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新疆濒危植物盐桦试管苗生根培养的研究



全 文 :新疆濒危植物盐桦试管苗生根培养的研究
梅新娣 ,马纪 ,张富春
(新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 ,新疆生物资源基因工程重点实验室 ,新疆乌鲁木齐 830046)
摘 要:采用 L27(313)正交试验方法探讨了培养基种类A、植物生长调节剂及其不同浓度配比 B、蔗糖量 C、培
养的光照条件 D四因素对诱导盐桦生根(平均根长 、生根系数 、生根率)的影响。结果表明 , 生长素 B、生长素
×培养基(A×B)对生根系数有极显著的影响 ,培养基 A、生长素 B、生长素×培养基(A×B)仅对平均根长有
极显著的影响 ,四个因子对生根率均无显著的影响。研究获得诱导盐桦平均根长的优化培养基为 A2B1C3D1
(即 S27 处理)MS+NAA 0.2 mg/ L+蔗糖10 g/ L+琼脂7%,诱导盐桦生根系数优化培养基为 A3B2C3D2(与处理
S21的 A3B2C3D3相似)1/2MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖 30 g/ L+琼脂 7%+暗光处理 3 d , 诱导盐桦生根率的优化
培养基为 A2B3C1D1(即 S10 处理)MS+IAA 0.2 mg/ L+蔗糖 30 g/L+琼脂 7%。最佳生根培养基为:1/2MS+
IBA 0.5mg/ L+蔗糖 30 g/L+琼脂 7%+暗光处理 3 d。其生根系数高达 5.308 , 生根率高达 96.30%以上。
关键词:濒危植物;盐桦;正交试验;试管苗生根
中图分类号:S792.15;S722.37   文献标识码:A   文章编号:1001-4330(2006)03-0218-06
Rooting Cultivation of Rare Endangered Plant Betula halophila in Vitro
MEI Xin-di ,MA Ji , ZHANG Fu-chun
(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering ,Key Laboratory of Molecular Biolo-
gy , College of Life Science and Technology , Xinjiang University ,Urumqi 830046 , China)
Abstract:The four factors , such as A type of culture medium , B different concentrations of plant regulators ,
C content of sucrose , and D illumination condition , were tested for their effects on rooting of seedling of rare en-
dangered plant Betula halophila in vitro in rooting coefficient , rooting rates and the average rooting length by
orthogonal experiment method of L27(313).The results showed B and B×A had significant effect on rooting co-
efficient and the average rooting length , A has significant effect on the average rooting length.The rooting coefficient
and the average rooting length had no significant difference as D and C were changed.The rooting rate had no sig-
nificant difference as the four factors were changed.Based on these results , the optimizationmedium are as follows:
A2B1C3D1(S27:MS +NAA 0.2 mg/L + sucrose 10 g/L)is the best medium for the average rooting length ,
A3B2C3D2(similar to S21-A3B2C3D3)(1/2MS+IBA 0.5 mg/L+sucrose 30 g/L+three or seven days in dark )
for rooting coefficient , and A2B3C1D1(S10:MS+IAA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L)for rooting rates.
Key words:rare endangered plant;Betula halophila;orthogonal experiment;rooting of seedling in vitro
盐桦(Betula halophila)是桦木科桦木属植物[ 1] 。1984年 ,被列为国家二级珍稀濒危植物 。1999年
被列为国家重点保护野生植物(二级)。陶玲等以分布区 、分类学地位 、生物学特性和利用价值 4个指标
对中国 50种荒漠植物进行珍稀濒危程度的综合定量评价 ,结果表明盐桦的综合评价值最高 ,定性描述
为珍贵濒危植物 ,列为1级保护[ 2] 。盐桦仅存于我国新疆阿勒泰地区 ,为新疆特有的濒危种 ,现已很难
见到[ 3] ,一旦灭绝 ,将在我国乃至世界植物名录上永远消失 。因此 ,对其进行研究保护是当务之急 。
2003年10月从新疆阿勒泰阿拉哈克乡盐湖边采集了少量盐桦枝条 ,以其休眠芽做外植体 ,进行组
织培养 ,诱导出试管丛生芽 ,并继代培养获得了试管无性系[ 4~ 5] 。而实现盐桦自根苗的快速繁殖 ,培养
出完整的植株必须诱导其生根 。据文献报道 ,影响木本植物试管苗生根的因素主要有四个[ 6] ,即在前期
的研究基础上 ,采用 L27(313)正交试验探讨了培养基种类 、植物生长调节剂及其不同浓度配比 、蔗糖量 、
培养的光照条件四个因素对诱导盐桦生根的影响 ,以获得诱导盐桦生根的最佳条件 。
收稿日期:2005-10-31
作者简介:梅新娣(1970-),女 ,江苏人 ,讲师 ,硕士 , 研究方向:植物生物技术 ,(E-mai l):mxdxju@126.com;通讯作者:张富春(1962-),
男 ,河南人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:生物化学与分子生物学 ,(E-mail)zfcxju@xju.edu.cn.
基金项目:国家科技攻关西部科技行动项目(2001BA901A32)和国家“ 863”项目(2004AA227110-2)
新疆农业科学 2006 ,43(3):218-223
Xinjiang Agricultural Sciences
                            
1 材料与方法
1.1 材 料
盐桦外植体采集于阿勒泰阿拉哈克乡盐湖边 。
1.2 方 法
1.2.1 试管丛生芽诱导 试管丛生芽的获得[ 4] 。
1.2.2 生根培养正交实验设计 按 L27(313)设计了4因素3水平的正交实验[ 7 ,8] 。分别配制 27种不同
处理的培养基 200 mL ,分装于 10瓶100 mL 三角瓶中 ,高压灭菌后 ,将木质化程度适中的单个芽或茎段接
种于不同处理组合的培养基上 ,每瓶接 5个茎段 ,置25±2℃,12 ~ 16 h 2 000 lx光照条件下培养 。表1 ,2
表 1 生根培养的因素及其水平
Table 1 Factors and their levels in experiment
因素水平
Factor Level
A培养基种类
Type of culture medium
B生长调节剂及其浓度(mg/L)
Hormone and concentration
C蔗糖量(g/L)
Sucrose concentration
D培养的光照条件(暗光天数)
Illumination condition(days in dark)
1 WPM IAA 0.2 10 0
2 MS IBA 0.5 20 3
3 1/ 2MS NAA 0.2 30 7
1.2.3 生根培养结果统计 培养 22 d后[ 9]统计生根率(生根率=有生根现象的茎段数/接种茎段数×
100%)、生根系数(生根系数=生根条数/有生根现象的茎段数)、平均根长 ,并对实验数据进行方差分析
和 Q 检验[ 9] 。
1.2.4 生根培养的二次优化 得到三种较好生根培养基 ,在此基础上对之二次筛选 。
1.2.5 试管苗的移栽炼苗 移栽炼苗过程[ 6] 。
2 结果与分析
2.1 正交表 L27(313)试验结果(表 2)
表 2 L27(313)正交试验处理组合与结果统计
Table 2 Treatments and statistics of L27(313)orthogonal experiment
序号
No.
培养基
Medium
生长素
Hormone
蔗糖
Sucrose
暗光天数
Days in dark
瓶数
No.of bott les
外植体数
No.of explants
平均根长(cm)
Average rooting length
生根系数
Rooting coefficient
生根率(%)
Rooting Rates
S1 WPM IAA 0.2 10 0 7 15 2.545 9 1.522 2 82
S2 WPM IAA 0.2 20 3 9 18 2.434 5 1.733 3 69
S3 WPM IAA 0.2 30 7 10 20 2.041 1 1.958 3 89
S4 MS IBA 0.5 10 7 8 19 1.035 2 1.912 7 88
S5 MS IBA 0.5 20 0 7 15 1.740 3 3.194 4 92
S6 MS IBA 0.5 30 3 9 19 1.296 5 3.659 5 83
S7 1/ 2MS NAA 0.2 10 3 10 20 1.022 2 3.694 4 94
S8 1/ 2MS NAA 0.2 20 7 10 22 1.179 5 2.530 6 86
S9 1/ 2MS NAA 0.2 30 0 10 20 1.213 9 3.402 8 100
S10 MS NAA 0.2 10 0 7 17 2.252 7 3.340 7 100
S11 MS NAA 0.2 20 3 9 19 1.970 1 3.745 4 100
S12 MS NAA 0.2 30 7 8 17 2.225 4 4.027 8 78
S13 1/ 2MS IAA 0.2 10 7 9 18 1.766 7 1.936 5 88
S14 1/ 2MS IAA 0.2 20 0 8 18 2.405 6 1.904 8 65
S15 1/ 2MS IAA 0.2 30 3 9 19 2.491 7 1.800 0 84
S16 WPM IBA 0.5 10 3 9 19 2.060 3 3.140 5 84
S17 WPM IBA 0.5 20 7 7 14 2.070 0 3.527 8 100
S18 WPM IBA 0.5 30 0 7 15 2.722 0 3.655 6 92
S19 1/ 2MS IBA 0.5 10 0 10 20 0.827 8 4.425 0 94
S20 1/ 2MS IBA 0.5 20 3 9 18 0.961 5 4.544 4 89
S21 1/ 2MS IBA 0.5 30 7 9 18 1.237 4 5.083 3 78
S22 WPM NAA 0.2 10 7 8 17 1.161 4 3.261 9 89
S23 WPM NAA 0.2 20 0 8 17 2.447 0 4.492 1 92
S24 WPM NAA 0.2 30 3 9 20 1.988 0 4.265 1 90
S25 MS IAA 0.2 10 3 9 18 2.937 5 2.075 4 96
S26 MS IAA 0.2 20 7 9 21 3.047 4 1.746 0 92
S27 MS IAA 0.2 30 0 10 21 3.659 9 1.992 0 93
·219·3期       梅新娣等:新疆濒危植物盐桦试管苗生根培养的研究           
2.2 影响平均根长的结果分析
为了弄清各因素对平均根长产生影响的相对大小 、主次效应及最佳组合 ,分别对其进行极差分析 、
方差分析和 Q 测验 。
各因子和交互作用的主次顺序为:生长素 B>培养基 A>生长素×培养基 A×B>光照 D>蔗糖 C。
D 、C的 F 值=3.368/2.589<3.890 ,差异不显著 ,故D 、C 取任何水平对平均根长的影响均无显著差异 ,
极差分析表明 ,D选 D1 最合适 ,C 选 C3 最合适 。A 、B 、A×B 对平均根长的影响有极显著差异 ,故需对
A 、B 、A×B各水平作 Q 测验 。B1显著优于 B2 ,B2与 B3 之间差异不显著 ,故 B 选 B1 最合适;A1 、A2和 A3
之间差异不显著 ,A2B1 条件下平均根长最长 ,故 A选A2 最合适。综上所述 ,对平均根长而言 ,最佳组合
是A2B1C3D1(即S27处理)。表 3 ~ 6
表 3 盐桦试管苗平均根长 、生根系数 、生根率的正交
Table 3 Range analysis of the average rooting length in vitro
seedling , rooting coefficient and rooting rates
列号 RankNO. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
因素 Factors A×B A B C AC D BC
平均根长极差分析
Analysis of R value to average rooting
length
K1 1.612 1.833 2.163 2.592 1.734 2.055 1.993 1.967 1.944 2.011 2.202 1.939 1.941
K2 2.218 1.815 2.241 1.550 2.028 2.035 1.969 1.881 2.013 1.915 1.907 1.953 1.972
K3 2.030 2.213 1.456 1.718 2.097 1.769 1.899 2.013 1.903 1.933 1.752 1.968 1.947
R 0.606 0.398 0.785 1.042 0.363 0.286 0.094 0.132 0.110 0.096 0.450 0.029 0.031
生根系数极差分析
Analysisof R value to rooting coefficient
 
 
K1 2.623 3.376 3.062 1.852 2.812 3.044 3.072 2.980 2.954 3.189 3.103 3.166 2.988
K2 3.009 2.936 2.855 3.683 3.047 3.024 2.967 2.909 3.041 2.951 3.184 3.120 3.276
K3 3.543 2.863 3.258 3.640 3.316 3.107 3.136 3.286 3.180 3.035 2.887 2.889 2.910
R 0.920 0.513 0.403 1.831 0.504 0.083 0.169 0.377 0.226 0.238 0.297 0.277 0.366
生根率极差分析
Analysis of R value to rooting Rates
 
 
K1 70.499 71.357 70.829 67.586 73.501 70.027 72.493 73.994 66.297 71.770 74.424 74.543 73.060
K2 73.544 68.289 75.297 71.936 72.140 70.241 69.410 73.902 75.153 68.782 71.238 69.019 71.494
K3 72.327 76.724 70.244 76.849 70.729 76.102 74.467 68.473 74.920 75.818 70.708 72.808 71.816
R 3.045 8.435 5.053 9.263 2.772 6.075 5.057 5.521 8.856 7.036 3.716 5.524 1.566
  注:K1 、K2 、K 3 ,分别表示各水平的平均值 , R 表示每一列的极差
Note:K 1 、K2 、K3 indicate average value of different levels , respectively , R indicates significance of each column
表4 盐桦试管苗平均根长的方差分析
Table 4 Variance analysis of average rooting length in vitro
变异来源
Origin of variation
自由度 DF 平方和 SS 方差 MS F F=0.05 F=0.01
培养基 A Medium A     2   3.363   1.681 5   13.01** 3.890 6.930
生长素 B Hormone B 2 5.637 2.818 5 21.8** 3.890 6.930
蔗糖 C Sucrose C 2 0.669 0.334 5 2.6 3.890 6.930
光照 D Illumination D 2 0.941 0.470 5 3.6 3.890 6.930
A×B 2 1.732 0.866 0 6.7** 3.890 6.930
A×C 2 0.047 0.023 5 0.2 3.890 6.930
B×C 2 0.004 0.002 0.01 3.890 6.930
误差 Error 12 1.550 0.129 2
总变异 Total 26 13.943
  注:**表示极显著水平 0.01
Note:** Indicate highly significant(P<0.01)
表 5 A 、B各水平平均根长均数多重比较
Table 5 Multiple comparison of A and B
B因素各水平均数多重比较
Multiple-comparisons of B levels
A因素各水平均数多重比较
Multiple-comparisons of A levels
水平
Levels
极差
Variance
差数(B2)
Margin
差数(B3)
Margin
水平
Levels
极差
Variance
差数(A3)
Margin
差数(A1)
Margin
B1 2.592 1.042** 0.874** A2 2.241 0.785** 0.078
B3 1.718 0.168 A1 2.163 0.707**
B2 1.550 A3 1.456
·220·               新疆农业科学                 43卷
表 6 A×B各水平平均根长均数多重比较
Table 6 Multiple comparison of Average rooting length of A×B
水平
Levels
平均根长
Average
rooting length
差数
(A3B2)
差数
(A 3B3)
差数
(A2B2)
差数
(A1B3)
差数
(A2B3)
差数
(A 3B1)
差数
(A1B2)
差数
(A1B1)
A2B1 3.215  2.206**  2.076**  1.858**  1.260**  1.006**  0.994**  0.931**  0.875**
A1B1 2.340 1.331** 1.201** 0.983** 0.475 0.191 0.119 0.056
A1B2 2.284 1.275** 1.145** 0.927** 0.419 0.135 0.063
A3B1 2.221 1.212** 1.082** 0.864** 0.356 0.072
A2B3 2.149 1.140** 1.010** 0.792* 0.284
A1B3 1.865 0.856** 0.726* 0.508
A2B2 1.357 0.348 0.218
A3B3 1.139 0.130
A3B2 1.009
2.3 影响生根系数的结果分析
为了弄清各因素对生根系数产生影响的相对大小 、主次效应及最佳组合 ,分别对其进行极差分析 、
方差分析和 Q 测验 。表 3 ,表 7 ~ 9
各因子和交互作用的主次顺序为生长素 B>生长素×培养基 A×B>蔗糖 C>培养基 A>光照 D。
D 、C 、A的 F 值=3.368/2.589<3.890 ,差异不显著 ,故认为 D 、C取任何水平对生根系数的影响均无显
著差异 ,极差分析表明 ,D选 D2 最合适 ,C选 C3 最合适 ,A选A3最合适 。F 测验表明 B 、A×B有极显著
差异 ,继而对 B 、A×B各水平作 Q 测验 , B1、B2与 B3之间差异不显著。结果表明 ,A3B2 条件下 ,生根系
数最大 ,故 B选 B2最合适 。综上所述 ,对生根系数而言 ,最佳组合是 A3B2C3D2(与处理 S21的A3B2C3D3
相似)。表3 ,表 7 ~ 9
表7 盐桦试管苗生根系数的方差分析
Table 7 Variance analysis of seedling rooting coefficient in vitro
变异来源
Origin of variation
自由度 DF 平方和 SS 方差 MS F F=0.05 F=0.01
培养基 A Medium A     2   0.731   0.365 5    1.4 3.890 6.930
生长素 B Hormone B 2 19.649 9.824 5 37.2** 3.890 6.930
蔗糖 C Sucrose C 2 1.144 0.572 2.2 3.890 6.930
光照 D Illumination D 2 0.424 0.212 0.8 3.890 6.930
A×B 2 3.839 1.919 5 7.3** 3.890 6.930
A×C 2 0.262 0.131 0.5 3.890 6.930
B×C 2 0.399 0.199 5 0.8 3.890 6.930
误差 Error 12 3.17 0.264 2
总变异 Total 26 29.618
  注:**表示极显著水平 0.01
Note:** Indicate highly significant(P<0.01)
表 8 B各水平生根系数均数多重比较
Table 8 Multiple-comparisons of B levels
水平 Levels 极差 Variance 差数(B1)Margin(B1) 差数(B3)Margin(B3)
B2 3.683 1.831** 0.043
B3 3.640 1.788**
B1 1.852
·221·3期       梅新娣等:新疆濒危植物盐桦试管苗生根培养的研究           
表 9 A×B各水平生根系数均数多重比较
Table 9 Multiple comparison of A×B in rooting coefficient
水平
Levels
生根系数
Rooting
coeffi cient
差数
(A2B1)
差数
(A 2B2)
差数
(A3B1)
差数
(A2B3)
差数
(A3B2)
差数
(A 1B1)
差数
(A1B3)
差数
(A1B2)
A3B2 4.684  2.946**  2.804**  2.746**  1.762**  1.475**  1.243**  0.979*   0.676
A1B3 4.006 2.268** 2.126** 2.068** 1.084* 0.797 0.565 0.301
A2B3 3.705 1.967** 1.825** 1.767** 0.783 0.496 0.264
A1B2 3.441 1.703** 1.561** 1.503** 0.519 0.232
A3B3 3.209 1.471** 1.329** 1.271** 0.287
A2B2 2.922 1.184** 1.042* 0.984*
A2B1 1.938 0.200 0.058
A3B1 1.880 0.142
A3B3 1.738
2.4 影响生根率的结果分析
为了弄清各因素对生根率产生影响的相对大小 、主次效应及最佳组合 ,分别对其进行极差分析 、方
差分析和 Q测验。
不同处理组合的生根率 ,将所得数据先进行反正弦转换 ,然后作 F 测验。各因子和交互作用的主
次顺序为生长素 B>生长素×蔗糖A×C>B×C>培养基A>光照 D>蔗糖 C。培养基A 、生长素种类
及浓度B 、蔗糖量C 、暗光处理 D对生根率的影响均无显著差异 。结合极差大小 ,C选C1最合适 ,D选D1
最合适。A选A2 最合适 , B选 B3 最合适。综上所述 ,对生根率而言 ,最佳组合是 A2B3C1D1(即 S10处
理)。表 2 ~ 3 ,表 10
表 10 盐桦试管苗生根率的方差分析
Table 10 Variance analysis of seedling rooting rates in vitro
变异来源
Origin of variation
自由度 DF 方差 MS 平方和 SS F F=0.05 F=0.01
培养基A Medium A 2   137.483   68.741 5    0.6   3.890   6.930
生长素 B Hormone B 2 386.618 193.309 1.8 3.890 6.930
蔗糖C Sucrose C 2 34.587 17.293 5 0.2 3.890 6.930
光照 D Illumination D 2 72.748 36.374 0.3 3.890 6.930
A×B 2 42.297 21.148 5 0.2 3.890 6.930
A×C 2 224.431 112.215 5 1.0 3.890 6.930
B×C 2 143.662 76.831 0.7 3.890 6.930
误差 Error 12 1 309.77 109.147 5
总变异 Total 26 2 351.596
  注:**表示极显著水平 0.01
Note:**Indicate very significant(P<0.01)
2.5 二次优化生根培养的结果分析
根据前面的实验 ,选取上述三种生根培养基二次优化实验.每一处理接种 50个茎段 ,20d后统计分
析结果如下。
S10:MS +NAA 0.2 mg/L+蔗糖10 g/L+琼脂 7%。
S21:1/2MS + IBA 0.5mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 7%+暗光处理 3 d。
S27:MS + IAA 0.2 mg/L +蔗糖 30 g/L+琼脂 7%。
S27虽生根率较高 ,但生根系数较低 ,根稀少而长 ,茎节短 、粗 ,茎基部无愈伤组织形成 ,有利于移栽
后的成活;S10生根系数上升 ,但生根率下降 ,根稀少而长 ,茎节高大 、粗壮 ,叶片大 、薄 、绿 ,茎基部无愈
伤组织形成 ,有利于移栽后的成活;S21虽然生根率不是最高 ,但生根系数最高 ,根短 、粗 、须根多 ,且无
·222·               新疆农业科学                 43卷
愈伤组织形成 ,也有利于移栽后的成活 。因此 ,生根培养基的最佳配方应为 S21:1/2MS+IBA0.5 mg/L
+蔗糖30 g/L+琼脂 7%+暗光处理3 d。表 11 ,图 1 ~ 6(封三)
表 11 不同生根培养基的比较与方差分析
Table 11 Comparison and variance analysis of various rooting mediums
培养基
Rooting medium
生根率(%)
Rooting rates
0.05显著水平
significance level
0.01显著水平
significance level
培养基
Rooting medium
生根系数
Rooting coefficient
0.05显著水平
significance level
0.01 显著水平
significance level
S27 96.68 a a S21 5.308 a a
S21 96.30 ac ac S10 4.289 ac ac
S10 92.68 b B S27 1.949 b b
3 结论与讨论
3.1 植物组培育苗在濒危植物的营救以及种质资源的保存等方面有着不可替代的地位。目前国内学
者已开展了一些濒危植物组织培养研究工作 ,如雪莲[ 10] 、沙冬青[ 11] 、半日花 、四合木 、蒙古扁桃[ 12]等 ,挽
救了濒危植物 ,建立了濒危植物基因库 ,为体细胞杂交研究 、生产次生代谢物及人工种子的开发利用奠
定了基础 ,同时 ,也为今后珍稀濒危植物的推广应用提供了必要的条件 ,具有重要的经济和社会效益。
3.2 盐桦为新疆特有的濒危种 ,仅存于新疆阿勒泰地区 ,是一种抗盐能力极强的树种 ,建立盐桦组培体
系可望营救 、保存盐桦种质资源 ,并为抗盐生理的研究以及盐碱地的造林绿化提供优质苗木。通过研究
表明 ,生长素 B和生长素×培养基(A×B)对平均根长 、生根系数影响极显著 ,培养基类型仅对平均根长
有极显著影响 ,而蔗糖 、暗培养对平均根长无显著影响 。这四个因素对生根率的影响未达到显著水平。
故得出诱导盐桦平均根长的培养基最佳组合是A2B1C3D1(即 S27处理),诱导盐桦生根系数的培养基最
佳组合是A3B2C3D2(与处理 S21的A3B2C3D3相似), 诱导盐桦生根率的培养基最佳组合是 A2B3C1D1(即
S10处理)。最佳生根培养基的配方为:S21:1/2MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 7%+暗光处理
3 d。
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·223·3期       梅新娣等:新疆濒危植物盐桦试管苗生根培养的研究