全 文 ：第 6 卷 第 2 期
19 5 理年 9 月
热 带 作 物 学 报
C H I呵E S E JO RUN A L O F T R O P IC A L C R O P S
Vol
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5 N o
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2
S eP
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1, 84
剑麻花粉对剑麻蛋白酶的激活作用
沈家柏 叶启腾 郑安乐
玉庭汉 李春香 朱金兰 邵苏萍
( 广西亚热带作物研 究所 )
摘 要
用 D H T一酪蛋白法测 .定了剑麻花粉对剑麻蛋白酶的激活作用 。 无论是剑麻花粉的滤液还是透
析液 , 都能使剑麻蛋白酶激活 , 证实剑麻花粉中含有琉基激活物质 。 这对于剑麻酶的生产和应用
具有一定的经济意义 。
一 、 月U 吕
植物花粉除了在植物的有性繁殖 中起着不可缺少的作用之外 , 在其他方面还有着广泛的
用途 。 医学上 , 花粉可引起变态反应 , 也可协助某些疾病的诊断 ; 营养学上 , 花粉不 但营养价
值高 , 而且含有多种具有特殊生理功能的物质 。 人们早就开展 了花粉利用的研究工作 , 但对
于剑麻花粉 , 除了它的繁殖作用之外的其他方面的研究则很少 。 本文是探讨剑麻花粉对剑麻
叶片中所含蛋 白酶的影响 , 乡州正实剑麻花粉对剑麻蛋白酶具有激活作用 。
、 材 料 和 方 法
剑麻蛋白酶试品是本所试验工厂产品 。 由龙舌兰麻杂种 1 1 6 4 8叶片的含 酶 废 渣 加 工 而
成 。 试验时取 1 克酶粉加水研磨后定容至 50 毫升 , 经滤纸过滤后取滤液作测试用 。
剑麻花粉来自本所已定植 1 年的开花植株 。 将花轴斩下 , 用镊子把花粉收集在瓷盘里 ,
剔除杂质后置于干燥器中保存待用 。 试验时取 1克花粉加水研磨 , 定容至 50 毫升 , 再用台式
离心机以 4 0 0 0转 / 分离心 1叮于钟 , 离心液用滤纸过滤作为花粉滤液供试验用 。 另取 1 克花粉
加水研磨后装入透析袋 , 用 50 毫升水透析 24 小时 , 取透析袋外液体作为花粉透析 液 供 试 验
用 。
蛋白酶活性测定底物 由中国科学院上海生物化学研究所提 供 。 其 余测定试剂均 采 用分
析纯 。
蛋白酶活性测定采用 D H T一酪蛋白法 〔 1 〕 , 为检测剑麻花粉对剑麻蛋白酶活性的影响 ,
进行了下列试验 。
本文于 1 9 8 3年 9月 3 日收到 。
2 6 热 带 作 物 学 报 5 卷
1
. 花粉激活试验 取三支试管。 第一支加入0 .2毫升剑麻蛋白酶溶液 、 0 .4毫升半胧氨
酸激活液和 0 .4毫升水 , 使总体积为 1毫升。 一 置 40 ℃水浴中激活 15 分钟 。 第二支试管 中除 用
。 . 4毫升花粉滤液代替半胧氨酸激活浓外 , 其余同第一支试管。 第三支试管用水代替半 脆 氨
酸溶液作为不激活的样品管 。 另取 3 支试管同上处理 , 在测试中作为对照空白管 。 前三管在
40 ℃水浴 15 分钟后 , 各加入 2 毫升 1 %的 D H T一酪蛋白溶液 。 各管自底物加入时起精确计时
10 分钟 , 然后加入 2 毫升镍锌试剂中止反应并使水解物显色。 混合液用滤纸过滤后用 7 2 1分
光光度计以 5切毫微米波长测量计数。 另三条空白管先加入 2 毫升镍锌试剂 , 然后再加 入 2
毫升底物溶液 , 混合物用滤纸过滤后用上述同样的分光光度计和频率测量计数 , 并以此分别
作为前三管的零读数。
用花粉透析液代替花粉滤浪重复上述试验 , 方法同上 。
2
. 花粉本身的蛋白水解酶活性测试 取 2 支试管 , 第一支加入。 . 5毫升花粉滤依 、 0 . 4
毫升半胧氨酸激活液、 0 . 1毫升水 , 使总体积为 1 毫升 。 置 40 ℃水浴激活 15 分 钟 。 第二 支
试管用水代替半胧氨酸溶液 , 作为不激活的样品管 。 以后的步骤和方法同试验 1 。
3
。 花粉本身作为蛋白水解底收的测试 将上述花粉滤液稀释 5 倍 , 作为蛋 白酶的水解
底物 。 取 1 支试管加入 。 . 2毫升剑麻蛋白酶溶浓 , 0 . 4毫升半胧氨酸激活液和 0 . 凌毫 升 水 , 使
总体积为 1 毫升 , 置 40 ℃水浴巧分钟后 , 再加入 2 毫升经稀释的花粉滤液 ,精确计时 10 分钟 ,
然后迅速加入 2 毫升镍锌试剂以中止反应并使水解物显色。 另作一对照空 白管 : 在激活的酶
液中先加入 2 毫升镍锌试剂 , 然后再加入稀释的花粉滤液 2 毫升。 计数方法同试验 1 。
4
. 剑麻蛋白酶经汞盐抑制后再用剑麻花粉激活试验 取 3 支试管。 第一支中 加 入 0 . 2
毫升剑麻蛋白酶溶液 、 0 . 4毫升 1 x l 。 “ ` M的氯化汞榕液和 0 . 吐毫升水。 第 2 支中加入 。 . 2 毫
升剑麻蛋白酶溶液 、 0 。 4毫升 1 X 1 0~ ` M氯化汞溶液 , 置 40 ℃水浴 15 分钟后加入 。 . 4毫升剑麻
花粉滤液 , 再放置 40 ℃水浴 1 5分钟 。 第 3 支试管处理基本同第 2 支 , 不同之处是用半胧氨酸
激活液代替花粉滤液 。 另备 3 支试管处理同上 , 分别作为对照空 白管 。 其余方法同试验 1 。
三 、 结 果 与 讨 论
试验 1 是在剑麻酶测定系统中 , 以剑麻花粉滤液代替激活剂半胧氨酸溶液 , 试验结果见
表 1 。 剑麻花粉的激活效果接近半胧氨酸。 经激活后 , 两者都比未经激活的剑麻蛋白酶的活
性高得多。
表 1 剑麻花粉对剑麻蛋白醉的滋活效果
项 目 半 耽 氨 酸 激 活 l 剑麻花 粉激活 备 注
0
。
D值
O
。
D值
0 . 3 15 0 . 20 0
0
。
13 5 0
一
1 35
~二一 一登一兰 - }一 生卿 - 一 {” · 0 6 0 } 用花粉渔液激活用 花粉透析液激活
花粉的化学成分是十分复杂的 , 必须考虑花粉中可能含有的蛋白酶以及 〔花粉中的蛋白质
对整个测定系统的影响 。 因此 , 试验 1 的结果不一定确实反映剑麻花粉对剑麻蛋白酶的激活
作用 。 为此进行了花粉本身的蛋白水解活性测试 , 其激活及不激活的 0 . D值均为 。 . 0 2 , 另
2 期 沈家柏等 , 剑麻花粉对剑麻蛋 白酶的激活作用
外还以剑麻花粉作为 D H T一酪蛋白法测定蛋白水解底物 , 其激活及不激活的 O . D值均为 0 。
从试验 2 的结果 ( 激活及不激活的 0 . D值均为。 . 0 2 ) 可以看出 , 在增大花粉 用 量 的 情 况
下 , 测出花粉中含有很小的蛋白水解活性 , 与剑麻叶片的蛋白水解活性相比是微乎其微的 。
这一数值与花粉作为剑麻蛋白酶的激活剂的激活提高值比较 , 也要低得多。
试验 3 是在 D H T一酪蛋白测定系统中 , 以花粉滤液作为D H T一酪蛋白法底物来测定剑
麻酶的活性的 。 测定的结果都为零 , 表示在 D H T一酪蛋自法这种特定的测试方法 中 , 花粉
滤液不可能作为底物以影响整个测定系统 。
试验 4 是刊用剑麻蛋自酶的活性琉基特性 , 在汞盐的存在下 , 该酶的活性完全被抑制 ,
但在激活剂的存在下酶的活性可被重新恢复 〔 4 〕。 试验结采见表 2 。 可以看出被汞盐完 全 抑
制的剑 f殊蛋自酶在花粉滤派的作用下 , 能够被重新激活。
表 2 剑鹿花粉对茉盐抑制的剑麻蛋白酶的激活测试结果
} 剑麻酶活性 汞 盐 抑 制 后
项 目 ’ - - -— 一一一 -— 一 - - - -— -一一一——激 活 { 不激浩 L 剑麻蛋 白酶活性 1剑麻 蛋白酶半肤氨酸激活 , 剑麻酶用剑麻花粉激活0 。 D值 . 0 。 4 0 5 1 0 。 2士0 0 。 3 6 0 0一 3 0 0H o w e l , D · J · 〔 票〕在对剑麻花粉的营养研究中测出人 g a v e p al m er i 花粉的蛋白质含量为 2 . 9% , 并作了氨基酸成份的测定 。 很少有报道提到花粉中有蛋白酶存在 ,但 G or g 。 二 ,D o n al a E . 和 H u nt , aJ 二 e s H . 〔 ” 〕报道在植物花粉中分析出四种有活性蛋 白酶 。 由于有上述因素的存在 , 就必须考虑到 D H T一酪蛋白法测定系统由于加入 了花粉 而可 能产 生 的 影响 。 如果剑麻花粉中具有于 白水解活性 , 那么 , 它就能够水解底物。 这样 , 测试结果并不反
映剑麻花粉对剑麻蛋 白酶的激活作用 , 而仅仅表示剑麻花粉本身的蛋 白水解活性 。 但是从试
验数据巾可 以吞出 , 在提高 了花粉用量的情况下 , 花粉的 爪白水解活性仍接 近 于 零 。 可 以
说 , 花粉中即使存在三: 白水解活性 , 也是十分低的 , 这与在测定系统中加入花粉滤液后剑麻
蛋白酶活性的提高值相比是相差甚远的 , 试验 4 的结果也证实这一点 , 即剑麻花粉确实对剑
麻酶有激活作用 。
在酶活性测定系统中 , 有时会由于底物的某些变化而 引起结果相应变化 。 剑 麻 花 粉 中
有大量叹. 白质 , 它的 加入 一也会引起测定系统的一定变化 。 为测试这个影响 , 在测定系统中以
花粉滤液代替原底物溶液 , 测定 反白酶活性。 从剑麻花粉作为 D H T一酪蛋白法测定底 物 为
零表明 , 即使剑麻蛋白酶 f到匕水解了剑麻花粉中的么 白质 , 但对原测定系统并无影响 。 这也
表明镍锌试剂对 D H T一肤的显色作用的专一性比较强 , 花粉中的蛋白质不能成 为 这一测定
系统的底物 。
试验 4 的结果表明了剑麻蛋白酶在汞盐抑制后 , 可以被剑麻花粉滤液重新激活 。 上面已
经提到 , 剑麻花粉透析液也能激活剑麻蛋白酶 , 由于大分子不能透过透析膜 , 因 而 可 以 推
测 , 酶可能是被剑麻花粉中的小分子物质所激活的 。 这些结果不但验证了剑麻花粉对剑麻蛋
白酶的激活性能 , 而且进一步排除了剑麻花粉可能具有的蛋白水解活性因素 ( 酶和酶原 ) 对
测定系统的影响 。
应该指出 , 剑麻花粉对剑麻蛋白酶的激活性能是稳定的 , 经过半年贮存 ( 室 温 干 燥 器
2 8 热 带 作 物 学 报 5 卷
中 ) 的花粉 , 再次作相应测试的结果也是一致的 。 、
剑麻蛋 白酶是一种琉基蛋 白酶匕“ , 4 〕 , 它可被多种琉基激活剂激活 。 从汞盐抑制的剑麻
蛋 白酶能被剑麻花粉激活这点来看 , 剑麻花粉中也含有琉基激活物质 。 剑麻蛋 白酶是一种资
源丰富的植物蛋白酶 , 我国已可以生产出酶制剂供制革工业用作脱毛剂 〔 ” 〕。 因此 , 剑 麻 花
粉激活效能的研究 , 将对剑麻蛋白酶生产和应用提供有利因素 。
在剑麻植株中 , 叶片含有的蛋白酶和花粉中的激活效能两者之间是否有联系 , 是值得进
行植物生理学研究探讨的 。 剑麻花粉对剑麻蛋 白酶激活的机理也是值得探讨的 。
参 考 文 献
〔 1 〕
〔 2 〕
〔 8 〕
〔 4 〕
〔 5 〕
〔 6 〕
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