全 文 ：学 报
JournalofChinaPharmaceuticalUniversity　2010, 41(5):424-427
地蚕中抗肿瘤成分的研究
金　晶 1 ,李红琴 2 ,濮存海 3＊
(1延边大学药剂学教研室 ,延吉 133000;2南京医药产业(集团)有限责任公司规划发展部 ,南京 210008;
3南京中山制药有限公司技术中心 , 南京 210012)
摘　要　从地蚕(StachygeobombycisC.Y.Wu)中首次分得具有抗肿瘤活性的已知化合物芹菜素-7-O-(6″-反式-对香豆
酰)-β-D-半乳糖苷(ACGR)。用 MTT法初试其抗肿瘤活性 , 并采用 HPLC法测定了其在地蚕植物中的含量。 实验初步证
明地蚕中黄酮苷类化合物可能具有抗肿瘤活性 ,为地蚕抗肿瘤作用进一步研究提供了方向。
关键词　地蚕;抗肿瘤作用;芹菜素-7-O-(6″-反式-对香豆酰)-β-D-半乳糖苷
中图分类号　R284;R285　　文献标识码　A　　文章编号　1000 -5048(2010)05 -0424 -04
Anti-tumorcomponentsinStachygeobombycis
JINJing1 , LIHong-qin2 , PUCun-hai3＊
1DepartmentofPharmaceutics, YanbianUniversity, Yanji133000;2DepartmentofPlanningandDevelopment, NanjingPharmaceutical
GroupCo., Ltd., Nanjing210008;3TechnologyCenter, NanjingZhongshanPharmaceuticalCo., Ltd., Nanjing210012 , China
Abstract　Thecompoundwithanti-tumoractivitywasisolatedandidentifiedasapigenin7-O-(6″-(E)-p-cou-
maroyl)-β-D-galactopyranoside(ACGR)fromStachysgeobombycisC.Y.Wuforthefirsttime.Itsantitumor
activitywasevaluatedbyMTTmethod, anditscontentwasdeterminedbyHPLC.Thepreliminaryassayresult
ilustratestheanti-tumorpotentialofflavonoidsinStachysgeobombycisC.Y.Wu, andprovidesanapproachto
clinicalapplicationofStachysgeobombycisC.Y.Wuincancertherapy.
Keywords　Stachygeobombycis;anti-tumoractivity;determination;apigenin7-O-(6″-(E)-p-coumaroyl)-β-
D-galactopyranoside
ThisstudywassupportedbytheNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(863 Program)(No.
2004AA2Z3310)
　　地蚕(StachygeobombycisC.Y.Wu)为唇形科
水苏属多年生草本植物 ,又称为肺痨草 、土冬虫草 、
白冬虫草 、草石蚕 、地溜儿等。主要分布于浙江 、江
西 、福建 、湖南 、广东及广西[ 1-2] 。地蚕在我国民间
用药历史悠久 ,具有益肾润肺 、滋阴补血 、清热除烦
之功效 ,主治肺结核咳嗽 、肺虚气喘 、吐血 、盗汗 、贫
血 、小儿疳积等症状。该属植物多具有抗氧化 、抗
炎 、利胆 、收缩子宫 、降压 、抗突变等作用 [ 3-4] 。张
磊等[ 5]对 10个不同产地的地蚕药材 HPLC指纹图
谱进行分析 ,发现不同产地地蚕药材化学组成相
似 ,其相对比例比较稳定 ,指纹图谱相似度较好 ,可
用于地蚕的鉴定及质量控制。本文分离并鉴定了
化合物芹菜素-7-O-(6″-反式 -对香豆酰)-β-D-半乳
糖苷(ACGR),采用 MTT法测定其具有抗肿瘤活
性 ,且呈现一定的浓度依赖性 。采用 HPLC法测定
了其在地蚕植物中的含量 ,为进一步的研究开发提
供了实验依据。本法操作简便 ,结果准确可靠 。在
本法研究之前国内外文献均未见有关该化合物的
药理活性及含量测定方法研究的报道。
　材　料
1.1　仪　器
日本岛津高效液相色谱仪 (LC-20AB, SPD-
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＊ 收稿日期　2010-04-12　　通讯作者　＊　Tel:025-52154693　E-mail:pucunhai@163.com
基金项目　国家高技术研究发展计划(“八六三 ”计划)资助项目(No.2004AA2Z3310)
第 5期 金晶等:地蚕中抗肿瘤成分的研究
M20A, CTO-10VS, SIL-20A), LCsolution色谱工作
站 。 XT-4显微熔点测定仪 (温度计未校正);
BruckerACF-300及 AV-500型核磁共振仪 (TMS
内标);柱色谱和薄层色谱硅胶 (青岛海洋化工
厂);XD-101型倒置显微镜 [南京江南光电 (集
团)股份有限公司 ] ;ELX800酶联免疫检测仪 (美
国 Bio-Tek公司);电光分析天平(北京赛多利斯实
验仪器系统有限公司)。
1.2　试　剂
ACGR对照品(自制);地蚕药材(采自浙江乐
清 、雁荡山 、平阳 ,经江苏省药品检验所董小平主任
药师鉴定为唇形科水苏属植物地蚕 (Stachys
geobombycisC.Y.Wu);RPMI1640培养基 、EDTA
(美国 Gibco公司);胎牛血清 、小牛血清(杭州四
季青生物工程公司);MTT(美国 Fluka公司);甲醇
为色谱纯;纯净水为自制。
1.3　细胞株
肝癌细胞 HepG2和结肠癌细胞 HCT-116(由
中国科学院上海细胞库引进 ,江苏省肿瘤发生与干
预重点实验室保存)。
　方法与结果
2.1　成分分离
地蚕药材粗粉 8.3 kg,超临界提取挥发油后得
萃余物 8.2kg。取地蚕超临界萃余物 8.0kg,分别
用 8、6、6倍体积的 80%乙醇回流提取 3次 ,每次
2 h,合并提取液 ,减压浓缩至无醇味 ,加适量水稀
释 ,依次用石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取 。乙酸乙
酯部分经反复硅胶柱色谱及重结晶后 ,分离得到芹
菜素 -7-O-(6′-反式-对香豆酰 )- β-D-半乳糖苷
(760mg)。
2.2　结构鉴定
化合物为黄色粉末 , mp:194 ～ 196℃(甲醇),
易溶于二甲亚砜 、二甲基甲酰胺等有机溶剂 ,盐酸-
镁粉反应及 molish反应均呈阳性 , AlCl3显亮黄色。
ESI-MSm/z:579 [ M+H] + , 结合 1HNMR和 13C
NMR数据推算其分子式为 C30 H26O12。1HNMR
(DMSO, 300 MHz)δ:12.98(1H, s, 5-OH), 10.40
(1H, s, 4′-OH), 10.00(1H, s, 4 -OH), 7.95(2H,
d, J=8.7 Hz, H-2′, 6′), 7.50(1H, d, J=15.9 Hz,
H-7 ), 7.38(2H, d, J=8.4 Hz, H-2 , 6 ), 6.94
(2H, d, J=8.7Hz, H=3′, 5′), 6.84(1H, s, H-3),
6.82(1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.67(2H, d, J=8.4
Hz, H-3 , 5 ), 6.48(1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 6.34
(1H, d, J=15.9 Hz, H-8 ), 5.17(1H, d, J=6.9
Hz, H-1″)。13C-NMR(DMSO, 125 MHz)δ:181.90
(C-4), 166.36(C-9 ), 164.21(C-2), 162.66(C-
7), 161.30(C-5), 161.09(C-4′), 159.72(C-4 ),
156.84(C-9), 144.84(C-7 ), 130.00(C-2 , 6 ),
128.46(C-2′, 6′), 124.85(C-1 ), 120.94(C-1′),
115.93(C-3′, 5′), 115.61(C-3 , 5 ), 113.70(C-
7 ), 105.32(C-10), 102.98(C-3), 99.47(C-1″),
99.43(C-6), 94.67(C-8), 76.20(C-5″), 73.80(C-
3″), 72.92(C-2″), 69.95(C-4″), 63.37(C-6″)。以
上数据与文献 [ 6]报道的数据基本一致 ,鉴定该化
合物为芹菜素-7-O-(6″-反式 -对香豆酰)-β-D-半乳
糖苷 [ (apigenin7-O-(6″-(E)-p-coumaroyl)-β-D-
galactopyranoside)] 。
2.3　药理活性测试
2.3.1　体外细胞培养　将 HepG2和 HCT-116细
胞以适量浓度接种于培养瓶中 ,加入含 10%小牛
血清的 RPMI1640培养液 ,置 37 ℃恒温 、5% CO2
及饱和湿度的培养箱中培养 ,细胞呈贴壁生长 。每
2 ～ 3天传代 1次 ,使细胞保持在对数生长期 。传
代时用 0.02%EDTA溶液消化 2 ～ 3 min,弃去消化
液 ,加入新培养液吹打均匀 ,按所需细胞量移入新
培养瓶中 ,添加适量完全培养液。
2.3.2　MTT法　取处于对数生长期的 HepG2和
HCT-116细胞 ,用 0.02%EDTA溶液消化 ,制成细
胞悬浮液 ,调整细胞浓度为每毫升 1 ×105个 ,将细
胞悬浮液接种于 96孔酶标板内 ,每孔 100 μL,设
3个复孔 ,置 37 ℃、5% CO2孵箱内培养 24 h左右 ,
再分别每孔加入 100 μL终浓度为 100.00, 50.00,
25.00, 12.50, 6.25, 3.13, 1.56 μmol/L的受试药
物 ,空白对照孔加入新的培养液 100 μL, HepG2细
胞阳性对照孔加入藤黄酸 100 μL(终浓度为
100.00 μmol/L)。继续培养 24 h后 , 每孔加入
5mg/mL的 MTT溶液 20 μL继续培养 4 h,弃去全
部上清液 ,每孔加入 DMSO100 μL溶解染色细胞 ,
微型振荡器上振动 5 min,待结晶完全溶解后 ,于酶
联仪 570 nm处测定吸收度(A), A越高表明活细胞
数也越多。根据 A计算药物对肿瘤细胞生长的抑制
率。抑制率(%)=(1-加药组 A/对照组 A)×100。
2.3.3　统计学处理 　应用 SPSS15.0软件及
425
学 报 　 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 第 41卷
Graphpadprism软件进行数据处理。
2.3.4　实验结果　采用 HepG2和 HCT-116细胞
测定了 ACGR的体外抑制肿瘤细胞生长活性及
IC50 ,结果见表 1。
Table1　Inhibition(%)ofACGRontwokindsoftumorcels( x±s, n=3)
Group c/(μmol/L) HepG 2 HCT-116
Control 0 0
ACGR 1.56 14.43 ＊＊ 9.40＊
3.13 24.31＊＊＊ 25.63＊＊＊
6.25 41.13＊＊＊ 42.42＊＊＊
12.50 49.67＊＊＊ 59.93＊＊＊
25.00 58.20＊＊＊ 72.29＊＊＊
50.00 72.37＊＊＊ 80.90＊＊＊
100.00 88.36＊＊＊ 92.09＊＊＊
Morelicacid 100.00 99.90 -
ACGR:7-O-(6″-(E)-p-coumaroyl)-β-D-galactopyranoside
＊P<0.05, ＊＊ P<0.01, ＊＊＊P<0.005vscontrolgroup
由上述数据可知 , ACGR对两种肿瘤细胞增殖
均有抑制作用 ,且两种肿瘤细胞显示了相似的药物
敏感度 ,抑制率和空白对照组比较都有非常显著性
差异 (P<0.005), 并且具有明显的量效关系。
ACGR对 HepG2和 HCT-116细胞的 IC50分别为
10.50和 8.47 μmol/L,藤黄酸对 HepG2的 IC50为
6.06μmol/L。
2.4　含量测定
2.4.1　色谱条件 　色谱柱:HypersilC18(5 μm,
4.6mm×250 mm);流动相:甲醇-水(50∶50);流
速:1mL/min;检测波长:316nm;进样量:10μL;柱
温:40 ℃;理论塔板数按对照品峰来计算应不低于
3 000,分离度应大于 1.5。
2.4.2　对照品纯度测定　精密吸取对照品储备液
0.2mL置 10 mL量瓶中加甲醇至刻度 ,得供试液。
分别吸取对照品储备液与供试液各 10 μL进样 ,经
计算得对照品纯度为 97.63%。
2.4.3　标准曲线的绘制　分别精密吸取对照品储
备液按二倍稀释法依次得到质量浓度为 6.25、
12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL的一系列对照
品溶液 ,各 10μL进样。回归方程为 Y=25 774X-
45 465 ,相关系数 r=1.000 0。结果表明:ACGR在
浓度 6.25 ～ 100.00 μg/mL范围内线性关系良好 。
2.4.4　进样精密度　精密吸取质量浓度为 0.025 0
mg/mL的对照品溶液 ,按照上述色谱条件进行测
定 ,重复进样 6次 ,测得峰面积积分值的 RSD为
0.52%。结果表明:进样精密度良好。
2.4.5　重复性 　取地蚕全草细粉(过 80目筛)
6份 ,每份约 1.0 g,精密称定 ,按供试品溶液的制
备方法依法制备 ,按上述色谱条件测定 ,其 RSD为
1.00%,表明法重现性较好 。
2.4.6　稳定性　任取一份 “ 2.4.5”项中样品溶
液 ,室温放置 ,在 0 , 3, 6, 9, 12h各进样 10μL,结果
其 RSD为 0.45%,表明样品溶液在 12h内稳定 。
2.4.7　加样回收率　取已知含量的同批地蚕药材
9份 ,每份约 0.5 g,精密称定 ,每 3份为一组 ,每组
按 0.5 g药材中含有 ACGR含量的 80%、100%和
120% 3个比例分别加入对照品溶液 ,按供试品溶
液的制备方法依法制备 。按上述色谱条件进行测
定 ,每次 10 μL。结果平均回收率为 101.19%,
RSD为 0.86%,表明本法具有良好的回收率。
2.4.8　不同产地药材含量测定　取浙江平阳 、乐
清 、雁荡山 3个不同产地的地蚕药材及广西产草石
蚕药材 ,按供试品溶液的制备方法依法制备 ,按上
述色谱条件测定。结果浙江 3个产地的地蚕药材
中 ACGR的含量基本一致 ,但在地蚕伪品(草石
蚕)中未测出该化合物 ,可以作为判断地蚕药材真
伪的一个指标。结果见表 2和图 1。
Table2　ContentofACGRinStachygeobombycisfromdiferentlocations
Source　　 Content/(mg/g)
Pingyang-1, Zhejiang 6.30
Pingyang-2, Zhejiang 6.33
Leqing-1, Zhejiang 6.25
Leqing-2, Zhejiang 6.28
Yandangshan-1, Zhejiang 6.29
Yandangshan-2, Zhejiang 6.20
Caoshican-1, Guangxi 0
Caoshican-2, Guangxi 0
Figure1　HPLCspectrogramofdiferentsamplesofStachygeobombycis
A:ACGR;B:Stachygeobombycis;C:S.sieboldiMig
　讨　论
本实验共分离出 11个化合物 ,根据其理化性
质及波谱数据鉴定了其中 8个化合物 ,有 3个为首
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第 5期 金晶等:地蚕中抗肿瘤成分的研究
次从本植物中分离得到。
取浙江平阳 、乐清 、雁荡山 3个不同产地的地
蚕药材及广西草石蚕药材进行了含量测定 ,结果显
示 ,浙江产地蚕中 ACGR的含量基本一致 ,但在伪
品草石蚕中未测出该化合物 ,可以作为判断地蚕药
材真伪的一个指标。
芹菜素类化合物能抑制肿瘤细胞的增殖 、侵袭
和转移 ,干扰肿瘤细胞的信号传导 ,诱导肿瘤细胞凋
亡 ,抗氧化等[ 7] 。ACGR目前尚未见药效方面的报
道 ,本研究显示其在体外对 HepG2和 HCT-116细胞
的生长具有一定的抑制作用 ,且呈一定的量效关系 。
其体内是否具有抗肿瘤活性 ,尚待进一步研究。
地蚕作为新药材最早用于肺痨康胶囊中 ,现有
江苏省药材标准 ,但质量控制方面尚无含量测定
项 。根据实验结果可初步定为:本品按干燥品计
算 ,药材中含芹菜素-7-O-(6″-反式-对香豆酰)-β-
D-半乳糖苷(C30H26O12)应不低于 0.60%,本文为
地蚕药材标准的修订进行了有益尝试 。
致谢:中国药科大学郭青龙老师协助完成药效实验 , 化合
物解谱工作由中国药科大学冯峰老师给予指导。
参考文献
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