全 文 ：收稿日期:2008-01-31;　修订日期:2008-04-28
基金项目:国家 “ 863”计划项目(No.2004AA2Z3310)
作者简介:张　磊(1982-),女(汉族),吉林公主岭人, 现为延边大学医学
部在读硕士研究生 ,主要从事中药质量标准研究工作.
＊通讯作者简介:濮存海(1952-), 男(汉族),上海人 ,现任南京中山制药
有限公司研究员级高级工程师 ,主要从事中药新药研究工作.
地蚕指纹图谱的初步研究
张　磊1 , 王军花 2 , 濮存海2＊
(1.延边大学医学部 ,吉林 延吉　133000;　2.南京中山制药有限公司 ,江苏 南京　210012)
摘要:目的 建立地蚕药材的反相高效液相色谱(RP-HPLC)指纹图谱研究方法。方法 高效液相色谱法 , LichrospherC18
柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm),乙腈 -0.25%磷酸水梯度洗脱 , 流速 1.0 ml/min,检测波长 350 nm, 柱温 35℃。结果 10批
药材共标定了 25个共有峰。结论 利用地蚕 RP-HPLC指纹图谱分析方法较全面地反映地蚕药材的内在质量 , 可用于
地蚕药材的质量控制。
关键词:地蚕;　指纹图谱
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)11-2574-02
StudyonFingerprintofStachysgeobombycisC.Y.WubyRP-HPLC
ZHANGLei1 , WANGJun-hua2 , PUCun-hai2＊(1.HealthScienceCenterofYanbianUniversity, Yanji133000, China;2.NanjingZhongshanPharmaceutical
Co., Ltd, Nanjing210012 , China)
Abstract:ObjectiveTodeterminethefingerprintofStachysgeobombycisC.Y.WubyRP-HPLC.MethodsThesamplewas
separatedonaLichrospherC18 columnwithCH3CN-0.025% H3PO4 solutionbygradientelution.Theflowratewas1.0ml/min.UVdetectionwavelengthwasat350 nm.Columntemperaturewasat35℃.Results 25 commonpeaksintheHPLCprofilewere
foundinStachysgeobombycisC.Y.Wuindiferentgrowingareas.ConclusionTheRP-HPLCfingerprintcanbeusedtocontrol
thequalityofStachysgeobombycisC.Y.Wu.
Keywords:StachysgeobombycisC.Y.Wu;　Fingerprint
　　地蚕又名肺痨草 ,为唇形科水苏属植物地蚕 Stachysgeobomby-
cisC.Y.Wu的全草及地下部分 ,主产于浙江、江西 、福建等地。该
药味淡 ,微甘 ,性平 ,归肺 、肾经 ,具有益肾润肺、滋阴补血、清热除
烦等功能 ,用于治疗咳嗽 、哮喘等 [ 1] , 化学研究 [ 2]报道其有金丝桃
苷 、黄芩苷 、黄芩素 、汉黄芩素 、齐墩果酸等成分。杨中林等 [ 3]以金
丝桃苷为对照品高效液相色谱(HPLC)法测定地蚕药材含量。但
对地蚕的质量控制方面的研究较少。为了进一步对地蚕药材质量
进行科学评价 , 本实验采用 HPLC法对不同产地不同采集时间的
地蚕进行指纹图谱的研究 ,同时进行了系统适应性实验和方法学
考察 ,为地蚕药材的鉴定与质量评价提供依据。
1　仪器与试药
1.1　仪器 日本岛津 LC-20AB高效液相色谱仪(PDA检测器 ,
LC-solution色谱工作站)。
1.2　试药 金丝桃苷对照品(南京青泽医药开发有限公司 , 含量
测定 98.48%,批号 070415);地蚕药材经江苏省药品检验所董小
平主任药师鉴定;乙腈(色谱纯 , 山东禹王实业有限公司);冰醋
酸(分析纯 ,南京化学试剂有限公司),水(二次重蒸水)经过 0.45
μm水系滤膜过滤。
2　方法与结果
2.1　色谱条件 色谱 LichrospherC18柱 (5 μm, 4.6 mm×250mm), 检测波长为 350nm, 进样量 10 μl, 柱温 35℃,流速 1.0 ml/
min,流动相梯度如表 1, 记录时间为 100 min。此条件下对照品
金丝桃苷的保留时间 18.773 min。
2.2　供试品溶液的制备 精密称定粉碎后的地蚕样品约 5 g,加
入 75ml甲醇 , 回流 30 min, 滤过 ,将药液浓缩至干 , 用少量水溶
解 , 分别用石油醚和醋酸乙酯依次萃取 , 醋酸乙酯层浓缩至干 ,甲
醇定容于 5 ml量瓶中 , 摇匀 ,微孔滤膜滤过 , 即得。
表 1　流动相梯度
时间 t/min A(乙腈)(%) B(0.25%醋酸水)
0 16 84
20 28 72
65 30 70
70 75 25
80 85 15
90 16 84
100 16 84
2.3　对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照品 1 mg, 用甲
醇溶解 ,定容于 25 ml量瓶中(浓度为 40μg/ml), 摇匀即得。
2.4　方法学考察 取地蚕样品进行指纹图谱预试验 , 按上述色
谱条件 ,可得到分离度较好 、各峰分布较均匀的指纹图谱 ,并着重
选择了地蚕峰面积较大的 13个峰 ,进行方法学考察。
2.4.1　精密度实验 精密吸取供试品溶液 10 μl, 按上述色谱条
件 , 连续进样 5次 ,记录色谱图。结果表明 , 各色谱峰的相对保留
时间和其相对峰面积比值基本一致 , RSD均小于 3.0%, 符合指
纹图谱色谱技术要求。
2.4.2　稳定性实验 取同一供试品溶液 ,按上述色谱条件 ,分别
于 0, 2, 4, 8, 12, 24 h进样检测 , 记录色谱图。结果表明 , 各色谱
峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致 , RSD均小于
3.0%,说明供试品溶液在 24h内稳定 , 符合指纹图谱技术要求。
2.4.3　重复性实验 分别精密称定同一批药物 5份 , 同法制备
样品 , 进样 ,记录色谱图。结果表明 ,各色谱峰的相对保留时间和
相对峰面积比值基本一致 , RSD均小于 3.0%, 符合指纹图谱技
术要求 。
2.5　指纹图谱及技术参数 [ 4]
2.5.1　指纹图谱选择及特征峰的标定 根据 10批供试品 HPLC
图谱 , 选择 7号供试品作为对照指纹图谱(见图 1)。地蚕药材中
金丝桃苷为其主要成分 ,从指纹图谱中可以看出金丝桃苷色谱峰
(保留时间 RT≌18.833min,峰面积百分比 A%≌20.05%)积分
面积最大 ,作为参照峰 , 同时得到各批次地蚕药材 25个共有峰。
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.11　
图 1　地蚕药材的对照指纹图谱
2.5.2　地蚕指纹图谱相似度计算 按上述实验方法检测 10批
地蚕药材的指纹图谱(见图 2),应用中药色谱指纹图谱相似度评
价系统(A版 ,国家药典委员会)计算 10批药材的相似度 ,结果分
别为:0.980, 0.925, 0.945, 0.972, 0.986, 0.978, 1.000, 0.991,
0.968, 0.967。
图 2　10批地蚕药材的指纹图谱
2.5.3　共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较 参照《中药
注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)》 [ 4] , 对地蚕药材进行
HPLC色谱指纹图谱测定分析 , 以参照物金丝桃苷(2号峰)的保
留时间和峰面积为 1, 计算 10批指纹图谱中 25个共有峰的相对
保留时间及相对峰峰面积。见表 2 ～ 3。
表 2　10批供试品共有特征指纹峰相对保留时间
峰号 样品
1　　　2　　3　　　4　　5　　　6　　7　　　8　　9　　　10
1 0.431 0.432 0.433 0.431 0.431 0.432 0.432 0.432 0.434 0.433
2 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
3 1.155 1.156 1.157 1.155 1.155 1.156 1.156 1.155 1.157 1.156
4 1.477 1.478 1.478 1.478 1.476 1.478 1.477 1.478 1.476 1.477
5 1.606 1.606 1.606 1.606 1.605 1.607 1.606 1.607 1.605 1.606
6 1.693 1.694 1.694 1.693 1.693 1.694 1.694 1.694 1.694 1.695
7 1.784 1.785 1.785 1.785 1.786 1.786 1.784 1.785 1.784 1.785
8 1.866 1.867 1.868 1.866 1.866 1.867 1.868 1.868 1.868 1.868
9 1.996 1.997 1.997 1.996 1.996 1.997 1.997 1.996 1.997 1.996
10 2.285 2.285 2.286 2.285 2.286 2.285 2.285 2.286 2.287 2.287
11 2.766 2.767 2.767 2.766 2.767 2.767 2.768 2.768 2.768 2.767
12 2.901 2.902 2.900 2.902 2.900 2.901 2.902 2.902 2.902 2.900
13 3.470 3.471 3.471 3.470 3.470 3.471 3.472 3.472 3.472 3.470
14 3.195 3.196 3.196 3.195 3.195 3.196 3.196 3.195 3.195
15 3.392 3.393 3.394 3.392 3.392 3.393 3.393 3.394 3.393 3.393
16 3.411 3.412 3.413 3.410 3.410 3.411 3.412 3.412 3.413 3.410
17 3.470 3.471 3.471 3.470 3.470 3.471 3.471 3.471 3.472 3.472
18 3.601 3.602 3.603 3.601 3.601 3.602 3.620 3.600 3.601 3.602
19 3.690 3.691 3.691 3.692 3.690 3.691 3.690 3.691 3.691 3.690
20 3.734 3.733 3.734 3.733 3.734 3.734 3.733 3.734 3.733 3.734
21 3.821 3.820 3.821 3.821 3.820 3.821 3.820 3.821 3.820 3.821
22 3.969 3.968 3.968 3.967 3.967 3.968 3.968 3.968 3.967 3.968
23 4.017 4.019 4.018 4.019 4.019 4.019 4.018 4.018 4.018 4.019
24 4.043 4.043 4.042 4.043 4.042 4.043 4.042 4.041 4.042 4.043
25 4.167 4.165 4.166 4.167 4.167 4.166 4.165 4.167 4.166 4.165
3　讨论
3.1　样品来源 10批地蚕药材均源于唇形科植物地蚕 Stachys
geobombycisC.Y.Wu全草;产地 1 ～ 4批药材产自浙江省平阳县 ,
5 ～ 8批药材产自浙江省雁荡山 , 9、 10批药材产自江苏省徐州市。
3.2　色谱条件的考察 [ 5] 考察了甲醇 -水 、乙腈 -水 、甲醇 -水
-磷酸 、甲醇 -水 -冰醋酸 、乙腈 -水 -磷酸 、乙腈 -水 -冰醋酸
多种流动相系统 ,其中乙腈 -水 -冰醋酸系统色谱峰分离度好 ,
故选用。 乙腈 -水 -冰醋酸系统中又考察了 0.1%, 0.5%,
0.25%3种冰醋酸浓度 ,发现冰醋酸浓度为 0.25%时色谱峰分离
度最好 ,故选用。根据二级管阵列检测器检测结果 ,大部分成分
在 280 nm和 350nm时吸收值大 , 但 280nm下干扰强 ,基线不平
稳;350 nm下各色谱峰分离好 、基线平稳 , 故采用 350 nm为检测
波长。本实验曾采用等度洗脱 ,由于成分复杂 , 时间过长 ,改用梯
度洗脱 ,同时保证大部分色谱峰都能在 100 min内出峰。
表 3　10批供试品共有特征指纹峰峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0.380 0.357 0.377 0.376 0.450 0.475 0.471 0.470 0.405 0.416
2 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
3 1.035 1.026 1.045 1.038 0.910 0.890 0.857 0.861 0.85 0.868
4 0.158 0.156 0.154 0.158 0.126 0.117 0.120 0.131 0.152 0.153
5 0.358 0.366 0.354 0.352 0.515 0.517 0.518 0.498 0.349 0.382
6 0.165 0.162 0.167 0.160 0.271 0.273 0.384 0.380 0.167 0.161
7 0.108 0.089 0.111 0.105 0.128 0.131 0.122 0.119 0.090 0.083
8 0.309 0.311 0.317 0.320 0.244 0.238 0.261 0.268 0.318 0.315
9 0.244 0.249 0.251 0.247 0.310 0.303 0.329 0.328 0.251 0.254
10 0.072 0.080 0.085 0.079 0.153 0.139 0.192 0.191 0.083 0.086
11 0.284 0.284 0.284 0.284 0.284 0.284 0.284 0.284 0.284 0.284
12 0.072 0.071 0.075 0.073 0.098 0.092 0.096 0.090 0.071 0.070
13 0.331 0.329 0.337 0.335 0.339 0.341 0.340 0.348 0.349 0.337
14 0.125 0.126 0.119 0.139 0.131 0.140 0.171 0.175 0.129 0.134
15 0.103 0.108 0.110 0.105 0.098 0.094 0.147 0.143 0.110 0.101
16 0.124 0.127 0.129 0.130 0.081 0.084 0.174 0.178 0.152 0.133
17 0.100 0.109 0.114 0.117 0.120 0.124 0.146 0.140 0.135 0.137
18 0.135 0.133 0.130 0.138 0.141 0.145 0.179 0.178 0.131 0.136
19 0.831 0.845 0.829 0.838 0.806 0.820 0.856 0.849 0.800 0.805
20 0.725 0.731 0.745 0.751 0.749 0.750 0.751 0.730 0.737 0.741
21 0.210 0.221 0.163 0.239 0.179 0.242 0.366 0.360 0.338 0.352
22 0.164 0.163 0.174 0.160 0.171 0.173 0.109 0.102 0.160 0.161
23 0.140 0.138 0.104 0.130 1.313 0.108 0.104 0.098 0.141 0.144
24 0.179 0.183 0.184 0.185 0.187 0.181 0.180 0.188 0.182 0.180
25 0.915 0.895 0.903 0.890 0.910 0.901 0.900 0.899 0.905 0.908
3.3　样品制备条件的考察 考察了无水乙醇 、 95%乙醇 、甲醇 、
75%甲醇 、50%甲醇等 5种提取溶剂 , 以色谱峰数量 、面积 、分离
度各因素综合考察 ,无水乙醇作提取溶剂的样品峰个数最少 , 其
他溶剂提取效果相近 ,但经放置后发现除甲醇作提取溶剂的样品
之外 , 其他样品均有不同程度的沉淀 , 最后选用甲醇作提取溶剂。
然后考察了超声 、回流及索氏提取 3种方法 , 各样品色谱图基本
一致 , 但回流法提取的样品峰面积最大 , 故采用回流法。接着分
别考察了回流 30 min, 1 h, 1.5 h对样品色谱峰的影响 , 结果各样
品色谱图一致 ,考虑节省能源选用回流 30min。
采用甲醇热回流提取后 , 需分别用石油醚和醋酸乙酯萃取 ,
除去极性较大和极性较小的成分 ,富集黄酮类化合物。
3.4　参照物的确定 由于地蚕药材黄酮类成分的报道有金丝桃
苷 、黄芩苷 、黄芩素 、汉黄芩素 ,实验发现金丝桃苷含量较高 ,且该
色谱峰分离度好 ,故选用金丝桃苷。
3.5 　不同产地药材指纹图谱相似度评价 10批不同产地地蚕药
材样品的指纹图谱基本一致 ,因此选择 7号样品的指纹图谱作为
对照指纹图谱 , 由各批次地蚕药材指纹图谱与对照指纹图谱相似
度计算结果可见 , 10批样品指纹图谱相似度良好(r>0.90), 反
应药材的同源性 。本方法稳定 、可靠 、重复性好 ,可为地蚕原药材
及其制剂质量标准的拟定提供依据。
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