全 文 ：应用 ITS序列分析探讨偏花报春的系统位置
朱 惠 芬　杨 俊 波 　张 长 芹＊ 　李 德 铢
(中国科学院昆明植物研究所　昆明 650204)
Systematic position of Primula secundiflora (Primulaceae)
inferred from nuclear ribosomal DNA ITS sequence data
ZHU Hui_Fen　YANG Jun_Bo　ZHANG Chang_Qin＊　LI De_Zhu
(Kunming Institute of Botany , the Chinese Academy of Sciences , Kunming 650204)
Abstract　Two views on the systematic position of Primula secundiflora Franch.were presented by
different scholars.This species has long been treated as a member of sect.Sikkimensis , owing to its
campanulate corolla , but recently it was moved to sect.Proliferae based on other characteristics em-
phasized.In the present paper , the ITS (internal transcribed spacer)regions of nuclear ribosomal
DNA from eight Primula species(three in sect.Sikkimensis , four in sect.Proliferae together with
P .secundiflora)were sequenced and analyzed.Based on the results , together with evidence from
morphology and cytology , we consider that P.secundiflora should be placed in sect.Proliferae.
Key words　Primula secundiflora ;ITS sequence;Sect.Proliferae;Sect.Sikkimensis
摘要　对于偏花报春 Primula secundiflora Franch.的系统位置 ,主要有两种意见 ,一种认为偏花报春具有
典型的钟状花冠 ,应置于钟花报春组 sect.Sikkimensis;而另一种意见则依据其他特征将其置于灯台报春
组 sect.Proliferae。通过对偏花报春 、灯台报春组 4种植物和钟花报春组 3 种植物核糖体 DNA中的内转
录间隔区(ITS)的序列测定及分析 , 并结合形态学及染色体特征的比较论证 , 认为偏花报春应置于灯台
报春组。
关键词　偏花报春;ITS 序列;灯台报春组;钟花报春组
偏花报春 Primula secundiflora Franch.隶属报春花科 Primulaceae 报春花属 Primula(陈
封怀 ,胡启明 ,1990)。从目前所见的分类系统可知 ,其系统位置颇有争议。不同的学者对
不同的性状进行加权 ,从而将其置于不同的组 。大多数学者 ,包括 Balfour(1913),Smith &
Forrest(1928)等据其花冠钟状将其置于钟花报春组 sect.Sikkimensis;陈封怀和胡启明认为
偏花报春的花冠是界于钟状和漏斗状之间的一种中间类型 ,并结合株型 、叶形 、花色与地
理分布等特征 ,在《中国植物志》中将其放在灯台报春组 sect.Proliferae;Richards(1993)侧
重强调花粉形态的差别 ,也将其置于灯台报春组。
朱慧芬等(2001)根据染色体特征将偏花报春与灯台报春组 、钟花报春组植物进行了
比较 ,结果支持偏花报春与灯台报春组植物更为相似的观点 。
近年来 ,利用分子生物学方法获得的大量植物 DNA序列资料应用于系统学的研究 。
其中 ,核糖体 DNA ITS区(18S_26S)的应用最为广泛 ,并且已经证明这一区域的 DNA 序列
特征可以作为被子植物系统学研究的一个非常有用的性状(Baldwin et al., 1995)。由于
　2001-04-26收稿 , 2001-10-16收最后修改稿。
基金项目:中国科学院知识创新和云南省自然科学基金 2001C0057M 资助项目。
＊通讯联系人(Author for correspondence)
植 物 分 类 学 报　40(2):133～ 138(2002)
Acta Phytotaxonomica Sinica
ITS区具有较快的进化速率 ,所以可以用来解决一些较低分类阶元的问题。目前 ,据报道
(Baldwin ,1991 ,1992;Cox et al., 1997;Lee et al., 1999;Kim et al., 1999;施苏华等 ,
1999;洪亚平等 ,2001), ITS区序列分析已被用于解决很多科内的系统问题 , 同时证明 ,
ITS在探讨属间及属内的关系方面也很有价值 。
在报春花科中 ,Anderberg et al.(2000)利用 ITS区的序列资料对仙客来属 Cyclamen 的
系统发育进行了研究 。
本文试图利用 ITS区的序列分析来探讨报春花属中偏花报春在两个组之间的系统位
置。分别对偏花报春 、灯台报春组 4种植物和钟花报春组 3种植物的核糖体 DNA ITS区
首次进行了序列测定和分析 ,并结合有关形态性状 、染色体特征 ,探讨了偏花报春的系统
位置 。
1　材料和方法
1.1　材料来源
分别选取了偏花报春 P.secundiflora 、灯台报春组 4种植物 ,即海仙花报春 P .poisso-
nii 、霞红灯台报春 P .beesiana 、粉被灯台报春 P .pulverulenta 、桔红灯台报春 P .bulleyana
以及 3种钟花报春组植物 ,即网叶钟报春 P.reticulata 、巨伞钟报春 P .florindae 、钟花报春
P .sikkimensis作为研究对象 。材料来源(表 1)除特别注明的种类采用腊叶标本叶片外 ,
其余材料均来自野外用硅胶快速干燥的新鲜叶片 。凭证标本保存于中国科学院昆明植物
研究所标本馆(KUN)。
表 1　材料来源
Table 1　Source of material and Genbank Accession No.used
分类群
Taxa
凭证标本　　　
Voucher
序列号Genbank
Accession No.
Sect.Proliferae
P.secundif lo ? Zhongdian , Yunnan.H.F.ZHU200034 AF396695
P.poisonii Zhongdian , Yunnan.H.F.ZHU200033 AF396692
P.beesiana Kunming Botanic Garden , Cultivated.H.F.ZHU 200042 AF396689
P.pulverrulenta Kunming Botanic Garden , Cultivated.H.F ZHU 200025 AF396693
P.bulleyana Kunming Botanic Garden , Cultivated.H.F ZHU 200006 AF396690
Sect.Sikkimensis
P.sikkimensis Zhongdian Yunnan.H.F.ZHU 200035 AF396696
P.reticulata＊ Nepal 873275(Anonymons) AF396694
P.florinda＊ Linzhi , Tibet.J.X.YANG 2357 AF396691
Lysimachia azorica＊ Sequence downloaded from Genbank AF164017
＊ Leaves from herbarium specimens kept in KUN.
1.2　DNA的提取
分别取各种植物的硅胶干燥叶片或腊叶标本叶片 0.1 g 左右 , 采用改良 CTAB 法
(Doyle &Doyle , 1987)提取总 DNA。
1.3　ITS区的扩增
聚合酶链式反应(PCR)在 PERKIN ELMER 9600 型 PCR 仪上进行 , 用 White et al.
(1990)描述的引物(见下文)进行 ITS 区的扩增 。对于由硅胶干燥叶片提取的 DNA ,采用
ITS5和 ITS4一对引物扩增 DNA ITS区(5′_18S rDNA_ITS1_5.8S rDNA_ITS2_26S rDNA_3′);对
134　 植　物　分　类　学　报 40 卷
于由腊叶标本叶片提取的 DNA ,用 ITS5 , ITS2一对引物扩增 5′_18S rDNA_ITS1_5.8S rDNA_
3′区 , ITS4 , ITS3 一对引物扩增 5′_5.8S rDNA_ITS2_26S rDNA_3′区的序列 。PCR程序为:
97℃预变性 4 min , 94℃变性 1 min , 50℃退火 1 min , 72℃延伸 1 min , 30个循环;由于腊
叶标本长期存放 ,DNA降解为稍短的片段 ,故其 PCR的预变性 、变性及退火时间均稍为缩
短 ,循环数增至 35 个。PCR的引物为:ITS5 , 5′_GGAAGTAAAAGTAACAAGG_3′;ITS4 , 5′_
TCCTTCCGCTTATTGATATGC_3′;ITS2 , 5′_GCTGCGTTCTTCATCGATGC_3′;ITS3 ,5′_GCATCGAT-
GAAGAACGCAGC_3′。
1.4　纯化
扩增产物均经Watson公司纯化试剂盒进行纯化 。
1.5　ITS区 DNA测序
测序反应依据双脱氧链终止法(Sanger et al.,1977)原理 ,在上述 PCR仪上进行 ,反应
程序为:64℃变性 50 s , 50℃退火 10 s , 60℃延伸 4 min ,30个循环 ,反应体系为 10μl。产
物经热变性后于 ABI310型自动测序仪进行序列测定。为保证所测序列的准确性 ,分别对
每一种类的 ITS序列的正 、反链进行测序并校准。
1.6　外类群选择
根据陈封怀和胡启明(1989)的研究 ,珍珠菜属 Lysimachia 是报春花科中最原始的一
个属 ,本研究选取了珍珠菜属的1种植物 ,即 Lysimachia azorica 作为外类群 。
1.7　数据分析
所得序列采用 SeqEdv 1.03及 Clustal X进行排序 ,利用 PAUP 4.0b.4a软件对序列进
行统计分析及分支分析 ,计算各类群间的核苷酸差异值及差异矫正值 ,以 Lysimachia 为外
类群 ,采用最大简约法(maximum parsimony method)获得最大简约树(MPTs), 用自展法
(bootstrap法)检验系统树 ,自展数据集为 1000次 。
2　实验结果
排列后的 ITS序列(含5.8s)总长为640 ～ 647 bp ,排列后的序列经PAUP 4.0b.4a分析
得到各类群间的绝对遗传距离和相对遗传距离(表2)。对715个位点进行了分析 ,其中稳
表 2　类群间的遗传距离
Table 2　Pairwise distance between taxa in the present study
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 - 0.193 0.008 0.143 0.014 0.145 0.050 0.149 0.013
2 116 - 0.203 0.220 0.188 0.231 0.197 0.236 0.188
3 5 155 - 0.152 0.010 0.145 0.052 0.149 0.012
4 91 132 91 - 0.148 0.017 0.155 0.015 0.143
5 9 113 6 94 - 0.150 0.053 0.154 0.011
6 85 128 85 10 88 - 0.156 0.017 0.145
7 32 118 31 99 34 92 - 0.160 0.049
8 89 133 89 9 92 10 96 - 0.149
9 8 113 7 91 7 85 31 89 -
Below diagonal:Absolute distances;Above diagonal:Mean distances
Note　1.Primula beesiana;2.Lysimachia azorica;3.P.bulleyana;4.P.sikkimensis;5.P.secundiflora;6.P.reticulata;
7.P.pulverrulenta;8.P.florindae;9.P.poisonii.
2 期 朱惠芬等:应用 ITS 序列分析探讨偏花报春的系统位置 135　
定位点385个 ,变异位点335个(包括184个信息位点)。用最大简约法寻找得到 5棵最简
约树 ,简约树长度为 444步 ,一致性指数(CI)和维持性指数(RI)分别为 0.876和 0.815。
最大简约树用 bootstrap分析各分支的支持强度(图 1),其中 , Lysimachia azorica 为外类群 。
结果显示 ,所研究的 8 个种类分为两大支:Primula florindae , P.reticulata , P.sikki-
mensis同为一支 ,bootstrap 值为 100%,这 3个种均属于钟花报春组;P.poissonii , P.pul-
verulenta , P .bulleyana , P.secundiflora , P.beesiana 为另一支 , bootstrap 值为 100%,其中
P .poissonii , P.pulverulenta , P.bulleyana , P.beesiana 均属于灯台报春组 。这一结果支
持偏花报春 P .secundiflora 与P.poissonii , P .pulverulenta , P.bulleyana ,P .beesiana 在同
一组 ,即灯台报春组 sect.Proliferae 。
图 1　以珍珠菜属的一个种为外类群 ,基于 ITS区序列分析得到的最大简约树
Fig.1　The strict consensus tree of two most parsimonious trees generated from nrDNA ITS sequences using
Lysimachia azorica as outgroup
3　讨　论
自Balfour(1913)到Smith &Forrest(1928)历来的学者都根据偏花报春的钟状花冠将其
置于钟花报春组 sect.Sikkimensis;陈封怀和胡启明认为偏花报春的花冠是界于钟状和漏
斗状的中间类型 ,并结合株型 、叶形 、花色与地理分布等特征进而将其放在灯台报春组
sect.Proliferae ,Richards(1993)在专著《Primula》中侧重强调花粉形态的差别 ,也将其置于
灯台报春组。
从我们对 ITS序列分析得到的结果来看 ,在分支图(图 1)中 ,偏花报春与霞红灯台报
春 、桔红灯台报春 、海仙花报春构成一支 ,其 bootstrap支持率为 97%;而钟花报春组的3个
种构成一个单系类群 ,其 bootstrap支持率为 100%。这一结果支持陈封怀和胡启明 ,以及
Richards将偏花报春放于灯台报春组的观点 。
在形态特征方面 ,灯台报春组与钟花报春组植物的花器官的明显区别在于:灯台组植
物的花冠为漏斗状 ,钟花组的花冠为钟状 。从这些花器官特征的比较(表 3)来看 ,偏花报
春与钟花报春组 sect.Sikkimensis 植物的特征更为接近 ,这可能就是历来的学者将其置于
136　 植　物　分　类　学　报 40 卷
钟花报春组的原因所在。
表 3　偏花报春与钟花组报春及灯台组报春的主要形态特征比较
Table 3　Comparision of the main morphological characteristics among P.secundiflora ,
sect.Sikkimensis and sect.Proliferae
Morphological
Character
P.secundif lora Sect.Sikkimensis Sect.Proliferae
花冠
Corolla
介于钟状或漏斗状之间
Between bell_shaped and funnel_
shaped
钟状
Bell_shaped
漏斗状
Funnel_shaped
花冠裂片
Corolla lobes
近直立
Nearly erect
近直立
Nearly erect
反折 ,与花冠筒近乎垂直
Ref lexed , vertical to the corol-
la tube
花序
Inflorescence
伞形花序顶生 ,有时出现第 2轮
Inf lorescence umbella_like terminal ,
sometimes with two whorls of flowers
伞形花序顶生 ,或 2～ 3轮
Inflorescence umbella_like ,
terminal , or with 2～ 3 whorls
of flowers
伞形花序顶生 , 2至多轮
Inflorescence umbella_like ,
terminal , with two or more
than two whorls of f lowers
蒴果
Capsule
筒状 ,稍长于花萼
Tubular , slightly longer than calyx
筒状 ,等长于或稍长于花萼
Tubular , as long as or longer
than calyx
近球形 ,稍短于花萼
Subglobose , slightly shorter
than calyx
从细胞学特征来看 ,朱慧芬等(2001)的研究指出 ,偏花报春的染色体较大 ,着丝点清
晰;钟花报春组多数种类染色体较小 ,着丝点难于辨认;灯台报春组染色体较大 ,着丝点清
晰。结合其他核型特征 ,朱慧芬等认为与钟花报春组相比 ,偏花报春的染色体特征与灯台
报春组植物更为相似 。Bruun(1932)对 100多种报春花属植物的细胞学研究表明 ,偏花报
春与钟花报春组多数报春的染色体特征有着很大的差异 ,偏花报春具有较大的染色体而
钟花报春则具有小而相对短的染色体有明显的不同 。同时指出“虽然 P.secundiflora 和
P .vittata的染色体数目均为 2n=22但该两种的染色体明显比该组其它种类的染色体
大” ,并提出“P.secundiflora和P .vittata应该被划作一个亚组处理”的建议。而现在 , P .
vittata 已经被归并为P.secundiflora 。
综上所述 ,核糖体DNA ITS区序列分析的结果和细胞学方面的特征均支持将偏花报
春置于灯台报春组的观点 。
致谢　承蒙中国科学院华南植物研究所胡启明教授赐信指导 ,中国科学院昆明植物研究
所标本馆提供腊叶标本叶片材料 ,论文写作过程中得到中国科学院昆明植物研究所植物
分子地理学开放实验室田欣 、陈永燕 、郭振华等同事的帮助 ,在此一并表示感谢 。
参 考 文 献
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(责任编辑 白羽红)　　
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