全 文 ：收稿　2001-08-10　　　　修定　2001-11-05
　＊　国家自然科学基金资助项目(批准号:39970077)。
＊＊　联系人。
紫萍 P143品系植物 rbcS基因的 cDNA克隆与表达＊
刘翠敏　熊　延 　王淑芳 　王宁宁 　王 　勇＊＊(南开大学生命科学学院 ,天津 300071)
cDNA Cloning and Expression of rbcS Gene in Spirodela polyrrhiza
LIU Cui-Min , XIONG Yan ,WANG Shu-Fang , WANG Ning-Ning , WANG Yong ＊＊(College of L ife Sciences , Nankai Universi-
ty , T ianjin 300071)
提要　紫萍 P143 品系离体半叶状体在黑暗下培养 4 d以后 , rbcS 基因的表达比完整植株显著降低;半叶状体在黑暗下培
养 10 d , 后再转移到长日照条件下培养 , rbcS 基因的表达能恢复到较高水平。
关键词　紫萍　rbcS 　cDNA 克隆　基因表达
　　rbcS 基因编码光合作用中固定 CO2的关键酶
核酮糖 1 , 5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的小
亚基 。此种基因或其 cDNA 已在多种植物中克隆 。
rbcS 基因的表达经常用作叶绿体功能相关基因表
达的代表 ,以之研究与光调节作用或叶绿体发育相
关事件的分子生物学机理[ 1 ,2] 。
我们[ 3]曾报道浮萍科植物是研究植物衰老机
制的极好材料 。这一科植物是单子叶开花植物 ,
漂浮生长在静止的水面上 , 主要通过从位于叶状
体尖端(长根端)两侧的囊中产生子代的方式 , 进
行无性繁殖 , 植株个体可在 2 d内加倍[ 4] 。由于植
物体微小 , 所以人们很容易将浮萍科植物像微生
物一样在实验室中进行无菌培养 , 在适宜的生长
条件下研究植物自然衰老的机制。同时 , 由于浮
萍科植物叶状体下表面能很好地吸收培养液中的
营养物质 , 所以它们也非常适合于研究离体条件
下 , 溶解于培养液中的化合物对叶状体衰老的影
响。
P143 品系 属 紫 萍 属紫 萍 种 (S pirodela
polyrrhiza),植物体由一个近似椭圆形的长轴为 5
-8 cm 的叶状体和多条根组成。我们[ 3]过去曾报
道 ,P143品系的衰老与G1品系浮萍的衰老有许多
不同之处 ,其离体半叶状体在黑暗下 2个多月仍能
保持较深的绿色 ,将其再转移回长日照条件下 , 4 d
以后半叶状体开始失绿并继而衰老。这表明黑暗
似乎不能诱导 P143紫萍离体半叶状体的衰老 ,而
光照则可以 。黑暗是诱导离体植物叶片衰老的最
常用方法[ 5] 。因此 ,紫萍 P143品系的这种抵抗黑
暗诱导衰老的能力及其分子生物学基础很值得深
入研究。
材料与方法
1　实验材料的培养和处理
　　实验材料为紫萍 P143品系 ,按Wang 和 Kan-
deler[ 6]的方法无菌培养在修改后的 60%DATKO
培养液上 。长日照(16 h光照 、8 h 黑暗 ,光强约为
45μE·m-2·s-1),培养温度为白天 20 ～ 25℃, 晚
上 18 ～ 20℃。每 7 d更换 1次培养液 ,以确保材料
生长所需的营养。选取已完全展开的叶状体 ,在无
菌条件下用消毒过的刀片将叶状体横切为两半 ,留
下不带根的一半用于进一步的实验。这样的半叶
状体 ,无根 、无产生子代叶状体的生长点 ,其细胞分
裂素的来源受阻 ,类似于其他高等植物的离体叶
片。转移到培养瓶中的半叶状体完全漂浮在培养
液上 ,以保证其对营养的吸收几乎与完整植株相同
(根不是浮萍吸收营养的主要部位[ 4])。
2　RNA样品的制备
　　总 RNA 的提取基本上按照文献 7 的方法进
行。为了提高 RNA 的纯度 , 将异丙醇沉淀后的
RNA样品用 3 mol·L-1的醋酸钠(pH 5.2 , DEPC-
H2O配制)轻洗 ,然后在室温下以 9 000×g 离心 6
min。必要时重复 1 次 。然后再用 75%的乙醇
(DEPC-H2O配制)洗沉淀 。得到的 RNA样品 ,其
OD260/OD280和 OD260/OD280比值一般均大于 2 ,说
明样品含糖和蛋白质都很低。然后用无 RNase 的
DNase I(购自大连宝生物工程有限公司)去除总
RNA样品中污染的 DNA 。总 RNA样品经凝胶电
221植物生理学通讯　第 38 卷 第 3 期 , 2002年 6月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2002.03.004
泳检测 ,证明质量符合反转录和Northern杂交的要求。
3　反转录链式聚合酶扩增反应(RT-PCR)
　　反转录合成 cDNA:采用 Promega公司提供的
AMV Transcription Kit ,以寡聚 oligo dT [ P2853:5′
gcgaat tct(t)16 3′] 为引物 ,依照说明书上的反应条
件 ,取 2 μg 总 RNA 进行反转录反应 。
PCR扩增反应:用上海生工公司提供的 Taq
DNA聚合酶 ,下游引物为上面用到的 P2853 , 上
游引物是根据 rbcS 基因编码区保守序列所设计的
兼并引物 P1980[ 5′g tcag(a/c)atcatcgg(c/a)tt(c/a)
g 3′] , 模板为反转录产物 。退火温度为 50℃。
4　cDNA片段的分离 、回收 、克隆与测序
　　分离与回收 cDNA片段:将 PCR扩增产物以
1×TAE 为电泳缓冲液 ,在含有 EB 的 2%琼脂糖
凝胶中进行电泳。电泳结束后 ,在紫外灯下检测
DNA带 ,然后在拟回收的 DNA 带前挖一小洞 ,继
续电泳 , 直至拟回收 DNA 进入小洞中。停止电
泳 ,吸取在小洞中含有目的 DNA 的 TAE溶液 ,然
后加入 1/10体积的 3 mol·L-1醋酸钠(pH 5.2),
并用 2倍体积的冷无水乙醇沉淀 。离心后用 75%
乙醇轻洗沉淀 ,最后用 TE缓冲液溶解 DNA样品。
克隆目的 cDNA:采用上海生工公司的 T-Vec-
tor PCR Product Cloning Kit ,按操作要求加入载
体 、PCR产物 、连接酶进行连接反应。以同一公司
提供的 SSCS 溶液制备感受态细胞 ,转化连接产
物。将转化细胞涂布在含有氨卞青霉素 、X-gal和
IPTG的固体 2YT 平板上 , 37℃培养 12 ～ 16 h 。
检测转化子:用蓝白筛选的方法 ,即将白色菌
斑挑选出来进行 PCR 鉴定 , 鉴定加 P1980 和
P2853为引物对 , 以及以通用引物对 M13 R(5′
CAGGAAACAGCTATGAC 3′) 和 M13F (5′
GT TTTCCCAG TCACGAC 3′), 在退 火温度为
54℃下进行特异性 PCR扩增 ,以检测转化子中是否
含有目的 cDNA片段。
插入 DNA的片段测序:将经 PCR检测确证为
含有外源片段的克隆送至博亚公司测序 。
5　Northern杂交
　　制备探针:先用碱裂解法提取质粒 DNA[ 7] ,
并用 RNase 消化去除样品中的 RNA。再以 P1980
和 P2853 为引物 PCR 扩增出特异 DNA 片段 。
DNA片段经琼脂糖凝胶分离纯化 ,然后回收作为
制备探针的模板 。
标记杂交探针:采用 Promega 公司提供的随机
引物法探针标记试剂盒 ,用 50 μCi [α-32P] dCTP
(亚辉生物医学工程公司)标记 ,按操作说明进行。
RNA 的甲醛变性电泳:先以酸性苯酚法制备
总 RNA 样品 ,即将 65℃变性的 RNA 样品在含有
甲醛和 EB的 1.2%琼脂糖凝胶中进行变性电泳 ,
恒流 10 mA(3 ～ 4 V·cm-1)电泳 3 ～ 5 h 。
转移 RNA:用毛细管法将 RNA 转移到 Hy-
bond-XL 尼龙膜上。先将凝胶在 10×SSC 中摇动
浸泡 30 ～ 60 min以去除甲醛 ,然后再以 10×SSC
转移 48 h。转移结束后 , 在 80℃干烤膜 1 h , 将
RNA固定到尼龙膜上。
杂交:杂交液组成为 1%牛血清白蛋白(BSA ,
组分 5)、 1 mmol· L-1 EDTA 、 0.5 mol· L-1
Na2HPO4(pH 7.2),7%SDS 。先将膜在20 ml杂交
液中于 65℃预杂交 30 min ,然后加入 50 μl标记好
的探针 , 于 65℃下杂交 24 h。杂交后的膜在 1%
BSA(组分 5)、1 mmol·L-1EDTA 、40 mmol·L-1
Na2HPO4(pH 7.2)、5%SDS 中于 65℃下洗 2次 ,
每次 5 min;在 1 mmol·L-1EDTA 、40 mmol·L-1
Na2HPO4(pH 7.2)、1%SDS中 65℃下洗 3 ～ 5次 。
膜洗过后自然晾干 ,包一层保鲜膜 ,压上 X-光片 ,
在-20℃下放射自显影 。
结果与讨论
1　rbcS 基因 cDNA的克隆 、鉴定和序列分析
　　提取正常生长的紫萍 P143 品系半叶状体的
RNA ,然后以寡聚 oligo dT(P2853)为引物进行反
转录 ,再以反转录产物为模板 ,以 P2853和 rbcS 基
因特异性兼并引物 P1980 为引物对进行 PCR 扩
增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测 ,发现扩增
出一条大约 400 bp 的 cDNA 带(图略),与预料的
结果相符。因此 ,将这种 cDNA 片段回收并纯化 ,
然后连接到 pUCm-T 质粒上 ,并以大肠杆菌 DH5α
为宿主菌进行转化 。在 X-gal/ IPTG 平板上挑选
出 3个白色的菌斑 。
分别以 3 个克隆的质粒 DNA 为模板 , 以
P1980和 P2853为引物对或以通用引物对 M13F
和M 13 R在退火温度为 54℃下进行 PCR扩增检
测 ,电泳结果如图 1。
　　从图 1 可知 , 1号和 2号克隆的扩增结果一
致 ,以 P1980和 P2853 为引物扩增出的 PCR产物
大小接近 400 bp , 而以 M13F 和 M13R为引物扩增
出的 PCR产物则有500多 bp ,这是因为 pUCm-T 载
体上的一段100多bp的序列也被扩增 。因此1号
222 植物生理学通讯　第 38 卷 第 3 期 , 2002年 6月
图 1　琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增的克隆 DNA片段
　　M 为 DNA 分子量标准物 DL2000;1 、2 、3分别为 1号 、2号和 3
号克隆。 1 、2 、3引物为 M 13 F 和 M 13R ;1′、2′、3′引物为 P1980 和
P2853。
和2号克隆可能含有目的 cDNA 片段 。3号克隆
中只有 100多 bp ,所以不可能是我们所需要的目
的片段。
选取 2号克隆进行测序 。插入片段核苷酸序
列如图 2。
　　从图 2 可以看出 ,测定出的 DNA 序列包括
RT-PCR中所用的上游引物 P1980 序列和下游引
物 P2853序列(下划线部分),证明这片段确实来
自 RT-PCR扩增产物 。克隆的 cDNA 片段全长为
364 bp(不包括 oligo dT 末端的 8个外加核苷酸)。
将上述 DNA 序列与 Genbank 等 DNA数据库
中的已知核苷酸序列进行同源性比较 ,发现此片段
的前 66个碱基与多种植物中的 rbcS 基因的编码
区具有很高的同源性 ,其中与浮萍(Lemna gib-ba)
rbcS cDNA的同源性为 98%(图 3-A)。将克隆序
列翻译成氨基酸序列 ,发现比浮萍 Rubisco 小亚基
的C-末端多了 2个氨基酸 ,另外倒数第 3 个氨基
酸为脯氨酸 ,不同于浮萍中相应位置上的苏氨酸
(图3-B),其余氨基酸序列与浮萍Rubisco小亚基
图 2　克隆片段的核苷酸序列
下划线部分为 PCR引物。
图 3　紫萍与浮萍 rbcS 基因部分 cDNA 核苷酸序列以及编码氨基酸序列的比较
223植物生理学通讯　第 38 卷 第 3 期 , 2002年 6月
的相应氨基酸序列完全一致。另外 ,还发现该片段
的后一段序列(175 ～ 303 bp)与浮萍中 rbcS 基因
SSU1有 83%的同源性(图 3-C)。
　　根据以上结果 ,我们认为所克隆 cDNA 片段确
实来自紫萍 P143的 rbcS 基因 。
2　紫萍 P143半叶状体中 rbcS 基因的表达
　　如前所述 ,不同于浮萍 G1品系和其它植物的
是 ,紫萍 P143半叶状体在黑暗条件下培养时仍能
保持较绿的状态 , 显示半叶状体仍具有生物学活
性。作为光合作用中固定 CO2 的关键酶 Rubisco
小亚基的编码基因 、光合作用和叶片生物学活性的
分子标志 , rbcS 基因在紫萍 P143中的表达是否也
有所不同呢 ? 为此 ,我们用 Northern 方法检测了
紫萍 P143半叶状体在长日照下和在黑暗中 rbcS
基因表达的差异 。
分别提取一直生长在长日照下 ,黑暗下培养 4
d ,黑暗下培养 8 d和先在黑暗下培养 10 d ,然后从
黑暗转入长日照下又培养 4 d 时的半叶状体的总
RNA ,取 10 μg 进行变性电泳和 Northern 杂交检
测 ,结果如图 4。
图 4　Northern 杂交检测紫萍 P143 半叶状体中
rbcS 基因的 mRNA 水平
　　每一泳道的总 RNA 量平均为 10μg。 1为长日照下培养;2 、4
为黑暗下培养 4 d和 8 d ,培养液中无 6-BA;3 、5为黑暗下培养 4 d
和 8 d ,培养液中加入 6-BA;6为黑暗下培养 10 d(无 6-BA)后再转
入长日照下培养 4 d。
　　从图 4可以看出 ,黑暗下培养 4d以后的半叶
状体中 , rbcS 基因 mRNA 的水平比黑暗处理前显
著降低 ,低到几乎检测不到的水平 。培养液中加入
10-6 mol·L-1的 6-BA 后 ,培养早期的 rbcS 基因
mRNA水平下降速度减漫 ,但到第 8 d时 ,同样下
降到相当低的水平 。然而 ,当将黑暗下培养 10 d
后的半叶状体重新转移到长日照条件下培养后 ,
rbcS 基因 mRNA 的水平又能恢复与黑暗处理前
相当的水平。但是 ,4 d以后半叶状体就进入衰老
阶段 , rbcS 基因 mRNA 的水平又会逐渐降低(杂
交图略)。
Tobin 等[ 8] 、 Stiekema 等[ 9] 和 Silverthorne
等[ 10]研究黑暗条件下浮萍 G3 品系黄化叶状体中
rbcS 基因表达结果表明 , rbcS 的 mRNA 水平很
低 ,据此他们认为光可以在转录水平上影响 rbcS
的表达。本文支持这种观点 。黑暗条件下 ,紫萍
P143 rbcS 基因的表达处于相当低的水平 ,这意味
着 Rubisco 小亚基合成的减少和 Rubisco 含量的降
低。当半叶状体重新照光以后 , rbcS 基因又能重
新转录 ,这说明在长时间的黑暗条件下培养后 ,半
叶状体的生物学功能并未完全丧失。导致紫萍
P143半叶状体在黑暗培养条件下不衰老的原因尚
需进一步研究 。半叶状体转移到长日照下又能很
快衰老的分子生物学机理也需深入探讨。
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