全 文 ：盐桦(Betula halophila)愈伤组织的高效
诱导和不定芽的分化
梅新娣 ,张富春 ,吕会平
(新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 ,新疆生物资源基因工程国家重点实验室基地 ,新疆乌鲁木齐　830046)
摘　要:设计不同激素 、不同水平的单因子试验和正交试验 , 统计盐桦出愈率 、分化率 , 筛选出诱导盐桦愈伤组
织的最适外植体和最适培养基。盐桦愈伤组织高效诱导和不定芽分化的最适外植体为茎段;诱导愈伤组织的
最 适培养基为:LS+BA 0.5 mg/ L+NAA 0.4;愈伤组织分化抽枝的最适培养基为:LS+BA 0.5 mg/ L+NAA
0.02 mg/L;高效诱导愈伤组织和不定芽分化的最适培养基为:LS+BA 0.5 mg/ L+NAA 0.2 mg/ L。琼脂7%,蔗
糖浓度 20 g/L。愈伤组织诱导率和不定芽分化率分别达到 82%和 93.6%以上。
　　关键词:濒危植物;盐桦;愈伤组织诱导;不定芽分化
　　中图分类号:S792.159.04　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2006)01-0078-04
High Efficient Callus Induction and Adventitious Bud
Differentiation of Betula halophila
MEI Xin-di ,ZHANG Fu-chun﹡ LU Hui-ping
(Key Laboratory of Molecular Biology , College of Life Science and Technology , Xinjiang University , Xinjiang
Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering , Urumqi　830046 , China)
Abstract:The segments of shoot with bud and leaves were used to induce high efficient callus differentiation
and adventitious shoot regeneration.Results showed that the immature stems are good explants of callus induc-
tion and adventitious bud differentiation;callus induction medium is LS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.4;callus
differentiation medium is LS+BA 0.5 mg/L +NAA 0.02;the best medium for high efficient callus induction
and adventitious bud differentiation is LS+BA 0.5+NAA 0.2;the rate of callus induction is 82%, and ad-
ventitious bud differentiation is 93.6%.
Key words:endangered plant species;Betula halophila ;callus induction;adventitious bud differentiation
盐桦无性繁殖研究在我国刚刚开始 ,还未系统进行盐桦组培的研究。近来 ,在盐桦无性繁殖技术的
研究中建立了组培快繁程序[ 1] ,但如何获得有效的愈伤组织途径的盐桦再生系统也很重要。研究报道
盐桦愈伤组织形成和分化的研究结果。木本植物的组织培养过程中 ,通过愈伤组织再生植株较难 ,但通
过愈伤组织或胚状体培养途径来诱导多倍体植株和筛选突变体 ,可以大大加快育种进程 。因此 ,对盐桦
愈伤组织培养的研究 ,不仅为今后盐桦优良无性系的扩繁创造条件 ,也为试管染色体加倍及抗性突变体
筛选打下一定的基础 。
1　材料与方法
1.1　材 料
2003年 9月中旬从阿勒泰地区阿拉哈克盐湖边的休眠实生苗上采摘盐桦的落叶枝条 ,休眠芽经流
水冲洗后 ,在70%乙醇中浸泡 5 min ,实验室修剪扦插入水中[ 2] 。待其萌发后取芽尖 、茎段作为实验材
料。
1.2　方 法
1.2.1　无菌培养体系的建立
剪取盐桦茎段 ,先用毛刷蘸洗涤剂溶液轻轻地刷洗 ,将刷洗后的茎段置于烧杯中 ,用纱布封口后流
水冲洗 2 ～ 3 h 。接种前 ,用 70%酒精浸泡 10 ～ 30 s ,然后用0.1%升汞溶液灭菌 4 ～ 6 min ,之后立即用无
收稿日期:2005-10-31
作者简介:梅新娣(1970-),女 ,江苏人 ,讲师 ,硕士 , 研究方向:植物生物技术 ,(E-mail)mxdxju@126.com;通讯作者:张富春(1962-),
男 ,河南人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:生物化学与分子生物学 ,(E-mail)zfcxju@xju.edu.cn.
基金项目:国家科技攻关西部科技行动项目(2001BA901A32)和国家“ 863”项目(2004AA227110-2)
新疆农业科学　2006 ,43(1):78-81
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
菌水冲洗 6 ～ 10次 ,最后用剪刀 、镊子将茎段剪成约 1.5 cm ,接种于已灭菌的初始培养基[ 2]上 ,长成嫩枝
后 ,取叶片 、茎段诱导愈伤组织 。基本培养基为WPM[ 3] 、MS[ 4]和 LS 。上述培养基均用 1 mol/L NaOH或
HCl调至 pH为 5.8 ～ 6.0 ,1 L培养基加糖 20 g ,琼脂7 g ,灭菌 20min。接种后放入培养室内光照培养 ,培
养室温度保持在 22 ～ 25℃,光照 16 h/d ,光照度为 1 000 ～ 1 500 lx ,湿度为60%～ 70%[ 2] 。
1.2.2　盐桦愈伤组织的诱导和分化
设计不同激素 、不同水平的单因子试验和正交试验 ,每一处理重复3次 ,每次接种 20个以上茎段和
叶片 ,增殖培养 30 d后统计出愈率 、抽枝率 、生根率(统计数据均为 3次实验结果的平均值)[ 5 ,6] 。
出愈率=(形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数)×100%
抽枝率=(愈伤组织分化抽枝的外植体数/接种外植体数)×100%
生根率=(愈伤组织分化生根的外植体数/接种外植体数)×100%
2　结果与分析
2.1　不同生长调节物质对愈伤组织诱导的影响
2.1.1　生长素不同种类及浓度对愈伤组织诱导的影响
生长素不同种类对愈伤组织诱导的影响极显著。(1)2 ,4-D浓度为0.2 ～ 2.0mg/L 时 ,均能诱导出
愈伤组织 ,茎段的诱导率为 10%～ 33%,叶片为 2%左右 。2 ,4-D诱导愈伤组织率低 ,且在表面常长满
红色气生根 , 这种愈伤组织极易老化 ,即使将外植体转到新鲜培养基或降低 2 , 4-D浓度也不能改善 ,
以致下一步分化困难 。因此在盐桦愈伤组织诱导中使用2 ,4-D要慎重。(2)NAA浓度为 0.2 ～ 2.0 mg/
L 时 ,也均能诱导出愈伤组织 ,茎段的诱导率为 92%～ 98%,叶片的诱导率为 32%～ 62%。(3)在盐桦愈
伤组织诱导中 ,茎段较叶片出愈率高。与 2 , 4-D相比 ,NAA 能更有效地诱导愈伤组织 ,且愈伤组织不
易老化 ,与 6-BA结合能有效地分化不定芽。用茎段时 ,NAA 的最适浓度应为 0.2 ～ 1.0 mg/L ,说明
NAA是盐桦诱导愈伤组织的重要生长调节物质。对盐桦诱导愈伤组织来说用 NAA更适宜 。表 1
表 1　生长素不同种类及浓度对愈伤组织诱导的影响
Table 1　Effect of different auxin kinds and auxin concentration on callus induction
培养基 Medium 茎段 Segments of shoot 叶片 Leaf
激素种类(mg/ L)
Type of hormone
激素浓度(mg/ L)
Concentration of hormone
总数(个)
Total
出愈率(%)
Rate of Callus
总数(个)
Total
出愈率(%)
Rate of callus
2, 4-D 0.2 42 14 108 2
0.5 45 13 87 2
1.0 30 10 75 2
2.0 45 33 81 2
NAA 0.2 42 98 108 38
0.5 27 98 60 35
1.0 45 98 84 32
2.0 39 92 87 62
2.1.2　细胞分裂素不同种类及浓度对愈伤组织诱导的影响
细胞分裂素不同种类及浓度对愈伤组织诱导的影响不显著。(1)6-BA 浓度为 0.2 ～ 2.0 mg/L 时 ,
均能诱导出愈伤组织 ,茎段的诱导率为 98%左右 ,叶片为 82%～ 98%。说明 6-BA是盐桦诱导愈伤组
织的重要生长调节物质。(2)而KT 、TDZ浓度为 0.2 ～ 2.0 mg/L 时 ,也均能诱导出愈伤组织 ,茎段的诱导
率分别为 98%左右和 52%～ 98%,叶片的诱导率分别为 13%～ 94%和 6%～ 98%。(3)在盐桦愈伤组织
诱导中 ,茎段较叶片出愈率高。与 KT 、TDZ 相比 , 6-BA能更有效地诱导愈伤组织 ,且愈伤组织不易老
化 ,与 NAA结合能有效地分化不定芽 。用茎段时 , 6-BA 的最适浓度应为 0.2 ～ 2.0 mg/L。因此 ,对盐
桦诱导愈伤组织来说用 6-BA更适宜。表 2
2.2　盐桦愈伤组织诱导和不定芽分化的优化培养
将质量较好的愈伤组织继代培养 1 ～ 2代后 ,转入分化培养基。选取 NAA和 6-BA两种激素 ,设计
三因素三水平的正交实验 L9(34)[ 6] ,每一处理 10瓶 ,每瓶接种 3块愈伤组织 ,40 d后调查愈伤组织的出
愈率 、抽枝率 、生根率结果 。表 3 ,表4
·79·1期　　　　梅新娣等:盐桦(Betula halophila)愈伤组织的高效诱导和不定芽的分化　　　　　　
2.2.1　在附加 BA和 NAA的 9种培养基上 ,愈伤组织诱导率都在 45%以上。LS培养基对茎段都具有
很高的愈伤组织诱导率(45%和 100%),而且愈伤组织的长势最好 ,愈伤组织出现得最早 ,是诱导愈伤
组织的最有效培养基 。其它培养基的诱导效果依次为WPM 、MS 。总的看来 ,在 LS培养基上形成的愈伤
组织长势好 ,淡黄色 、致密 。WPM 培养基上的愈伤组织长势较好 ,边缘淡黄色或褐色 、透明。在MS 培养
基上愈伤组织的长势较好 ,愈伤组织布满叶片或将茎段包住 ,呈淡黄色 、松软。由此可见 ,不同激素组合
在不同培养基上产生的培养效果有明显的差异。图 1(封三),表 4
2.2.2　6-BA浓度的增加与分化率并不成线性关系。低浓度时 ,外植体长势好 ,成芽率及抽枝率高 ,但
总分化率较低 ,而且丛生芽少;高浓度时 ,外植体表面布满芽点 ,但芽原基不抽枝 ,以致成芽率低。总之 ,
6-BA能有效地促进盐桦愈伤组织上不定芽的发生。成芽数量和长势则随激素浓度升高而降低 ,因此 ,
针对使用的浓度可采用两步分化的步骤 。即高浓度下(1.0 ～ 2.4 mg/L)诱导后 ,转到低浓度 6-BA(0.5
～ 1.0 mg/L)培养基上成芽 ,这样可获得较好的分化效果 。当 6-BA浓度固定时 ,在NAA 0.02 ～ 0.2 mg/
L 时有利于茎的分化 。在 NAA 0.2 ～ 0.4 mg/L时有利于根的分化 。表 4
表 2　细胞分裂素不同种类及浓度对愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effect of different auxin kinds and cytokinin concentration on callus induction
培养基 Medium 茎段 Segments of shoot 叶片 Leaf
激素种类
Type of hormone
激素浓度(mg/ L)
Concentration of hormone
总数(个)
Total
出愈率(%)
Rate of callus
总数(个)
Total
出愈率(%)
Rate of callus
BA 0.2 39 98 45 98
0.5 54 98 36 82
1.0 57 98 63 90
2.0 36 98 48 88
KT 0.2 57 98 45 13
0.5 48 98 78 81
1.0 48 98 48 94
2.0 45 98 57 89
TDZ 0.2 36 98 36 92
0.5 39 98 69 98
1.0 54 98 36 58
2.0 54 52 48 6
表 3　愈伤组织分化培养的因素及其水平
Table 3　Factors and their levels in callus induction and adventitious
bud differentiation of Betula halophila
因素水平
Factor level
培养基种类
Type of culture media
细胞分裂素种类及浓度
Hormone and concentration(mg/ L)
生长素种类及其浓度
Auxin kinds and concentration(mg/L)
1 WPM BA 0.2 NAA 0.02
2 MS BA 1.0 NAA 0.4
3 LS BA 2.0 NAA 0.2
表 4　L9(34)正交试验处理组合与结果统计
Table 4　Treatments and results of L9(34)orthogonal experiment
序号
Order
培养基
Media
BA浓度(mg/ L)
BA Concentration
NAA浓度(mg/L)
NAA Concentration
出愈率(%)
Rate of callus
抽枝率(%)
Rate of shoot
生根率(%)
Rate of root
E1 WPM 0.5 0.02 73.335 100 63.335
E2 WPM 1.0 0.4 85 75 53.35
E3 WPM 2.0 0.2 46.65 86.665 33.35
E4 MS 0.5 0.4 85.835 55.835 74.165
E5 MS 1.0 0.2 46.045 63.515 53.955
E6 MS 2.0 0.02 60.815 87.485 0
E7 LS 0.5 0.2 100 100 57.15
E8 LS 1.0 0.02 45 97.5 0
E9 LS 2.0 0.4 100 83.255 6.25
2.2.3　效应曲线图表明 ,影响愈伤组织诱导和增殖的最佳组合为:LS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L。
影响愈伤组织分化抽枝的最佳组合为:LS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L。图 2 ,图 3 ,图 4 ～ 8(封三)
Konar等[ 5](1972)认为:在组织培养中 ,通过器官发生途径产生再生植株的基本方式有 3种:一是先
·80·　　　　　　　　　　　　　　　新疆农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　43卷
分化芽 ,待芽伸长后在其幼茎基部长根 ,形成完整植株 。这种方式在木本植物组织培养中较为普遍;二
是先分化根 ,再在根上产生芽而形成完整植株;三是愈伤组织的不同部位分别形成芽和根 ,然后二者的
维管组织互相连接形成完整植株。试验的结果符合第三种情况 ,即愈伤组织的不同部位分别形成芽和
根 ,然后二者的维管组织互相连接形成完整植株。
3　讨 论
结果表明 ,诱导盐桦愈伤组织的最适培养基为:LS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L(茎段),MS+6-
BA 2.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L(叶片);分化培养基为:LS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L(茎段);高效诱
导和不定芽分化的最适培养基为:LS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L(茎段);蔗糖浓度为 20 g/L。盐桦
的愈伤组织诱导和分化应结合起来进行 ,可采用高浓度 6-BA 诱导愈伤组织 ,低浓度促进成芽的策略。
这不仅能快速成苗 ,而且不定芽量大 ,可满足工厂化育苗和遗传转化研究中对外植体不定芽高频分化的
要求 ,以促进盐桦的进一步利用。
参考文献:
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·81·1期　　　　梅新娣等:盐桦(Betula halophila)愈伤组织的高效诱导和不定芽的分化