全 文 ：浙 江 林 学 院 学 报　2008, 25(3):304 -308
JournalofZhejiangForestryColege
濒危植物天目铁木遗传多样性的 RAPD分析
王祖良 1 , 丁丽霞 2 , 赵明水1 , 程晓渊 1 , 沈　乾3
(1.浙江天目山国家级自然保护区 管理局 , 浙江 临安 311311;2.浙江林学院 环境科技学院 , 浙江 临安 311300;
3.浙江林学院 林业与生物技术学院 , 浙江 临安 311300)
收稿日期:2007-11-09;修回日期:2008-01-18
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y305331);浙江林学院浙江省现代森林培育技术重点实验室开放基金
资助项目(200503)
作者简介:王祖良 , 工程师 , 硕士 , 从事自然保护区资源管理研究。 E-mail:wzuliang@zj.com
摘要:濒危植物天目铁木 Ostryarehderiana现仅在天目山残存 5株野生植株 , 是国家一级保护植物。为研究该物种繁
殖与复壮的有效途径 , 利用随机扩增多态性 DNA(RAPD)标记 , 对这 5株天目铁木的遗传多样性和遗传分化进行基因
组 DNA多态性分析 , 统计 18个扩增较为稳定的引物在 5个 DNA样品中扩增的电泳带总数与多态带的数目。结果显
示:共扩增出 176个 DNA片段 , 片段大小为 200 ～ 2 800 bp, 其中多态性谱带为 88条 , 占 50%, 表现出了丰富的
RAPD多态性。根据遗传距离 , 利用 UPGMA构建了个体亲缘关系树状图。结果表明 , 4号和 5号植株间亲缘关系最
近 , 遗传距离为 0.133 5, 1号和 3号植株间亲缘关系最远 , 遗传距离为 0.461 0, 1号植株与其他 4株的亲缘关系均较
远 , 遗传距离为 0.366 5 ～ 0.461 0, 聚类时被聚在其他 4株之外。 这一结果与 5株间物理距离分布的位置差异相符。
图 5表 2参 8
关键词:植物学;天目铁木;随机扩增多态性 DNA;遗传多样性
中图分类号:S718.46　　　文献标志码:A 文章编号:1000-5692(2008)03-0304-05
GeneticdiversityofOstryarehderianarevealedbyRAPDmarkers
WANGZu-liang1 , DINGLi-xia2 , ZHAOMing-shui1 , CHENGXiao-yuan1 , SHENQian3
(1.ManagementOfice, NationalNatureReserveofMountTianmu, Linan311311, Zhejiang, China;2.
SchoolofEnvironmentalSciencesandTechnology, ZhejiangForestryCollege, Linan311300, Zhejiang,
China;3.SchoolofForestryandBiotechnology, ZhejiangForestryCollege, Linan311300, Zhejiang, China)
Abstract:OstryarehderianaisunderfirstclassnationalinChina, onlydistributinginNationalNature
ReserveofMountTianmu, ZhejiangProvince, andhavingonlyfivewildtrees(namelyNo.1, No.2, No.3,
No.4, andNo.5)intheworld.ThefivetreeswerefingerprintedusingrandomamplifiedpolymorphicDNA
(RAPD)markerswith18 primersbeingscreened.Atotalof176 DNAbasepair(bp)fragmentsrangingfrom
200 bpto2 800 bpwereamplifiedwith88 ofthesebandsbeingpolymorphic(50%).Basedongenetic
distances, relationshipsamongthefiveindividualswereconstructedusingUnweightedPairGroupMethodwith
ArithmeticMean(UPGMA).Geneticdistancepositivelycorrelatedwithgeographicdistance.BecauseNo.1
waslocatedfurtherfromtheotherfour, itwasclusteredintoonegroupalone.Therefore, moreatentionshould
begiventothetreeofNo.1 [ Ch, 5 fig.2 tab.8 ref.]
Keywords:botany;Ostryarehderiana;RAPD;interspeciesgeneticdiversity
1　天目铁木现状
天目铁木 Ostryarehderiana属桦木科 Betulaceae, 为浙江天目山特有的珍稀树种 , 野生植株仅存 5
株 , 是国家一级保护植物 [ 1] 。该树种雌雄同株 , 单性花 , 雄花为葇荑花序 , 单生或簇生于叶腋 , 下
垂 , 淡黄色 , 3月底至 4月上旬散粉。雌花具膜质苞片 , 青绿色 , 着生于枝梢 , 聚生或稀疏的总状花
序 , 于 4月中旬开放。由于雌雄花花期错落 , 导致结实率低 , 仅为 20% ～ 30%, 果实干瘪粒较多。
种实于 10月成熟 , 具苞片(即果翅), 与果脐相连 , 去翅果实为瓜子形 , 果皮淡褐色 。种子吸水主要
通过苞片的网脉进入 , 胚的发育由子叶供给营养 , 但具生理后熟 , 物种的自我更新能力差。干藏或湿
存都不宜种子保存 , 会导致大部分丧失活力。利用传统的种子繁育手段 , 往往会把果实苞片去掉 , 这
又导致种子仅靠种脐吸水 , 出现供水不足 , 影响吸胀萌发[ 2-5] 。再加上人为的生产活动对原生植株的
破坏 , 导致了该物种的濒危现状。
1985年开始 , 浙江林学院林学系和天目山国家级自然保护区管理局科研人员开展了天目铁木的
有性和无性繁育研究 , 均取得了突破性进展。通过对种子的低温层积 、 赤霉酸(GA)处理及对土壤 、
水分 、 光照等方面的精准化管理 , 有性繁育获得成功。与此同时 , 进行了无性繁育研究 , 在插条选
择 、扦插季节 、 土壤 、水分 、光照和温度等方面都进行严格的控制 , 取得了 46% ～ 55%的成活率。
1985-1990年间的繁育研究成功培育了 500余株苗木 , 有 200多株苗木定植于天目山国家级自然保
护区内 , 另外在南京 、杭州 、 临安等地也有少量移栽 [ 2-5] 。
上述培育苗均是 5株野生植株的子代 , 为进一步探讨其濒危机制 , 需对现存的天目铁木进行遗传
多样性研究 , 利用 RAPD分子标记技术对天目铁木 5个残存野生植株进行了遗传差异的分析。
2　材料与方法
2.1　材料
图 1　5株野生植株分布示意图
Figure1　Thedistributionofthefivewildtreesof
Ostryarehderiana
2007年 7月 , 在西天目山南坡山麓大有村
采集 5株野生植株(图 1)幼嫩的叶片 , 用塑料
袋包装 , 直接储存于浙江林学院浙江省现代森
林培育技术重点实验室 -70 ℃冰箱备用 。
2.2　基因组 DNA提取与质量浓度测定
基因组 DNA提取参照 Tai等[ 6] 和顾红雅
等 [ 7]的 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法 , 并
经部分改良 [ 8] 。
新鲜叶片在液氮中迅速研磨至白色粉末 ,
研磨时加入少量聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP), 将
粉末转入 2 mL离心管中 , 加入 65 ℃预热提取
液 800 μL[ 20 g·L-1 CTAB, 0.1 mol·L-1 Tris
(三羟甲基氨基甲烷盐), 0.02 mol·L-1 EDTA
(乙二胺四乙酸), 1.4 mol·L-1 NaCl(氯化钠)
] , 20 μLβ-巯基乙醇 , 65 ℃水浴保温 40 min, 其间不断摇动;加入等体积的氯仿∶异戊醇(24 ∶1)混
合液 , 混匀 , 1.2万 r·min-1离心 10 min;取上清 , 加等体积饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1), 混
匀 , 1.2万 r·min-1离心 10 min;取上清 , 加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1), 混匀 , 1.2万 r·min-1离
心 10 min;取上清 , 加入 2/3体积预冷的异丙醇 , 混匀 , 钩出沉淀 , 体积分数为 70%乙醇 600 μL洗
涤 2 次 , 真 空 干 燥 , 用 200 μL TE (Tris/EDTA)缓 冲 液 溶 解 , 加 入 2 μL RNase
(多头绒孢菌核糖核酸酶), 37 ℃水浴保温 30 min, -20 ℃保存备用。
用 Genequantpro(Pharmacia)检测基因组 DNA, DNA质量浓度(mg·L-1)=光密度值 A260 ×50 ×稀
释倍数 。用 10 g·kg-1琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统 (Pharmacia)检测所提 DNA的完整性 , PCR
(聚合酶链式反应)扩增来检测 DNA提取的效果 。
2.3　PCR扩增及产物鉴定
RAPD(随机扩增多态性 DNA)-PCR扩增在 Perkin-Elmer9600 (PE9600)扩增仪上进行 , 每 20 μL
反应体系中含 2.5 mg·L-1模板 , 0.3 μmol·L-1引物 , 1.116 9 mkat·L-1 Taq酶 , 0.2 mmol·L-1
dNTP, 2.5 mmol·L-1Mg2+, 10 ×Bufer2 μL(所有试剂均购自上海生物工程公司)。扩增程序为:94
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℃预变性 300 s;94 ℃变性 30 s, 38 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 90 s, 38个循环;72 ℃延伸 420 s;4 ℃
保温。扩增产物经 10 g·kg-1琼脂糖凝胶电泳检测 , 于 VDS(微达斯)成像系统(Phamacia)中成像 。
2.4　数据统计与分析
统计 18个扩增较为稳定的引物在 5个 DNA样品中扩增的电泳带总数与多态带的数目 , 在电泳图
谱上同一个位点上有电泳带记为 1, 无电泳带记为 0, 作 0/1矩阵输入计算机。用 POPGEN32计算遗
传距离 , 构建树状图 。
3　结果与分析
3.1　DNA提取与引物筛选
CTAB法提取的 DNA纯度和含量均较高 , 电泳结果条带清晰 、 干净(图 2)。用 2个样品在 300个
RAPD引物中 , 成功筛选得到扩增性强和稳定性好的引物 18个用于最后扩增 , 图 3是引物筛选结果 ,
表 1是复筛出的 18个引物的序列和对 5个 DNA扩增的情况统计。
3.2　RAPD多态性分析
18个引物共检测到 176个位点 , 位点范围为 200 ～ 2 800 bp。表 1列出了 18个引物扩增的谱带
数 、多态带及多态带百分比 , 其中扩增带数最多的引物是 S128 , 共 14条;最少的是 S131和 S198,
各为 7条;平均每个引物扩增 9.8条带 , 其中 88个条带表现为多态性 , 占总带数的 50%;多态性最
高的是 S148, 多态带百分比达到 87.5%。这表明 5个单株间的 RAPD多态性并不丰富。图 4是 S125
和 S127引物的扩增结果。
表 1　引物及其序列和扩增结果
Table2　Listoftwentyprimers, theirsequences, andamplificationresults
引物 序列 5′～ 3′ 总扩增带数 多态带数 多态带百分比 / %
S100 TCTCCCTCAG 8 4 50.0
S117 AGGGCCGTCT 9 6 66.7
S118 GTCAGGGCAA 9 6 66.7
S119 CCAGTACTCC 11 8 72.7
S122 CCGCCTAGTC 13 9 69.2
S125 AGTCGGGTGG 10 5 50.0
S126 CTGGGTGAGT 12 6 50.0
S127 AAAGGGGTCC 12 6 50.0
S128 GAGTCAGCAG 14 11 78.6
S131 TCTGGACGGA 7 2 28.6
S133 GACCAATGCC 10 1 10.0
S148 GAAGCCAGCC 8 7 87.5
S153 AGATCCCGCC 8 5 62.5
S158 CCTGCTCATC 8 4 50.0
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续表 1
引物 序列 5′～ 3′ 总扩增带数 多态带数 多态带百分比 / %
S191 AGTCGGGTGG 8 1 12.5
S198 GGCTGGTTCC 7 1 14.3
S220 GACCAATGCC 12 3 25.0
S221 CATCGCCGCA 10 3 30.0
合计 176 88 50.0
图 4　S125和 S127引物扩增结果
Figure4　TheresultofamplipicationwithS125 andS127 primersamplified
3.3　遗传距离聚类分析
用 POPGEN32软件分析 RAPD扩增结果 , 得到天目铁木株间遗传距离矩阵(表 2), 亲缘关系聚
类图(图 5)。结果显示:5个植株间 , 5号植株与 4号植株之间遗传距离最小 , 为 0.133 5, 表明两者
亲缘关系最近;3号植株与 1号植株之间遗传距离最大 , 为 0.461 0, 表明两者亲缘关系最远 。而 1
号植株与其他 4株之间的遗传距离为 0.366 5 ～ 0.461 0, 表现出较远的亲缘关系 , 聚类时被聚在其他
4株之外 。
图 5　遗传距离聚类图
Figure5　Dendrogrambasedonthegeneticdistancesgenerated
表 2　遗传距离矩阵
Table2　Matrixofgeneticdistances
个体编号 1 2 3 4 5
2 0.366 5
3 0.461 0 0.180 1
4 0.416 9 0.200 7 0.207 6
5 0.434 3 0.173 3 0.265 2 0.133 5
　
4　讨论
4.1　野生天目铁木植株间遗传多样性与分布的物理距离
实验以残存的 5株天目铁木植株作为研究对象 , RAPD标记分析得出的遗传差异与现实的植株分
布差异是相符的 。其中 1号植株表现出与其他 4株有比较大的差异 , 遗传距离为 0.366 5 ～ 0.461 0,
聚类时被聚在其他 4株之外 , 并与 2 ～ 5号植株相距 400 m左右;2 ～ 5号植株间的遗传距离都不大 ,
307　第 25卷第 3期 王祖良等:濒危植物天目铁木遗传多样性的 RAPD分析 　
物理距离也是很贴近的 , 而遗传距离最小的是 5号植株与 4号植株之间 , 为 0.133 5, 物理距离上也
是相距最近的 2个单株。
4.2　对天目铁木物种保护的建议
研究表明 , 1号植株与其他几株有较大的遗传差异 , 应予重点保护 。由于 1号植株半个世纪前就
遭雷击 , 现已出现自顶向下的腐烂 , 生长势不理想 , 必须从速予以抢救。从物种的繁衍规律来看 , 一
定要有相当的遗传变异才能实现自然的恢复。所以 , 当务之急就是需要加强对 5个野生植株的保护。
近期 , 管理机构应组织人员对野生植株所在范围进行表土翻耕 , 竹根清理 , 并作围栏加以保护 。从长
远看 , 必须每年收集种子 , 培育苗木 , 建立人工群体 , 通过保护有限的遗传突变和重组类型最大限度
地保护天目铁木的遗传多样性 , 为该物种的长期生存增加可能性 。
致谢:研究得到浙江林学院浙江省现代森林培育技术重点实验室王正加副教授的悉心指导 , 野外作业
中得到天目山国家级自然保护区管理局刘亮 、 徐良先生的大力支持 , 谨致谢意 !
参考文献:
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[ 8] 王正加 , 黄坚钦 , 郭传友 , 等.山核桃 RAPD反应体系的优化 [ J] .浙江林学院学报 , 2003, 20(4):429-433.
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