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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的
构建及自激活检测
张荷1 代淑燕1 毛君婷1 王开功1，2 周碧君1，2 文明1，2
(1贵州大学动物科学学院，贵阳 550025;2贵州省动物疫病研究室，贵阳 550025)
摘 要: 为构建鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因酵母双杂交诱饵载体，采用 PCR技术扩增出 DEV-NP基因，克
隆至酵母双杂交诱饵质粒 pGBKT7 中，以 PCR检测、限制性酶切和序列测定等方法进行鉴定;然后采用 PEG /LiAc法将阳性质
粒 pGBKT7-NP转化酵母 Y2HGold，在不同营养缺失型培养基进行自激活检测，结果显示，经 PCR检测和 EcoR I /BamHⅠ双酶
切，可见到与预期相一致的目的片段;测序表明该片段含 DEV NP基因全部序列;转化 Y2HGold酵母菌后，在 SD /-Trp /X-α-Gal
固体培养基上长出蓝色菌落，而在 SD /-Trp /X-α-Gal /AbA固体培养基上未见有菌落生长。无自激活作用的诱饵载体 pGBKT7-
NP的成功构建，为 DEV NP宿主结合蛋白的筛选奠定了基础。
关键词: 鸭肠炎病毒核衣壳蛋白 诱饵载体 酵母双杂交 自激活作用
Construction of a Bait Vector for DEV NP Gene and Evaluation of
Autoactivation in Yeast Two-hybrid System
Zhang He1 Dai Shuyan1 Mao Junting1 Wang Kaigong1，2 Zhou Bijun1，2 Wen Ming1，2
(1College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025;2 Institute of Animal Disease，Guiyang Province，Guiyang 550025)
Abstract: To construct a bait vector of nucleocapsid for duck enteritis virus and to evaluate autoactivation in yeast two-hybrid
system． Full-length of NP gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR)and confirmed by sequencing． A fragment of the
gene was then subcloned into MCS of pGBKT7 vector to construct the bait vector according to the reading frame． The reconstructed bait
vector pGBKT7-NP was transformed into the yeast strain Y2HGold by PEG /LiAc method and its self-activation was tested by the pheno-
type assay． The results showed that the PCR detection and EcoR I /BamH I double digestion observed，the recombinant plasmid pG-
BKT7-NP can be seen in line with the expected target fragment;sequencing showed that the fragment contains all DEV NP gene se-
quence;conversion Y2HGold after yeast in SD /-Trp /X-α-Gal blue colonies grown on solid medium，while in SD /-Trp / X-α-Gal /
AbA solid medium there was no colony growth． The results showed that NP could act as a bait in the screening of cDNA library of host
cell to trap the interaction proteins in yeast two-hybrid system．
Key words: NP of DEV Bait vector Yeast two-hybrid system Autonomous reporter activation
收稿日期:2010-09-08
基金项目:国家自然科学基金项目(30760182)
作者简介:张荷，女，硕士研究生，研究方向:传染病与预防兽医学;E-mail:hezhang514@ yahoo． cn
通讯作者:文明，男，博士，教授，研究方向:预防兽医学;E-mail:as． mwen@ gzu． edu． cn，gzuwenming@ 126． com
鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis，DVE)是鸭、
鹅等水禽的一种急性败血性传染病，临床表现为体
温升高、两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大
等，病理变化为血管损伤、体腔溢血、消化道出血坏
死、淋巴器官受损和实质器官退行性变化等。1957
年，该病在我国广东报道后，在其他省(市)陆续被
发现，且近年来呈现扩大蔓延趋势，成为了目前危害
养鸭业最为重要的传染病之一［1］。
该病病原为鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，
DEV) ，俗称鸭瘟病毒(duck plaque virus，DPV)是一
种泛嗜性全身性感染的疱疹病毒，基因组为长约
150 kb的双股 DNA。国内外诸多学者对 DEV 进行
了广泛的研究［2 － 8］，在病毒的结构和形态发生、病
毒在宿主内的增殖和分布规律以及防治和诊断等方
2011 年第 3 期 张荷等:DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测
面取得了较大进展，但相对于其他 α-疱疹病毒而
言，DEV研究的总体水平较低，特别是关于 DEV 的
基因组结构及其编码的结构蛋白等分子生物学方面
的研究，才刚起步且进展缓慢。到目前为止，仅有糖
蛋白 gD基因部分序列、DNA聚合酶基因部分序列、
TK基因序列及 UL6-UL7 部分序列的报道，占 DEV
全基因组不足 5%，且这些基因还未准确定位，基因
产物的组成和功能也未被阐明。
本实验室在前期的 DEV核衣壳蛋白(NP)基因
生物信息学分析发现，该蛋白在 DEV感染过程以及
诱导宿主产生免疫应答中可能发挥重要的作用。为
此，本研究拟构建 DEV NP 基因的酵母双杂交诱饵
载体，以期为筛选出与 NP 蛋白分子互作的宿主细
胞分子和揭示 DEV分子致病机制奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 菌株和质粒
酵母诱饵表达载体 pGBKT7、pGBKT7-Lam和酵
母菌种 Y2 HGold，购自 Clontech 公司;E． coli DH5α
和 pcDNA3. 1-NP 质粒，由贵州省动物疫病研究室
提供。
1. 2 主要试剂与仪器
-Ade /-His /-Leu /-Trp 缺陷型培养基、-Leu /-
Trp /-His缺陷型培养基、YPDA 培养基、-Trp 缺陷型
培养基、PEG3350、醋酸锂、X-alpha-Gal和 Aureobasi-
din A，购自 Clontech 公司;鲑鱼精 DNA、玻璃珠和
lyticase(溶壁酶) ，购自 Sigma公司;DMSO，购自 AC-
ROS公司;DMF、饱和酚、氯仿、异戊醇、质粒小提试
剂盒、PCR 产物回收试剂盒、凝胶回收试剂盒、Taq
DNA 聚合酶、DNA Marker、dNTP、BamHⅠ、EcoRⅠ
和 T4DNA连接酶等，购自大连宝生物公司;其他试
剂均为进口分析纯。主要试验仪器为电泳仪(Bio-
Rad)、PCR 仪(Biometra)、台式高速冷冻离心机
(Beckman)、电子天平(Shangping)和凝胶成像系统
(Bio-Rad)等。
1. 3 DEV-NP基因的获取
以含 NP 基因的重组质粒 pcDNA3. 1-NP 为模
板，采用 DEV NP基因引物(P1:5-CCAGAATTC G-
TTTTCCTTTATTGAC-3，含 EcoR I酶切位点;P2:5-
TTTGGATCCGCTGATTATGTTAGC-3，含 BamH I 酶
切位点)进行扩增，反应体系为 10 ×反应缓冲液(含
15 mmol /L MgCl2)5. 0 μL、dNTP1. 0 μL，上、下游引
物(25 μmol /L)各 1. 0 μL Taq酶 2. 5 U和质粒模板
2. 0 μL，补 ddH2O至 50 μL;反应条件为 94℃ 预变
性 5 min，94℃ 变性 1 min、52℃退火 40 s 和 72℃
延伸 1 min，共 30 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min，
于 10 g /mL琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察
结果。
1. 4 pGBKT7-NP诱饵载体的构建
采用 EcoR I和 BamH I分别对质粒 pGBKT7 和
DEV NP基因的 PCR 产物进行双酶切，回收目的片
段并连接，转化 E． coli DH5α 感受态细胞，涂布于含
卡那霉素的 LB 固体培养基上进行培养，然后挑取
单菌落进行增菌培养，提取质粒，采用 PCR 扩增、
EcoR I /BamH I双酶切和序列测定进行重组载体的
鉴定。
1. 5 pGBKT7-NP诱饵载体的自激活检测
按常规方法制备 Y2HGold酵母感受态细胞，取 50
μL于1. 5 mL离心管中，加入诱饵载体 pGBKT7-NP 0. 1
μg 和鲑鱼精担体 DNA(herring tests carrier DNA)5
μL，轻轻混匀后加入 PEG/LiAc 溶液0. 5 mL，振荡混
匀，30℃振荡培养 30 min，加入 DMSO 20 μL混匀，42℃
水浴15 min后立即冰浴1 －2 min，12 000 r /min离心 15
s弃上清，加入 YPD Plus液体 1 mL进行悬浮，30℃振
荡培养 90 min，3 000 r /min离心 5 min弃上清，用灭菌
生理盐水溶液 1 mL 悬浮，取 100 μL 涂于 SD/-Trp、
SD/-Trp /X-α-Gal和 SD/-Trp /X-α-Gal /AbA 固体培养
基上，30℃培养 3 d后观察结果。同时以质粒 pGBKT7-
Lam和 pGBKT7作为对照。
2 结果
2. 1 DEV NP基因 PCR扩增
经 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后，可见 1 条大
小约为 890 bp的特异性 DNA片段(图 1) ，与预期扩
增结果相一致。
2. 2 pGBKT7-NP诱饵载体的构建
采用 PCR检测和 EcoR I /BamH I 双酶切观察，
均可见到与预期相一致的目的片段(图 2，图 3) ;测
序结果显示，目的片段含 DEV NP 基因全部序列。
这表明本研究成功构建了含 DEV NP基因的诱饵载
体(pGBKT7-NP)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
M. 200 bp DNA Ladder Marker;
1．阴性对照;2． pCDNA3. 1-NP
图 1 NP基因 PCR鉴定
M. 200 bp DNA Ladder Marker;1-4．
pGBKT7-NP;5．阴性对照
图 2 重组质粒 pGBKT7-NP
的 PCR鉴定
M. 200 bp DNA Ladder Mark-
er;1． pGBKT7 空载体双酶
切;2． pGBKT7-NP双酶切
图 3 重组质粒 pGBKT7-NP
的双酶切鉴定
2. 3 pGBKT7-NP诱饵载体的自激活检测
经培养观察，在 SD /-Trp 固体培养基上可见粉
色菌落生长(图 4-A) ，说明诱饵质粒 pGBKT7-NP已
转入酵母 Y2HGold 中;在 SD /-Leu 固体培养基上无
菌落生长(图 4-B) ，说明无文库质粒的转入;在
SD /-Trp /X-α-Gal固体培养基上长出蓝色菌落(图
4-C) ，而在 SD /-Trp /X-α-Gal /AbA 固体培养基上未
见有菌落生长(图 4-D) ，表明诱饵载体 pGBKT7-NP
无自激活作用。这些结果提示，本次构建的诱饵载
体 pGBKT7-NP 可用于下一步 DEV NP 蛋白宿主细
胞互作分子的筛选。
3 讨论
DVE是目前危害我国养鸭业最为严重的疫病
之一，近年来国内很多学者对 DVE进行了多方面的
研究并取得了一定的进展。DEV 属于疱疹病毒科，
疱疹病毒感染易感动物，与宿主易感细胞接触后，主
A． SD /-Trp;B． SD /-Leu;C． SD /-Trp /X-α-Gal;D． SD /-Trp /X-α-Gal /AbA
图 4 表型验证法检测自激活作用
要是通过其囊膜糖蛋白与宿主细胞膜上受体结合
而发生膜融合作用，使病毒核衣壳进入宿主细胞
浆内。在胞浆内，核衣壳释放出衣壳蛋白，病毒
DNA或 DNA －蛋白复合物通过核孔加入宿主细胞
核内进行转录;而其 mRNA 则转移到胞浆进行转
译，合成衣壳蛋白，再转运到核内与新转录的病毒
DNA形成新的核衣壳。因此，寻找、研究核衣壳蛋
白在 DEV与宿主细胞相互作用过程中可能的结合
蛋白，不仅可为探索 DEV感染早期、寄居在细胞内
的分子机制、设计预防和治疗 DEV 的药物及方案
奠定基础，而且也可为进一步揭示上述致病的分
子机制提供佐证。
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2011 年第 3 期 张荷等:DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测
目前，酵母双杂交系统广泛用于蛋白分子相互
作用研究。酵母双杂交系统提供了一个在酵母细胞
中研究蛋白质间相互作用的技术平台，由于在活细
胞内进行试验，因此能够在某种程度上反映蛋白质
在生理条件下的活性状态，这是体外其他试验不可
比拟的［9］。为研究 DEV NP与其他蛋白相互作用的
关系，本研究构建了 pGBKT7-NP 表达载体，并经酶
切、测序和比对，证实了所插入多克隆位点的 NP 序
列准确性。重组质粒转入酵母细胞中通过 SD /-Trp
培养基筛选出阳性菌落。酵母双杂交系统的缺点就
是假阳性，主要原因是诱饵蛋白对报告基因的激活
性。酵母双杂交系统中的 LacZ基因，只有当菌株内
的调控基因中 DNA-BD 和 DNA-AD 两个相互作用
蛋白相互靠近时才能激活下游的报告基因［10］。本
研究将转入重组质粒酵母细胞分别培养在 SD /-
Trp /X-α-Gal和 SD /-Trp /X-α-Gal /AbA 养基上观察
酵母细胞是否生长，直观地判断诱饵蛋白对下游的
报告基因没有自激活作用。从而进一步排除假阳
性的出现。由以上一系列试验证实了所构建的重
组质粒(pGBKT7-NP)表达的 NP 可作为酵母双杂
交系统中诱饵蛋白。结果表明，诱饵载体 pG-
BKT7-NP单独转化酵母 Y2HGlod，不能激活酵母双
杂交系统的报告基因，提示该载体可以用于酵母
双杂交方法，这为下一步 NP 互作受体蛋白分子的
筛选奠定了基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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