全 文 ：收稿日期:2005-08-02　　　修回日期:2005-10-26
通讯联系人:严宝珍 , 女 ,教授 , 从事波谱序研究.
第 22卷第 5期
Vol. 22　No. 5 分 析 科 学 学 报JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE 2006 年 10 月Oct. 2006
文章编号:1006-6144(2006)05-0563-04
七叶一枝花中薯蓣皂苷的分离及结构鉴定研究
崔　艳1 , 张秀凤2 , 刘　扬2 , 严宝珍*1
(1.北京化工大学理学院 ,北京 100029;
2. 中国科学院化学研究所 ,分子动态与稳态结构国家重点实验室 ,北京 100080)
摘　要:本文利用高效液相色谱-串联质谱联用方法研究了七叶一枝花中的薯蓣皂苷。
实验采用高效液相色谱分离了七叶一枝花中的 3种薯蓣皂苷;通过与电喷雾质谱联用
获得了这几种化合物的分子量信息;再用 MS /MS 获得了这几种化合物进一步的结构
信息。采用此方法可快速分析鉴定从七叶一枝花中分离得到的薯蓣皂苷。
关键词:七叶一枝花;甾体皂苷;薯蓣皂苷;高效液相色谱-串联质谱
中图分类号:O657. 63　　　文献标识码:A
1　前言
七叶一枝花(Paris polyphy l la Smith)是百合科重楼属植物 ,其药用历史悠久 ,具有清热解毒 、消肿止
痛 、凉肝定惊之功效 ,主治痈肿疮毒 、咽肿喉痹 、乳痈 、蛇虫咬伤 、跌打伤痛 、肝热抽搐[ 1] 。甾体皂苷为该植
物的活性成分。其中 ,薯蓣皂苷和偏诺皂苷是主要存在形式 。较多药理实验表明该属植物具有止血[ 2] 、抗
肿瘤[ 3] 、免疫调节[ 4] 及心血管[ 4] 等多方面的生理活性 。
甾体皂苷类化合物的分子量大 、极性大 ,分离难度大;同时 ,化合物分子中无共轭吸收双键 ,这也给检
测带来较大困难 。近年来 ,高效液相色谱法(HPLC)已成为分离 、分析甾体皂苷的主要方法[ 5 - 7] 。有关甾
体皂苷的电喷雾串联质谱(ESI-MS /MS)研究已有文献[ 8 - 10] 报道。高效液相色谱与电喷雾串联质谱联用
是近几年新发展起来的分析方法之一 ,在天然产物化学成分研究中得到广泛的应用 。但有关重楼属植物
中甾体皂苷的 HPLC-ESI-MS /M S研究目前还未见报道 。本文利用 HPLC-ESI-MS /MS 联用技术详细研
究了七叶一枝花中的薯蓣皂苷 。
2　实验部分
2. 1　仪器与设备
美国Waters Alliance 2695高效液相色谱仪 /Qua tt ro Premier 三重四极杆质谱联用系统;MassLynx
软件;Water s XTerra®MS C18色谱柱(150×2. 1 mm ,5 μm)。
2. 2　试剂与材料
甲醇 、乙腈为色谱纯(美国 , Fisher 公司),实验用水为 Milli-Q 超纯水;提取分离用溶剂均为分析纯
(北京化工厂);大孔树脂 D-101(天津蚌埠天星),柱层析硅胶(青岛海洋化工厂),反相硅胶 Rp-18(日本 ,富
士),葡聚糖凝胶 LH-20(Pharmacia , Sw eden)。
七叶一枝花购自湖南张家界市医药有限责任公司饮片加工厂。
2. 3　样品的提取与分离
七叶一枝花根部切片 ,参考文献[ 11 -15] 方法 ,经 95%乙醇浸煮提取得浸膏 ,经硅胶柱层析(石油醚→氯
仿→乙酸乙酯→丙酮→正丁醇→甲醇)得 A 、B 、C 、D 、E 、F 段 。D段经大孔树脂 D-101 ,从 80%乙醇洗脱得
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DA 。DA经硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶水=5∶1∶0. 1 , V /V),收集馏分 46-50得 DA-8 ,析出沉淀部分 DA-8-1
经 Rp-18柱层析(甲醇∶水=9∶1),收集馏分 7-9得 DA8-1-2 ,标记为薯蓣皂苷 A 。DA经硅胶柱层析 ,馏分
106-130合并为 DA-14 ,经 Rp-18柱层析(甲醇∶水=9∶1 ,V /V),收集馏分 6-12得 DA-14-7 ,标记为薯蓣皂
苷 B。
薯蓣皂苷 A 和 B经质谱 、核磁共振波谱解析 ,鉴定结构为:薯蓣皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基(1→
4)-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖苷(A)和薯蓣皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖基(1→4)-α-L-鼠
李吡喃糖基(1→4)-[ α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)]-β-D-葡萄吡喃糖苷(B),与 Toshihi ro 等[ 14] 所报道的为相
同物质 ,其结构如图 1所示。
Fig. 1　The structures of diosgenin glycoside A and B
七叶一枝花提取物(EC-9):E段经大孔树脂 D-101 ,从 80%乙醇洗脱得 EC 。EC经硅胶柱层析(氯仿
∶甲醇∶水=5∶1∶0. 1 ,V /V),收集馏分 49-68得混合物 EC-9。测试样品用色谱纯甲醇溶解 ,经 0. 45μm 滤
膜过滤后进样测定。
2. 4　色谱条件
WatersXTer ra
®
MS C18色谱柱(150×2. 1 mm ,5 μm);1%甲酸水溶液-乙腈线性洗脱:0 ～ 12 min(60∶
40), 12 ～ 15 min(40∶60);流速 0. 2 mL /m in;进样量:5 μL ;柱温:室温 。
2. 5　质谱条件
电离方式:ESI+;锥孔电压:20 V;电离电压:3 kV;离子源温度:80℃;去溶剂气:N 2 ;去溶剂气温度:
180℃;去溶剂气流速为 350 L /h;锥孔气流速:50 L /h;全扫描范围:m /z 350 ～ 1 200。MS /MS 方式的碰撞
气为氦气;碰撞室压力:1×10 - 4 mba r。
3　结果与讨论
3. 1　薯蓣皂苷 A与 B的 HPLC-ESI-MS/MS分析
在实验所选定条件下 , 对薯蓣皂苷 A 和 B 分别进样分析 , 所得的保留时间 tA =10. 28 min ,
tB =8. 87 min。由于薯蓣皂苷分子对阳离子具有较强的亲合性 ,在联用的电喷雾质谱正离子检测图谱中 ,
可观察到[ M+H] +和[ M +NH 4 ] +等准分子离子峰。但不同的皂苷分子加合分子离子峰情况有所差别 ,
基峰为[ M +H] +或[ M +NH 4 ] +。皂苷 A 的基峰为[ M +H] +(m /z855), 而皂苷 B 的基峰为[ M +
NH 4] +(m/z1032)。故皂苷 A的分子量为 854 ,皂苷 B的分子量为 1014。利用三重四极杆质谱的碰撞诱
导解离(CID)技术 ,分别选择薯蓣皂苷 A 和 B的准分子离子[ M +H] +进行子离子扫描分析 ,实验结果如
表 1所示 。
由表 1可见 ,[ M +H] +(m /z 855)离子在一定能量碰撞下 ,连续失去一系列的糖基碎片。首先失去末
端质量数为 132的阿拉伯呋喃糖基 ,生成 m /z723离子 ,该离子进一步碎裂失去 1个鼠李吡喃糖基(146)
碎片生成 m /z 577离子 ,随后 m /z577离子又丢失 1个葡萄吡喃糖基(162),最后生成 m /z415离子。其中
m/z415为薯蓣皂苷元的准分子离子 ,苷元准分子离子又失去一分子水 ,形成 m /z 397的离子。在实验所
设碰撞电压下 ,薯蓣皂苷元和糖基未发生进一步裂解。此裂解结果说明了薯蓣皂苷 A 为含有 3个糖基与
薯蓣皂苷元的甾体皂苷 ,其中葡萄吡喃糖基为与薯蓣皂苷元直接相连的糖基 ,而阿拉伯呋喃糖基与鼠李吡
喃糖基为分别连在葡萄吡喃糖基上的两个端基糖;皂苷 B 的准分子离子[ M +H] +的子离子扫描质谱裂
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解方式类似于皂苷 A:m /z1015 、723 、577 、415 、397分别代表[ M +H] + 、[ M-rha+H ] + 、[ M-2rha+H] + 、
[ M-3rha +H] + 、[ M-3rha-glu+H] +和[M-3rha-g lu-H2O+H] +离子。表明了薯蓣皂苷 B的结构是薯蓣
皂苷元直接与葡萄吡喃糖基相连 ,葡萄吡喃糖基上连有三个端基鼠李吡喃糖基 。
本文还对提取分离得到的单一化合物薯蓣皂苷 A 和 B 进行了核磁共振波谱表征(1H NMR 、
1 3C NMR 、DEPT-135 、HSQC 、HMBC和1H-1H COSY),鉴定其结构(如图 1)。核磁推断结果证明了由串
联质谱得到的结构信息的正确性与可靠性。
Table 1　Daughter scan data of diosgenin glycosides A and B
Saponin Daughe r scan data
A:ar a-g lu
rha
-diosgenin
855
- 132
723
- 147
577
- 162
415
- 18
397
B:rha-rha-g lu
rha
-dio sg enin
1015
- 146
869
- 146
723
- 146
577
- 162
415
- 18
397
3. 2　七叶一枝花提取物的 HPLC-ESI-MS/MS分析
对七叶一枝花提取混合物(EC-9)进行分离分析 。由得到的总离子流色谱图(图 2)可见:混合物中含
有的 3个化合物;采用 2. 4节 HPLC 色谱分离条件 ,混合物中的上述组分得到了良好的分离 。保留时间
为 8. 64 、9. 94 min的色谱峰对应的化合物分别为薯蓣皂苷 B和 A;保留时间为 9. 47的色谱峰对应的化合
物标记为 C ,其色谱峰位于 B和 A 之间 ,这说明 C与 B 、A 的保留特性相似。
在一级电喷雾质谱图上 , C的准分子离子峰[ M+H] +的 m /z 为 885 ,可知其分子量为 884。在准分子
离子[ M+H] +的子离子扫描质谱图(图 3)中 ,有丰度较高的[ dio sgenin+H ] +(m /z415)和[ diosgenin-
H 2O+H] +(m /z397)碎片离子 ,类似于薯蓣皂苷 A 和 B ,由此可判定 C 与 A 、B 具有相同的母核 ,为一种
薯蓣皂苷 。C的准分子离子[ M+H] +m /z885失去质量数 162(葡萄吡喃糖基)的中性碎片得到 m /z723
的碎片离子 ,离子 m /z723 失去质量数 146(鼠李吡喃糖基)的中性碎片得到 m /z577 的碎片离子 ,离子
m/z577又失去质量数 162(葡萄吡喃糖基)的中性碎片得到 m /z415 的碎片离子[ diosgenin+H] +。表明
化合物C 为分子中含有两分子葡萄糖 、一分子鼠李糖和薯蓣皂苷元的甾体皂苷。从A 、B的裂解规律可判
断化合物 C 的薯蓣皂苷元直接与葡萄吡喃糖基相连 。葡萄吡喃糖基可能在某位上连有-鼠李吡喃糖基-葡
萄吡喃糖基的糖链 ,或在某两个位置上分别连有一分子的鼠李吡喃糖基和一分子的葡萄吡喃糖基。从化
合物 C 的保留时间与质谱的裂解情况来判断 ,与薯蓣皂苷 A 和 B 的极为相似 ,因此在葡萄吡喃糖基某两
个位置上分别连有两个糖基的可能性较大 ,初步推断与文献[ 16] 分离出的纤细薯蓣皂苷为同一物质。
Fig. 2　Total ion current chromatogram of EC-9　　　Fig. 3　Daughter scan spectrum of the compound C
4　结论
本实验采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用方法详细研究了七叶一枝花中的两种单一薯蓣皂苷 ,
得到了它们的保留时间 、质谱特征图谱以及质谱裂解规律等信息 ,并据此快速分析了七叶一枝花提取物中
另一薯蓣皂苷的结构 ,为薯蓣皂苷类化合物的结构鉴定奠定了基础。本文所用方法方便 、快速 、可靠 ,也适
用于其它天然产物的开发和研究。
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Study on Diosgenin Glycosides from Paris polyphylla Smith
by High Performance Liquid Chromatography-
Tandem Mass Spectrometry
CU I Yan
1 , ZHANG Xiu-feng2 , LIU Yang2 , YAN Bao-zhen*1
(1. Facul ty o f Science ,Bei j ing Universi ty o f Chemistry Technolog y ,Bei j ing 100029;
2. State K ey Laboratory f or Structural Chemistry of Unstable and S table S pecies ,Center
f or Molecular science , Insti tute of Chem istry ,Chinese Academy of S ciences ,Bei j ing 100080)
Abstract:A High Performance Liquid Chromato graphy /Elect rospray ionization mass spect rometry
(HPLC-ESI /M S-MS) method has been developed fo r the analy sis and identif ication of dio sgenin
gly cosides ex t racted from Paris poly phy l la Smith. Samples w ere analyzed by a reve rsed-phase C18
column using a binary eluent under g radient condit ions. T hree dio sgenin g lycoside s could be separated
and detected. The [ M +H ] +ions of dio sgenin g ly co sides in the posi tive mode w ere observed for mo lecule
mass information. Daughte r scan experiments(MS /M S)were carried out in order to ident ify the
f ragmental and structural information of diosgenin gly cosides. Fo r diosgenin gly co sides , [ M +H] + ions
in the present experiment only produced the f ragment ions by the lo ss of sugar units;the characteristic
f ragments w ere used to provide the sequence and some linkage info rmation of sugar moiet ies of saponins.
Especially , their f ragment difference st rong ly dependeds on the species of sugars as wel l as the linkage
between the ag lycone and the sugar moieties.
Keywords:Paris polyphy l la Sm ith;S teroid saponins;Diosgenin gly co sides;High performance liquid
chromatog raphy-tandem mass spect rometry
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