全 文 ： 资源研究
收稿日期:2006-07-25。
基金项目:国家自然科学基金项目 (30460015)、教育部春晖计划项目
(Z 2004-2-65036)和新疆自治区重点实验室开放课题
(XJDX 0201-2004-04)。
作者简介:曾幼玲(1971 ～ ),女 ,副教授 ,博士研究生;主要从事资源植
物生物技术和抗逆生理生化方面的研究。
通讯作者:张富春 , E-m ail:zfcxju@x ju. edu. cn,
一种快速提取盐桦叶片总 RNA的方法建立
曾幼玲　邓爱华　曹文尧　张富春
(新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 /
新疆生物资源基因工程重点实验室　乌鲁木齐　 830046)
摘要:从植物组织中提取高质量的 RNA是进行植物分子生物
学研究的必要前提和关键。盐桦细胞中存在大量的胶质和多
糖类物质 , 用 T rizo l试剂根本不能获得 RNA。 本研究采用
CTAB-L iC l法 , 提出了一种适合盐桦叶片总 RNA的简单快速提
取方法。消除了蛋白质 、DNA、多糖 、多酚等污染。该方法提取
的盐桦叶片总 RNA, 完整性好 、纯度高 ,可用于 RT-PCR等实验
操作 , 此法无需特殊试剂和贵重仪器 , 实验结果稳定 , 重复性
好 , 适合富含多糖和脂质的植物组织总 RNA的提取。
关键词　盐桦叶片　总 RNA　提取　RT-PCR
盐桦 (Betu la halophi la )是桦木科桦木属植
物 [ 1] ,是原生地已濒危灭绝的小乔木树种 ,仅存在于
新疆阿勒泰地区 ,是一种抗盐能力非常强的盐生荒漠
植物 ,被列为国家 Ⅱ级重点保护野生植物 [ 2, 3] 。盐桦
作为新疆特有的濒危种 ,现已很难见到[ 4] ,因此对其
进行种质资源和基因资源的保护和研究是当务之急。
核糖核酸(RNA)是对盐桦进行分子生物学研究的重
要材料之一 。目前较为成熟的分离 RNA的方法有许
多 ,用于植物细胞总 RNA的提取主要有苯酚法 [ 5] 、异
硫氰酸胍法 [ 6] 、氯化锂沉淀法 [ 5] 、SDS /酚抽提法[ 7] ,或
应用商品化的 Trizo l试剂进行提取 。但由于植物细胞
具有坚硬的细胞壁 ,内含较多的多糖 、脂质 、多酚等次
生代谢物[ 8] ,同种植物的不同组织和不同植物的同种
组织材料 ,其 RNA的提取方法也会有很大差异[ 9] 。适
宜的 RNA提取方法也不尽相同。因此植物 RNA的提
取更显得困难。盐桦叶片富含多糖 、多酚类物质 ,用
Trizo l试剂不能获得任何 RNA , 而用 ConcertTM Plan t
RNA Reagent提取效果好 ,但价格非常昂贵 。本研究
采用 CTAB-LiC l法 ,摸索出了一种适宜于盐桦叶片总
RNA的提取方法 ,提取的总 RNA完整性好 、纯度高 ,
完全可满足 RT-PCR等后续的分子生物学实验要求 ,
而且实验成本低 、简单快速。本研究立足通过分子生
物学方面的研究揭示盐桦耐盐的分子机理 ,而制备高
质量的基因组 DNA和总 RNA ,这对合理的开发和利
用盐桦资源具有重要的意义。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
盐桦 (Betu la ha loph ila )取自实验室盐桦组培
苗 ,最初来自新疆阿勒泰地区盐碱地 。 pMD 18-T测序
载体购自 Taka ra公司;大肠杆菌 DH 5α菌株为本实验
室保藏菌种;PCR产物回收试剂盒 、BamH I和 H indIII
限制性内切酶 、ExTaq酶以及 RT-PCR和 PCR引物均
购自 Takara公司;其它试剂均为分析纯。
1. 2　方 法
1. 2. 1　盐桦叶片总 RNA的提取方法
CTAB-LiC l法
(1)取新鲜组培的盐桦植株叶片 0. 1 g置于预冷
的研钵中加液氮充分研磨 ,直至叶片成白色粉末状 ,将
其移入一离心管中;
(2)加入 10m l65℃预热的 CTAB抽提液 (2%的
CTAB;100mM T ris-HC l, pH 8. 0;20mM EDTA pH 8. 0;
1. 4mo l /L NaC l;2%β-巯基乙醇 ),盖紧管盖 ,剧烈摇
匀 ,在 65℃水浴中温育 30m in;
(3)加入等体积的氯仿 ,摇匀 , 4℃, 12 000 r /m in,
离心 10m in;
(4)将上层水相转移至另一离心管中 ,加入 1 /3
体积 8mo l /L LiC l,混匀 , -20℃沉淀过夜;
(5) 4℃, 12 000 r /m in离心 1 h ,弃上清 ,沉淀用
3m lTE溶解 ,加 1 /3体积 8mo l /L LiC l, - 50℃放置 2
h以上;
(6)4℃, 12 000 r /m in离心 15m in,弃上清 ,沉淀
用 500μl TE溶解;
(7)加入等体积氯仿 ,混匀 , 4 ℃, 12 000 r /m in离
心 10m in,转移上层水相至另一离心管中;
(8)可重复步骤 7直至中间界面看不到蛋白质沉
淀 ,加 1 /3体积 3mol /LN aAc (pH 5. 2)和 2. 5倍体积
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DOI牶牨牥牣牨牰牭牴牥牤j牣cnki牣牨牥牥牨牠牬牱牥牭牣牪牥牥牰牣牨牨牣牥牭牨
无水乙醇 , - 50℃放置 30m in;
(9)4℃, 12 000 r /m in离心 10 ～ 15m in,弃上清 ,
沉淀用 70%乙醇漂洗 2次 ,室温下自然干燥 ,用 30μl
TE溶解 ,放置几分钟后 ,取少量样品进行电泳分析 ,其
余 -80℃冰箱贮存备用 。
1. 2. 2　总 RNA的完整性及纯度检测
(1)取 3μl总 RNA溶液 ,加灭菌的 DEPC处理水
至 3m l,用 UV 3010紫外分析仪分别测定 A 260 /A 280
进行纯度分析。
(2)取 5 μl盐桦叶片总 RNA , 用 1 x TAE配制
1. 4%的非变性琼脂糖凝胶 , 180伏稳压电泳 10m in,
用 USA A lpha TM-26凝胶成像系统检测总 RNA的完
整性。
1. 2. 3　RT-PCR对总 RNA的验证和克隆
(1)新鲜组培的盐桦植株用 200mmol /L的 NaC l
胁迫 8 h(暗光培养 ),依上述优化程序提取叶片总
RNA。
(2)以 O ligo(dT)18为引物 、采用 Takara公司的
AMV Reverse Transcriptase XL进行反转录 PCR得到
cDNA。
(3)验证 cDNA的有效性 。根据已发表在 Gen-
Bank上的 actin看家基因的保守序列设计引物 ,正向
引物为 5’ actgg tgtcatgg ttgggatggg 3’ , 反向引物为 5’
cctccaatccagacactg ta 3’ 对 cDNA进行 PCR扩增 , PCR
反应程序为:94 ℃ 2m in;94 ℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃
1m in, 35个循环;72℃延伸 10m in。
(4)耐盐相关基因钙调蛋白 (calmodulin, CaM)基
因的克隆。钙调蛋白在外界生物和非生物因素如热 、
冷 、光 、高盐 、病原体胁迫下呈现不同程度的表
达 [ 10 ～ 13] 。课题研究中欲克隆盐生植物中作为抗逆信
号转导中重要的蛋白 CaM ,以期阐明钙信使系统在盐
生植物中的耐盐机制 。根据 G enBank上发表的钙调
蛋白基因同源序列设计引物 ,正向引物为 5’ atggcggat-
cagctcaccg 3, 反向引物为 5’ tcacttggccatcatgaccttaac
3’ ,扩增参数为:94 ℃ 2 m in;94 ℃ 30 s, 53 ℃ 30 s,
72℃ 30 s, 35个循环;72℃延伸 7m in;
(5)使用北京三博生物技术有限责任公司的 DNA
凝胶回收试剂盒对扩增条带进行回收 , pMD 18-T载体
对回收片段进行克隆 ,由上海生工生物工程技术有限
公司进行测序。
2　结果与分析
2. 1　总 RNA的完整性及纯度检测
取适量盐桦叶片总 RNA经紫外分光光度计进行
纯度测定得知 , A 260 /A 280比值约为 2. 13,说明此总
RNA的纯度高。取 5μl盐桦叶片总 RNA ,经 1. 4%的
非变性琼脂糖凝胶电泳检测 , 180 v电压 ,电泳 10m in,
凝胶成像系统拍照记录 (图 1)。从图 1中可以看出 ,
盐桦叶片总 RNA条带清晰 , 28 S RNA的亮度约是 18 S
RNA亮度的 2倍 ,说明提取的 RNA完整性好 。而用
Trizo l reagen t提取乔木胡杨叶片和草本盐穗木叶片的
核酸均能获得很好的 RNA(如图 2、3)。
1　用 CTAB-LiC l法提取的盐桦叶片　　图 2　用 T rizo l reagent提取的胡杨叶片　　图 3　用 T rizo l reagent提取的盐穗木叶片
RNA的 1. 4%琼脂糖凝胶电泳分析　　　总 RNA的 1. 4%琼脂糖凝胶电泳分析　　　总 RNA的 1. 4%琼脂糖凝胶电泳分析　
　　图 4 a　盐桦 actin基因 RT-PCR结果　　　　　　　　　　　图 4 b　盐桦 CaM基因 RT-PCR结果
　　M:DL 2000分子量标记;1:盐桦　　　　　　　　　　　　　　　 M:DL 2000分子量标记;1:盐桦 52
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ATGGCGGATCAGCTCACCGACGACCAGATCTCTGAGTTCAAGGAGGCCTTCAGCTTGTTCGACAA
GGATGGCGATGGCTGCATCACTACCAAGGAGCTTGGGACTGTGATGAGGTCACTTGGGCAGAATC
CAACCGAAGCAGAGCTCCAGGACATGATCAACGAAGTTGATGCAGATGGAAATGGGACTATTGAT
TTCCCTGAGTTCCTGAACCTGATAGCCAGGAAGATGAAAGACACTGACTCGGAGGAGGAGCTTAA
AGAGGCATTCCGAGTTTTTGACAAGGACCAGAACGGGTTCATCTCTGCTGCTGAGTTGCGCCGTGT
GATGACCAACCTTGGGGAGAAGCTCACCGATGAAGAGGTTGATGAGATGATCAGGGAGGCTGATG　　　　TTGATGGTGATGGCCAGATAAATTATGAGGAGTTTGTTAAGGTCATGATGGCCAAGTGA
图 5　盐桦 CaM基因 cDNA的序列
2. 2　用 RT-PCR方法对提取的盐桦总 RNA进行验证
和耐盐相关基因的克隆
　　用 actin看家基因 PCR验证 RNA反转录为 cDNA
的有效性 ,然后试图克隆盐桦的 CaM基因的读码框。
通过 RT-PCR方法都扩增获得了预期的结果 。约 900
bp actin基因的核心片段 , 450 bp C aM基因的读码框 ,
电泳图谱(图 4 a、b)。 PCR产物经回收 、克隆及测序 ,
actin看家基因一头测序正确后就已经能够说明盐桦
RNA反转录为 cDNA的有效性。盐桦 CaM基因的测
序结果如图 5。
基因测序和序列同源性分析的结果表明 ,所克隆的
基因片段均包含了钙调蛋白基因完整的读码框架。
GenBank登记号为:DQ 881447。盐桦 CaM基因的序列
同源性与其它已发表的植物钙调蛋白基因同源性均在
80%以上 ,显示植物钙调蛋白基因具有高度保守性。
3　结论与讨论
3. 1　建立一种快速提取盐桦叶片总 RNA的方法 ,获
得质量和纯度都较高的 RNA。在提取盐桦 RNA的实
验中 ,曾利用商品化试剂 Trizo l处理未得到任何 RNA ,
分析原因这是由于木本植物盐桦组织的成分决定的 ,
在优化过程中 ,选择利用 CTAB抽提液来提取盐桦叶
片 RNA ,鉴于木本植物盐桦叶片中酚类 、胶质及多糖
类物质含量较高 ,在裂解盐桦细胞并除去其碎片后利
用 LiC l选择性的沉淀 RNA ,以去除胶质和多糖类物
质 ,然后再进行 RNA的提取和纯化 ,有效地排除了胶质
和多糖类物质对 RNA提取和纯化的干扰 ,获得了纯度
和数量合乎实验需要的 RNA-制品 。另外 ,在提取植物
RNA的过程中 ,防止 RNA的降解是关键的一步 ,所以在
实验设计中利用一些变性剂使 RNA酶失活 ,如巯基乙
醇(断裂二硫键 )、有机溶剂等 ,同时 ,在实验过程中 ,加
入的 LiC l的体积应该为 1 /3或低于 1 /3体积 ,这是十分
重要的 ,因为 LiC l的量太大会使 DNA也沉淀 ,影响所提
RNA的纯度。在整个实验过程中 ,实验操作尽可能在
低温条件下进行 (除 65℃裂解细胞外)。
3. 2　通过 RT-PCR方法验证了用此方法提取盐桦叶
片总 RNA的有效性。
3. 3　克隆了盐桦相关耐盐钙调蛋白 (CaM)基因。为
进一步分析该植物的抗逆过程及其生理生化过程中的
调控表达奠定分子基础 ,特别是研究其在逆境诱发机
体防御反应过程中信号传递中的可能作用 ,对于阐明
该植物的抗逆机理具有重要的意义。
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