸长生长，新的平衡状态得以形成，酶活性下降;
但又由于后期根系伸长生长后，组培苗在营养和空
间方面产生了竞争，使得酶活性又逐渐升高。POD
的变化趋势是先上升，后缓慢下降，之后又开始升
高，因为在根的起源和生长过程中 POD主要通过氧
化 IAA而起作用，根未形成时 POD的活性处在较低
水平，降解 IAA能力弱，使内源 IAA得到积累，对
诱导根原基有利，随着根系长出，POD活性迅速增
加，降解 IAA作用增强，IAA 水平下降，有利于根
原基的生长和根的发育。CAT 活性的变化趋势为先
上升，后下降，最后缓慢上升。当根开始伸长生后，
植株能够通过根系大量从培养基中吸收营收，不利
状态得以改变，使得 POD 和 CAT 出现降低;后期
生长速度加快，在一定条件下，组培苗之间产生营
养和空间竞争，CAT、POD活性又出现了升高。
15第 3期 唐军荣等:牛角瓜组培快繁过程中生理生化指标的变化
图 4 生根过程中的酶活性变化
Fig. 4 The changes of enzyme activity in the process of rooting
表 1 牛角瓜的生根过程中的形态变化
Table 1 The changes of Calotropis gigantea morphology
in the process of rooting
测定
时间
平均根数
/根
平均根长
/ cm
苗高
/ cm
生根率
/%
接种时 0 0 2. 0 ± 0. 18 —
14 d 10 ± 0. 58 1. 8 ± 0. 12 2. 5 ± 0. 26 95
24 d 21 ± 1. 53 2. 5 ± 0. 43 4. 1 ± 0. 33 100
30 d 26 ± 2. 43 3. 1 ± 0. 25 6. 8 ± 0. 31 100
2. 2. 2 生根过程中可溶性蛋白含量变化
可溶性蛋白虽只占蛋白质的一部分，但是生
物体能吸收利用的主要是可溶性蛋白，它在生命
体活动中发挥着运输协调、免疫保护、产生和传
导神经活动、控制生长分化等功能。由图 5 可知，
牛角瓜组培苗可溶性蛋白含量变化先升高，然后
缓慢下降，之后又呈现缓慢上升趋势。后期酶活
性的升高，其抵抗力增加，有利于蛋白的合成，
则可溶性蛋白含量升高。说明在生根的不同时期，
牛角瓜组培苗可溶性蛋白的表达量不一致，而这
些可溶性蛋白可能对根的形成有一定的促进作用。
图 5 生根过程中可溶性蛋白质含量的变化
Fig. 5 The changes of soluble protein content
in the process of rooting
2. 2. 3 生根过程中可溶性糖含量变化
由图 6可知，牛角瓜组培苗可溶性糖含量变化
先缓慢上升，后缓慢下降，可溶性糖含量变化幅
度小。由于组培苗刚接种在生根培养基上时，其
切口处受到生长素的刺激，在切口处慢慢形成根
原基，同时牛角瓜的可溶性糖在慢慢的积累，用
于前期根的诱导需求;根系长出后，根的伸长生
长和苗高的生长需要大量能量，导致自身贮备的
可溶性糖开始降低。另一方面，生根苗已经可以
通过根系从培养基中快速获取营养，并满足自身
部分需求，一定程度上使得下降趋于平缓。
图 6 生根过程中可溶性糖含量的变化
Fig. 6 The changes of soluble sugar content
in the process of rooting
3 结论与讨论
在植物组培过程中，组培苗的外部形态变化
受培养基种类、继代周期、培养条件等影响，在外
部形态的变化过程中，其内部相关的生理生化指标
也会呈现出规律性变化。组培苗在培养过程中，其
培养基中的激素对组培苗影响最大，特别是分裂素
与生长素的比值决定了组培苗的生长发育方向。由
于激素的添加，导致了组培苗原有的激素水平被破
坏，使组培苗处于一定的逆境中，为了适应新的环
境，其酶活性等指标也不断发生着变化。超氧化物
歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD)和过氧化氢酶
(CAT)在植物体内普遍存在，并相互协调，清除植
物体内过剩的自由基，使自由基维持在一个低水平
上，有效防御活性氧对生物体的毒害作用，从而防
止自由基对植物细胞造成伤害［11－12］。不定芽的形态
25 西 南 林 业 大 学 学 报 第 36卷
发生和早期芽原基的形成与过氧化物酶、可溶性糖、
可溶性蛋白的含量有一定的相关性［13］。此外，可溶
性糖作为一种能源消耗物质，在植物不定芽发生时，
为新陈代谢活跃的胚细胞提供充足的能源，反映了
体内作为有效营养物的碳水化合物和能量水平［14］。
牛角瓜的生理生化指标在组培过程中的变化
情况为:在增殖阶段，SOD呈先升后降趋势，POD
呈下降趋势，CAT 呈上升趋势，可溶性蛋白含量
呈先降后缓慢上升趋势，可溶性糖的含量则一直
呈上升趋势;在生根过程中，SOD、POD和 CAT酶
活性的总体变化规律相对较一致，先升后降，最后
又上升，可溶性蛋白含量则呈“上升—下降—缓慢
上升”的趋势，可溶性糖含量先缓慢上升，后又缓
慢下降，变化幅度小。牛角瓜增殖过程中 CAT活性
的变化趋势与鹅掌楸 (Liriodendron chinese)组织培
养中增殖时的 CAT 变化趋势一致，但可溶性糖含
量的变化则不相同，这可能与植物种类或者添加
的激素种类有关［15］。沙棘组培苗生根过程中，
POD呈现先上升后下降，再上升的变化趋势，但
其活性较低，表明植物生长调节物质可以通过调
节体内氧化酶活性来促进不定根的形成［5］，这也
与本研究的结果相似。此外，牛角瓜组培苗生根
过程中的可溶性糖含量变化与王瑞等［16］对油茶
(Camellia oleifera)的组培苗生根研究结果一致;
另外，在虎耳兰的植株再生时，叶片愈伤组织的
诱导，以及后期不定芽的产生及生长阶段，其体
内的可溶性蛋白也发生着相应的动态变化［17］。
牛角瓜在组培过程中，由于激素的刺激，导
致其形态发生了变化，增殖阶段表现为不定芽的
形成、伸长生长和木质化;而在生根阶段，则表
现为不定根的形成、伸长生长及木质化。这些形
态变化之前，其生理生化指标已发生，外部形态
和内部生理指标间存在着较大的关联性，因此，
其研究结果对于牛角瓜优良单株离体再生体系的
建立及优化，都具有一定的理论指导性。为了更
好地提示组培过程中各个环节的动态变化，今后
可以借助切片技术从细胞水平更加直观地观察其
细胞结构变化与外部形态变化的相关性。
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(责任编辑 韩明跃)
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