全 文 ：第 4卷 第 i期 V o l 。 4No 。
1 9 3 8年 3月
热 带 作 物 学 报
N C H I E E SJOU R N ALT O FR O PR L I C AO P C SMa r
.
1 9 83
灰叶剑麻 ( Ag a v eof u c ro ry des )
叶片中一种蛋白酶的分离纯化
沈家柏 叶启腾 郑安乐
(广西亚热带作物研究所 )
摘 要
从灰叶剑麻 ( Ag a v eof 盯 。 ro y des )叶片中分离出一种蛋白酶 。 它经过硫酸钱盐析及 CM一 1
柱层析 , 纯化了 6 . 27 倍 。 酶样品经凝胶 电泳分析为纯一成分 , 其分子量约为3。。。。 。
月lJ 舀
灰叶剑麻 ( A g a ve fo lr c r o y d e s ) 是一种重要的经济作物 , 在墨西哥等地有大量栽培 。
我国也早已引入试种 。 灰叶剑麻的主要产品是硬质纤维 ( h e en q ue n ) , 去纤维后的 叶 渣可
提取皂素 , 也可作为奶牛等家畜的饲料 。
近年来 , 龙舌兰属植物的叶蛋白酶越来越为人们所注意 。 继早期报导从西沙 尔 麻 ( A 。
、 is al a n a ) 叶片中分离出一种金属蛋白酶 〔 “ 〕 , 以及从番麻 ( A . “ m “ r ic an a) 叶片中分离出一
种碱性蛋白酶 仁” 〕 和氨肤酶 。 ”一1约 以后 , 国内又报导了从龙舌兰 杂种 1 1 6 4 8 ( A . 五y b ir d
N o
.
1 1 6 4 8 ) 叶片中分离出琉基蛋 白酶 〔 1 , “ 〕 。 进而 , 对灰叶剑麻等 10 个龙舌兰属植物品种
进行了分析 , 证明都含有蛋白水解酶 , 业且酶的活性中心都 含有琉基 〔 3 〕 。 本文报导 对灰
叶剑麻叶蛋 白酶的分离纯化研究 。
材 料 和 方 法
1
. 酶液的提取
灰叶剑麻叶片由广西亚热带作物研究所品种园提供 , 麻株定植已达 5年 , 叶 片 生 势 良
好 , 平均每片叶重 1 1 4 2克 , 刮取叶片的栅栏组织 , 用尼龙布包裹后置压榨机中将汁水榨出 ,
榨出的汁水经 3 6 0 0克离心去除杂质后 , 立刻加入氯化汞溶液 , 使其最终浓度为 5 x 1 0 一 “ M ,
搅拌均匀后放置冰箱待用 。
2
。 蛋白水解活力的测定法
以 D H T一酪蛋白作为底物 , 按 中国科学院上海生物化学研究所的方法测定 〔 4 〕 , 以 每
分钟水解 1毫克 D H T一酪蛋白的水解力作为一个活力单位 。
3
. 蛋白质含量的测定法
采用福氏 ( F o l i n一 e i o e a l t e u ) 改 良的劳氏 ( L o w r y ) 法 〔 5 〕 。 所得的蛋白质含量可用
本文于 1 9 8 2年 10 月 6 日收到 。
9 2热 带 作 物 学 报 4 卷
于计算酶的比活值 。
4
. 硫酸铁分级盐析
酶溶液用硫酸按进行分级盐析 。 盐析在 4 ℃冰箱中进行 , 逐滴加入饱和硫酸按溶液 , 业
用磁力搅拌器使混和均匀 , 滴加完毕后静置 2 小时 , 再用 3 6 0 0克离心分离 。 第一次盐析采用
30 %的饱和度以沉降杂蛋白 , 第二次盐析采用 70 %的饱和度以沉降酶蛋白 。 离心分离所得的
酶蛋白干燥待用 。
5
. 透析
将盐析所得酶粉用尽量少的水溶解 , 装入透析袋后在 4 ℃冰箱中透析 。 透析液为含氯化
汞浓度为 5 x l 。 一 日M的去离子水 , 每 4 小时换透析液一次 , 透析 36 小时 。
6
.
C M一 ” 柱层析
层析柱大小为 1 . 2 x 20 厘米 ,装填 C M一 1 1 ,后用 O ` o o 5M磷 酸缓冲液 ( p H 7 . 0 ) 平衡 48 小
时 , 然后将透析过的样品加入 。 洗脱先用 72 毫升 。 . 0朽 M 磷酸缓 冲 液 ( p H 7 . 。 ) , 接着再
用含氯化钠 。一 。 . S N的上述缓冲液进行梯度洗脱 , 流速为每分钟 。 . 6毫升 , 每管 收 集 2 . 4毫
升 。 洗脱液抽样测定蛋白酶活力和蛋白质含量 , 亚将主要的含酶液合并后浓缩干燥 。
了 . 5 . 0 . 5 . 聚丙烯酞胺凝胶电泳
按 T . G . C 0 0 p er 〔 1 3〕 介绍的方法进行 S . D . S . 聚丙烯酞 胺 凝 胶 电 泳 。 凝 胶 的 浓 度 为
7
.
5%
, 电泳电压为 4 5伏 , 每管的初始电流为 3毫安 , 朋分钟后增大到 8 毫安 , 电泳 时 间总
计 2 小时 。 同时 , 以标准牛血清蛋白 、 胰蛋 白酶 、 蛋清蛋 白及细胞色素 C ( 分子 量 分 别 为
6 8 。。。 、 2 3 3 0 0 、 4 3 0。。及 1 70 0 ) 作为对照样品 , 与灰叶剑麻叶蛋 白酶混和进行 S . D . S . 聚 丙
烯酸胺凝胶电泳 。
结 果
灰叶剑麻叶提取液经分级盐析 、 透析和 C M一 n 柱层析后 , 酶活力 回收 率 为 4 9 . 6 4 % ,
纯化了 6 . 27 倍 。 其各步的测定数值及计算所得的比活值和活力回收率见表 1 。
表 1 灰叶剑麻叶提取液中蛋白水解醉的分离结果
分 离 步 骤
叶 提 取 液
30 % 饱和度硫酸钱盐析 (上清液 )
7 0% 饱和度硫酸按盐析
透 析
C M一 1 层析 (含酶部份收集液 )
{翌空竺登鉴i些卜竺竺业生- }些鱼空哩色}逻主暨里兰 -…. 一竺竺一 一卜一 二竺全巴一 }一止竺生一 ) 二 {卜 一
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} 1
5 6
·
7
1
18 4 3
·
2
}
1 1
·
7竺 _二一一竺二生_
注 : 纯化倍数 二 最终 比活力 _ 1 1
。
76 5
最初比 活力 1 。 8 7 5
二 6 。 2 7
灰叶剑麻叶蛋白酶的 C M一 n 柱层析的分离结果见图 1 。
经 C M一 n 柱层析纯化的灰叶剑麻蛋白酶在 S . D . S . 聚丙烯酞胺凝 胶电泳中呈单 一 染 色
带 , 以标准蛋 白样品牛血清蛋白 、 蛋清蛋白 、 胰蛋白酶及细胞色素 C作为参照 , 计算得灰叶
剑麻叶蛋 白酶的分子量约为 3 0 0 0 。 ( 详见表 2 及图 2 ) 。
1 期 沈家柏等 : 灰叶剑麻叶片中一种蛋白酶的分离纯化
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图 1 灰叶剑麻叶蛋白酶的 CM一 1 柱
层析分离结果
图 2 S . D . S . 滩丙始醉胺凝胶电泳各蛋白
质的移动率及其分子最的半对数
表 2 混合蛋白样品 5 . D . S . 聚丙始睡胺凝胶电泳的移动率
蛋 白 质
移 动 率
牛 血 清 蛋 白 蛋 清 蛋 白 }灰叶剑麻叶蛋白酶 } 胰 蛋 自 酶 } 细 胞 色 素 C
0 。 4 4 95 0
。
5 7 3 5
讨 论
龙舌兰属植物含有丰富的蛋白水解酶 〔 I J , 曾对 10 个品种的叶片进行过 测定 , 它们都 含
育蛋白水解活性 , 业且可被氯化汞溶液可逆抑制 , 显示具有琉基活性中心 的 性 质 〔 ” 〕 , 这
与木瓜蛋白酶和菠萝蛋 白酶的性质相仿 。 对龙舌兰杂种 1 1 6 4 8叶蛋白酶的分离和性能测 定 的
洁果表明 , 它确实是一种琉基蛋白酶 〔 “ 〕 。 灰叶剑麻叶蛋白酶也具有上述性质 , 因 而 在 实
捡中采用氯化汞溶液作保护性抑制 , 使酶活性表现稳定 , 提高了分离效果 。
灰叶剑麻叶蛋 白酶的分离过程比较简单 , 除贮存、 盐析和 透析是在 4 ℃冰箱中进行外 ,层
沂及 电泳都在室温 ( 20 士 5 ℃ ) 中进行 。 分离结果表明最终纯化 6 . 27 倍 , 业经电泳分析为单
一染色带 , 这一 点说明灰叶剑麻叶蛋白酶是比较稳定的 , 业且容易纯化 。 各分离步骤最终活
力回收率达 4 9 . 64 % , 说明分 离时酶活力损失较少 。
对龙舌兰属植物蛋 白酶在叶片中分布情况的研究表明 , 琉基酶集中分布在叶片表层含色
素的部份 , 而在叶片的芯部 ( 海绵组织部份 ) 却没有琉基酶活性 。 因此 , 在实验中用机械将叶
片的含酶部份刮下作为起始材料 。 这样做的好处是 : ( 1 )得到的酶液浓度大 , 处理的样品体
识大为减少 ; ( 2 )避免了叶片中不含酶部份的杂蛋白混入 , 相应来说 , 酶的分离纯化步骤得
到了简化 。 因此 , 本实验利用比较简单的分离方法得到了较好的结果 。
灰叶剑麻叶蛋白酶经 S . D . S . 聚丙烯酸胺凝胶电泳测定的分子量约为 3 0。。。 , 这与大多数
已侧定过的植物蛋白酶的分子量相接近 。 如木瓜蛋 白酶的分子量为 2 6。。。 ; 菠萝茎 酶 的分子
9 4热 带 作 物 学 报 4卷
— 一—一一一一一一一一一 - - - - - - - ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~一-量为2 8 0 0。 ;菠萝果酶的分子量有两个测定结果 , 一个为 1 8 0 0 0 , 另一个为 3 1 0 0。; 骆 驼 刺蛋
白酶的分子量为 2 0 6 。。 ; 牛角瓜蛋 白酶的分子量为 4 3 0 0 0 ; 弥猴桃蛋 白酶的分子量 为 2 3 5 0 0。
但是 , 与灰叶剑麻同属的番麻叶片中的碱性蛋白酶 , 其分子量为 5 7 0 0 0 , 显然这 两 者差距比
较大 。
对龙舌兰属植物叶蛋白酶的研究表明 , 这类资源丰富的酶是有其利用价值的 。 目前 , 国
内已经利用龙舌兰废渣制成 了蛋白酶制剂 ,业在制革工业中试用 , 得 到了良好的成果 〔 “ , 7〕 。
灰叶剑麻栽培面积广 , 产量高 , 因此 , 综合利用制取蛋 白酶制剂是有前途的 。
参 一 考 文 献
〔 1 〕 广西亚热带作物研究所综合利用组 , 19 78 : 龙舌兰麻叶汁蛋白酶 研究初况 。 热作科技通讯 , 1 9 78 ( 3 ) 。
〔 2 〕 孙崇荣等人 , 1 9 8。 : 一个新的植物蛋 白酶一剑麻琉基蛋白酶 。 科学通报 , 1 9 8。 ( 3 ) 。
〔 3 〕 广西亚热带作物研究所蛋 白酶组 , 1 9 8 0 : 龙舌兰蛋白酶研究 。 广西热作科技 , 1 9 8 (Q 2 ) 。
〔 4 〕 中国科学院上海生物化学研究所 , 19 71 : 酶制剂的生产和测定 方法 , 肠页 , 中国工业 出版社 。
[ 5 〕 坂 口进著 ( 《 植物免疫化学实验法 》 翻译小组译 ) , 1 9 7 5 : 植物免疫化学实验法 、 。 第 3 7一钓页 , 上海人 民 出版社
〔 6 〕 沈家柏 , 1 9 8 2 : 对琉基 龙舌兰蛋白酶用于制革生产的探讨 。 皮革科技 , 1 9 8 2( 5 ) : 1 30
〔 7 〕 郑有生 , 1 9 8 2 : 1 1 6 4 8蛋白酶 、 1 3 9 8蛋白酶脱毛的灰碱法脱毛对猪修饰面革质量对 比试 验 。皮革科技 , 1 9 8 2 ( 6 ) :
1 3一 15 。
〔 8 〕 K . F . T i p t o n , 1 96 5 : A g a v a i n : A M e t a l lo p r o t e i几 a s e . B . B . A . , 1 1 0 , 4 14 .
〔 9 〕 P . J . D u T o i t , 1 9 7 6 : I s o l a t i o n a n d P a r t ia l C h a r a e t e r iz a t io n o f A P r o t e a s e F r o m A g a v e a m e r ie a n a
V a r i e g a t a
·
B
.
B
.
A
. ,
4 2 7
: 8 95
。
〔 1 0〕 P . J . D u T o i t , J . C . S e h a b o r t , P . G . K e m p f f a n d D . 5 . A . L a u b s e h e r , 1 0 7 8 : A n A m in o p e p t id a s e
F r o m A g
a v e a m e r i e a n a
.
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.
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, 1 7 ( 3 )
,
3 65 1
〔 1 1〕 P . J . n u T o i t a n d J . C . s h a r b o r t , 1 9 7 8 : A n A m i n o p e p t id a s e F r o m A g a v e a m e r i e a n a . C h e m i e a
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〔1 2〕 、 P . J . D u T o i t a n d J . C . s e h a b o r t , 1 9 7 8 : A n Am i n o p e p t i d a s e F r o m A g a v e a m e r i e a n a . T h e r m o d y -
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1了( 8 ) : 3 7 7
〔1 3〕 T e r r a n e e G . C o o p e r , 1 9 7 7 : T h e T o o l s o f B io e h e m i s t r y .
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