全 文 ：2013 年第 35 卷第 2 期 中国麻业科学 PLANT FIBER SCIENCES IN CHINA
文章编号:1671 － 3532(2013)02 － 0086 － 05
烷化剂 EMS诱导剑麻愈伤组织
突变方法研究
张燕梅，李俊峰，周文钊*
(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 /海南省热带
作物营养重点实验室(筹) ，广东 湛江 524091)
收稿日期:2012 － 11 － 01
基金项目:中央级公益性科研院所基本业务费专项 ( sscri200802，1251022011010 ) ，现代农业产业技术体系建设专项资金资助
( CARS － 19)
作者简介:张燕梅( 1975 － ) ，女，博士，助理研究员。研究方向:作物育种。
* 通讯作者:周文钊，E － mail: ZWenzhao@ 163． com
摘 要:以剑麻 H． 11648 茎尖愈伤组织为材料，采用化学诱变剂 EMS ( 甲基磺酸乙酯) 诱变
处理，设置 6 个浓度梯度 ( 0 %、0． 2 %、0． 4 %、0． 6 %、0． 8 % 和 1． 0 % ) ，5 个处理时间( 2 h，4 h，
6 h，8 h和 16 h) 共 30 个处理组合，结果表明，用 0． 8 %的 EMS处理 6 h和 1． 0 %的 EMS处理 4 h，
愈伤组织死亡率分别为 52． 22 ± 1． 11 %和 56． 67 ± 1． 67 %，分化系数分别为 7． 63 ± 1． 10 和 7． 13 ±
2． 79，符合“半致死剂量”标准，可以作为筛选剑麻突变体浓度组合。
关键词:剑麻 H． 11648;化学诱变剂 EMS;愈伤组织;突变体
中图分类号:S563. 8 文献标志码:A
Mutation Method for Sisal Callus Induced by EMS
ZHANG Yan － mei，LI Jun － feng，ZHOU Wen － zhao*
(South Subtropical Crops Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences /Hainan
Provincial Key Laboratory for Tropical Crops Nutrition (being set up) ，Guangdong Zhanjiang 524091，China)
Abstract:Chemical mutagenesis EMS was used to induce callus derived from the shoot tips of Aga-
ve hybrid cv No． 11648． Thirty experimental treatments were designed based on two influential factors
which were six concentration levels (0 %、0． 2 %、0． 4 %、0． 6 %、0． 8 % and 1． 0 %) ，and five time
points (2 h，4 h，6 h，8 h and 16 h)． The results showed that the combinations of 0． 8 % EMS and 6 h，
1． 0 % EMS and 4 h could be used to screen the sisal mutants． The lethal rates of callus were 52． 22 ±
1． 11 % and 56． 67 ± 1． 67 %，the differentiation coefficients were 7． 63 ± 1． 10 and 7． 13 ± 2． 79，re-
spectively．
Key words:Agave hybrid cv No． 11648;ethyl methane sulphonate;callus tissue;mutant
剑麻为龙舌兰科龙舌兰属植物，主要分布在美洲、非洲、大洋洲等热带亚热带高温干旱的半荒
漠地带［1］，其中墨西哥资源最丰富，被认为是龙舌兰麻的起源地［2］。我国龙舌兰科植物有 7 个属
共 41 个种［3］，主要分布在广东、广西、福建、海南和云南等地［4］。近几十年，剑麻育种工作者不断
从国外引进一些新的种质资源，也先后开展了剑麻杂交育种工作，并且获得了一些优良种质［3，5］，
但剑麻种质资源严重缺乏的现象仍然存在。剑麻 H． 11648 是由 Lock 等［6］从假菠萝麻与蓝剑麻杂
交再与蓝剑麻回交后的杂交后代中筛选出来的，该品种具有叶片纤维含量高，年产叶片多，叶缘无
68
刺且抗寒等特点，自 1963 年首次从坦喀尼喀引入我国［3］，经大面积试种成功后，目前已成为我国
唯一当家品种，种植面积达 98%以上［4］。由于该品种抗真菌能力较差［6］，病虫害不断滋生，严重影
响了剑麻的高产稳产［7］，因此，开展剑麻遗传改良和种质创新尤为重要。
EMS为一种常用的化学诱变剂，自首次报道可有效诱导突变以来，已广泛应用于作物诱变育种。该
方法操作简单方便，科学工作者们常利用 EMS 诱变处理，结合其它的方法，定向的筛选抗旱［8］、耐
盐［9，10］、抗病［11，12］等新种质，已取得良好的进展。但有关剑麻 EMS诱变等方面的研究还未见报道。本研
究以剑麻愈伤组织为材料，开展剑麻 EMS诱变研究，为剑麻种质资源创新奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
剑麻 (Agave hybrid cv No． 11648)来源于本实验室保存的无菌试管苗。化学诱变剂 EMS(甲
基磺酸乙酯)购自 Sigma 公司。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 愈伤组织的诱导
以剑麻无菌苗茎尖为材料，纵切后接种于愈伤组织诱导培养基上先进行暗培养 1 － 2 各个月，
待愈伤组织诱导出后再置于半光条件下培养，愈伤组织诱导培养基为 MS + 6 － BA 2． 0 mg / l +
NAA 0． 2 mg / l +蔗糖 30 g / l +卡拉胶 7． 5 g / l。培养条件为:温度 26 ± 2 ℃，光照 12 h /d，光强
1500 lux。每 4 周继代 1 次。
1． 2． 2 EMS诱变处理
0． 1 mol / l的磷酸缓冲液的配制和使用方法参照文献［13］，经高压灭菌后保存备用。以磷酸缓
冲液为溶剂，分别配制浓度为 0． 2 %、0． 4 %、0． 6 %、0． 8 % 和 1． 0 %的 EMS 处理液，并以不加
EMS的磷酸缓冲液为对照，分别处理 2 h，4 h，6 h，8 h和 16 h。取黄豆大小的淡黄绿色的块状或团
状的愈伤组织于以上浓度的 EMS处理液中进行 EMS 诱变处理，处理完后用无菌水漂洗 3 － 5 次，
用滤纸吸干后接种于愈伤组织诱导培养基上培养 2 周，然后再转入不定芽分化培养基上进行培
养。不定芽分化培养基为 SH +6 － BA 3． 0 mg / l + NAA 0． 2 mg / l + IBA 0． 3 mg / l +蔗糖 30 g / l +卡
拉胶 7． 5 g / l ，培养条件同上。
1． 3 数据分析与处理
每个组合处理 20 块愈伤组织团块，处理 3 次，培养 1 个月后观察愈伤组织生长以及植株再生
情况，并用 SAS统计软件进行分析处理(不包括污染的)。致死率 =死亡的愈伤组织块数 /处理的
愈伤组织总数 × 100 %，不定芽分化率 =(分化出不定芽的愈伤组织数 /接种的愈伤组织总数)×
100%，分化系数 =(所有分化出的不定芽总数 /分化不定芽的愈伤组织数)× 100%
2 结果与分析
2． 1 EMS对剑麻愈伤组织生长的影响
EMS对剑麻愈伤组织生长的影响如表 1 所示:不同 EMS 浓度，相同处理时间内，随着 EMS 浓
度的升高，愈伤组织生长受到明显抑制，愈伤组织死亡率增加。用 0． 2 %和 0． 4 %的 EMS处理 2 h
时，愈伤组织生长良好，与对照无明显差异，当 EMS浓度增加到 0． 8 %时，愈伤组织死亡率为 15． 0
%，EMS浓度为 1． 0 %时，愈伤死亡率为 30． 8 %。用 0． 6% － 1． 0 %的 EMS 处理 16 h，愈伤组织
在 1 周内全部死亡。相同浓度，随着处理时间的延长，愈伤组织生长受到抑制，死亡率增加。在所
试浓度范围内，处理 4 h 和 6 h 的愈伤组织生长与处理 2 h 的愈伤组织生长无明显差异，处理 8 h
则发生明显变化，愈伤组织生长受抑制，愈伤组织死亡率增加，用大于 0． 6 %的 EMS 处理 16 h 时，
除对照外，愈伤组织全部死亡。由此推断，低浓度短时间的 EMS 处理可促进愈伤组织的生长。高
浓度或长时间处理抑制愈伤组织生长。用 0． 2 %的 EMS 处理愈伤组织致死率比用 0． 4 %和 0． 6
%的 EMS处理的致死率要高，可能与外植体的大小有关，在用 0． 2 %的 EMS 进行处理时，有 1 /4
78第 2 期 张燕梅等:烷化剂 EMS诱导剑麻愈伤组织突变方法研究
的外植体的大小进行减半。这些较小的愈伤组织团块经 EMS 处理后多数死亡。用 0． 8 %和 1． 0
%的 EMS分别处理 6 h和 4 h，愈伤致死率分别为 52． 22 ± 1． 11 %和 56． 67 ± 1． 67 %，超过“半致
死”剂量，可以用作筛选剑麻 EMS突变体的浓度组合(图 1)。
表 1 不同处理浓度和时间对剑麻愈伤组织生长的影响
Tab． 1 Effect of 30 treatments with six concentration levels and five time points on sisal callus growth
处理时间 (h)
处理浓度 (%)
0． 0 0． 2 0． 4 0． 6 0． 8 1． 0
2
处理数(个) 50 58 56 58 60 60
愈伤组织生长 + + + + + + + + + + + + + +
致死率(%) 1． 67 ± 1． 67kl 8． 53 ± 1． 47hi 0． 00 ± 0． 00 3． 33 ± 1． 67jkl 31． 67 ± 1． 67e 15． 00 ± 2． 89fg
4
处理数(个) 50 63 52 64 53 60
愈伤组织生长 + + + + + + + + + + + +
致死率(%) 1． 87 ± 1． 87kl 6． 23 ± 1． 23ikj 3． 75 ± 1． 91jkl 7． 68 ± 1． 22hij 33． 98 ± 0． 65e 56． 67 ± 1． 67c
6
处理数(个) 50 62 57 63 50 60
愈伤组织生长 + + + + + + + + + + +
致死率(%) 0． 00 ± 0． 00 11． 21 ± 1． 21gh 3． 52 ± 1． 77jkl 19． 08 ± 0． 53f 52． 22 ± 1． 11d 78． 33 ± 1． 67b
8
处理数(个) 50 50 54 59 50 60
愈伤组织生长 + + + + + + － －
致死率(%) 1． 67 ± 1． 67kl 15． 97 ± 1． 84f 5． 60 ± 0． 36ijk 33． 86 ± 1． 14e 96． 11 ± 2． 00a 98． 33 ± 1． 67a
16
处理数(个) 50 50 50 60 60 60
愈伤组织生长 + + + + － － －
致死率(%) 3． 94 ± 1． 98jkl 18． 06 ± 0． 69f 31． 94 ± 0． 69e 100． 00 ± 0． 00a 100． 00 ± 0． 00a 100． 00 ± 0． 00a
注:愈伤组织生长情况． “+”愈伤组织轻度增殖，“+ +”愈伤组织中等增殖，“+ + +”愈伤组织较大增殖，
“－”愈伤组织死亡。数值为平均值 ±标准偏差，相同字母表示两两间差异不显著( P ＜ 0． 01) 。
图 1 愈伤组织在 0． 2 % EMS处理 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h和 16 h后的生长情况
A，B，C，D，E，F分别为处理 0． 2 % EMS 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h和 16 h
Fig． 1 Callus growth treated with 0． 2 % EMS for 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h and 16 h respectively
2． 2 EMS对剑麻不定芽发生的影响
如表 2 所示:对照处理的愈伤组织分化率均在 95 %以上，分化系数在 28． 83 ± 2． 72 与 24． 00
± 5． 56 之间，即表明磷酸缓冲液对植株再生无影响。用 0． 2 %的 EMS处理 2 － 4 h，分化系数均在
88 中国麻业科学 第 35 卷
27． 00 ± 5． 56 以上，与对照无明显差异，随着处理时间的延长，分化系数明显下降，处理 16 h时分化
系数仅有 15． 37 ± 1． 86，显著低于对照水平 24． 00 ± 5． 56。用 0． 4 %、0． 6 %、0． 8 %和 1． 0 %的
EMS进行处理，也获得相同的结果。相同处理时间，随着 EMS 浓度的增加，分化系数也明显下降。
并且分析发现，分化系数与愈伤组织生长呈现正相关性，在相同处理组合内，愈伤组织生长越大越
快，分化系数越高，可能与愈伤组织的活力有关。低浓度 EMS 有利于愈伤组织生长和分化系数升
高，随着 EMS浓度升高和处理时间延长，再生植株分化受到抑制。用 0． 8 %和 1． 0 %的 EMS 分别
处理 6 h和 4 h，愈伤组织致死率超过“半致死”剂量，分化率分别为 46． 8 %和 41． 7 %，分化系数分
别为 7． 63 ± 1． 10 和 7． 13 ± 2． 79(如图 2)。
表 2 不同处理时间和浓度对剑麻植株再生的影响
Tab． 1 Effect of 30 treatments with six concentration levels and five time points on sisal plant regeneration
处理浓度(%)
0． 0 0． 2 0． 4 0． 6 0． 8 1． 0
处
理
时
间
(h)
2
处理数 50 58 56 58 60 60
分化率 98． 0 91． 4 100． 0 95． 7 85． 0 69． 2
分化系数 28． 83 ± 2． 72ab 30． 57 ± 4． 06a 19． 94 ±3． 56bcde 16． 35 ±2． 22cdefg 14． 44 ±1． 92defg 11． 00 ±2． 08efgh
4
处理数 50 63 52 64 53 60
分化率 98． 0 93． 7 96． 2 93． 7 66． 1 41． 7
分化系数 27． 38 ± 4． 48ab 27． 00 ± 5． 56ab 17． 53 ±3． 18cde 15． 27 ±2． 44cdefg 10． 62 ±1． 53efgh 7． 13 ±2． 8gh
6
处理数 50 62 57 63 50 60
分化率 100． 0 87． 1 96． 0 80． 9 46． 8 20． 0
分化系数 25． 23 ± 4． 31abc 21． 41 ± 2． 45bcd 17． 03 ± 3． 25cde 13． 93 ±2． 41efgh 7． 63 ± 1． 10fgh 4． 63 ± 1． 49h
8
处理数 50 50 54 59 50 60
分化率 98． 0 84． 0 95． 0 67． 8 0． 0 0． 0
分化系数 25． 20 ± 2． 48abc 18． 41 ± 1． 56cde 17． 29 ± 2． 55cde 12． 59 ±2． 62efgh 0． 0 0． 0
16
处理数 50 50 50 60 60 60
分化率 96． 0 82． 0 70． 0 0． 0 0． 0 0． 0
分化系数 24． 00 ±5． 56abcd 15． 37 ±1． 86defg 13． 50 ±2． 59efgh 0． 0 0． 0 0． 0
注: 数值为平均值 ±标准偏差，相同字母表示两两之间差异不显著( P ＜ 0． 01) 。
图 2 用 0． 8 %和 1． 0 %的 EMS分别处理 6 h和 4 h获得的不定芽。左为 0． 8 %处理 6 h，右为 1． 0 %处理 4 h
Fig． 2 Adventitious buds obtained from sisal callus treated with 0． 8 % and 1． 0 % EMS for 6 h and 4 h respectively
3 结论与讨论
3． 1 低浓度的 EMS有利于愈伤组织的生长
突变体是开展植物功能基因组研究的重要材料，目前已在拟南芥［14］，小麦［15］等多种植物中广
泛应用，并在功能基因组学研究中发挥了重要的作用。本研究表明，低浓度的 EMS 有利于愈伤组
织的生长和植株再生，这与朴铁夫［16］的研究结果一致。可能是低浓度的 EMS 刺激细胞使呼吸作
用加强，并且可提高细胞色素氧化酶活性。詹亚光［17］研究结果也表明，0． 1 %的 EMS 可促进白桦
愈伤组织生长，并且建议用该浓度的 EMS来促进白桦愈伤组织的分化。
98第 2 期 张燕梅等:烷化剂 EMS诱导剑麻愈伤组织突变方法研究
3． 2 EMS的浓度与材料大小和状态有关
EMS诱变主要是功能基因的点突变，由于不同组织材料对 EMS 的敏感程度不同，所选材料将
直接影响 EMS的使用浓度和诱变频率。本研究过程中发现，用 0． 8 % EMS处理绿豆大小的剑麻愈
伤组织 6 h，愈伤组织死亡率为 52． 22 ± 1． 11%，处理黄豆大小的愈伤组织 6 h，愈伤组织死亡率仅
为 37． 8 %;分化系数也明显增加;另外继代次数越多，愈伤死亡率也越高，可能原因是愈伤团块越
大，EMS只接触了表面的细胞和组织，对里面的细胞的损伤力度越小，在后续的培养中容易复苏，
继代次数越多，细胞活力下降，有的愈伤组织会出现衰老死亡或分化，EMS 的损伤会增加，死亡率
也增加。对于剑麻愈伤组织继代时间以 10 － 15 d 为宜，这与罗静［11］的研究结果基本一致，黄俊
生［18］则认为，对于菠萝而言，继代时间越长(5 － 30d) ，对 EMS的抵抗力也增强。詹亚光［17］在白桦
的 EMS诱变研究中建议将不同大小和继代时间的愈伤组织分开进行处理，鉴于此，在进行 EMS 诱
变处理时，应针对不同的试验材料，选取合适的浓度组合。
4 结语
本研究获得了 1，000 多株剑麻 EMS诱变植株并已成功移栽，表型观察发现有的植株生长明显
比其它植株迅速，叶片较宽，染色体观察未发现染色体数目的改变(数据未列出) ，建议作进一步的
表型观察和细胞学分析，并且在以后的筛选工作中，最好能结合一些其他的方法，定向的筛选突变
体，提高筛选效率，缩短育种周期。
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