全 文 ：中 国 酿 造
2012年 第 31卷 第 8期
总第 245期
收稿日期：2011-04-06
基金项目：国家“十二五”重大科技支撑计划课题（2011BAD22B03）
作者简介：李新波（1984-），男，湖北麻城人，在读硕士研究生，研究方向为生物质能源；赵 海*，研究员，通讯作者。
少根紫萍（Landoltiapunctata）高比例燃料丁醇发酵方法研究
李新波1，2，靳艳玲1，郜晓峰1，2，张国华1，赵 海1*
（1.中国科学院 成都生物研究所，环境微生物四川省重点实验室，四川 成都 610041；
2.中国科学院 研究生院，北京 100049）
摘 要：以少根紫萍（Landoltiapunctata）为原料，以丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）CICC8012为菌种发酵生产燃料丁醇的
研究。筛选出高淀粉含量的少根紫萍，HPLC分析其酸水解液表明，单糖组成有葡萄糖、木糖和半乳糖。糊化后的少根紫萍培养基可以
直接发酵，47.50g/L的初总糖发酵可生成9.31g/L的丁醇、13.60g/L的丙酮丁醇乙醇，发酵得率为0.35，其中丁醇占总溶剂的比例为68.46%，比
玉米发酵的高14.11%。少根紫萍培养基经降黏后发酵，丁醇和总溶剂分别提高到9.61g/L和14.80g/L，比没降黏的提高了3.22%和
8.82%。HPLC分析表明发酵残糖含有以木糖和半乳糖为单糖组成的寡糖和少量的葡萄糖。该研究首次开发了一种新型非粮原料少根
紫萍发酵生产燃料丁醇，工艺简单，并且还具有目标产物丁醇在总溶剂的比例高的优点。
关 键 词：丙酮丁醇梭菌；少根紫萍；燃料丁醇；发酵得率
中图分类号：S216.2 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2012）08-0085-04
FermentationmethodofhighratiosofbiobutanolwithLandoltiapunctata
LIXinbo1，2,JINYanling1,GAOXiaofeng1，2,ZHANGGuohua1,ZHAOHai1*
(1.ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,EnvironmentalMicrobiologyKeyLaboratoryofSichuanProvince,
Chengdu610041,China;2.GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)
Abstract:ButanolproducedfromLandoltiapunctatabyClostridiumacetobutylicumCICC8012wasstudied.HighstarchcontentduckweedL.punc-
tatawasscreened and the monosaccharide composition ofacidic hydrolysate ofL.punctatac nta ns glu ose, x lose and galactose was obtained by
HPLCanalysis. It was found that the gelatinizedL.puctatacultur m dium could be fermented directly. It was observed that 9.31g/Lbutanol and
13.60g/Lacetonebutanolethanol (ABE)wasproducedfrom47.50g/LtotalsugarofgelatinizedculturemediumofL.punctataandthefermentation
yieldwas0.35,inwhich,butanolaccountedfor68.46%oftotalsolventand14.11%higherthanthatfermentedwithcornstarch.Thewasfermented
after,YieldofbutanolandABEreached 9.61g/Land 14.80g/L, respectively, when fermented with viscosityreduced gelatinized culture medium of
L.punctata, which showed an improvement of 3.22% and 8.82% respectively. Analysis with HPLC indicated that residual sugar mainly contained
polysaccharidesthat composed ofxylose and galactose, and a little glucose. This research firstlydeveloped a new non-raw feedstock on biobutanol
fermentationtechnology,whichwassimpleandhadadvantagesofhighratiooftargetproduct-biobutanol.
Keywords:Clostridiumacetobutylicum;Landoltiapunctata;biobutanol;yield
石化资源的日趋枯竭以及持续的环境恶化正制约着
包括我国在内的世界各国的经济和社会的可持续发展。特
别是我国面临着原油对外依赖度不断增加的严峻形势，严
重影响了国家的战略安全，发展低碳、环保、可再生的生物
质能源是应对这一资源与环境危机的重要方向和手段。
丁醇不仅是一种重要的化工原料，而且还是一种极具
潜力的可再生能源。其热燃值、辛烷值与汽油相当，含氧
量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道，便
于利用现有管道进行输送，蒸汽压低、安全性高且能与汽
油以任意比混合[1]；丙酮丁醇生产菌底物利用范围广，对
己糖、戊糖都能利用[2]；由于具有上述的优良特性，丁醇作
为新型可再生能源已经引起了各国研究者和企业的兴趣。
虽然丁醇作为生物燃料的前景诱人，但发酵法生产燃料丁
醇的产业化还存在很多问题，如菌种的丁醇耐受性差，发
酵液中丁醇浓度超过1.3%即对菌体产生毒害；丁醇在总溶
剂中的比例相对较低（60%左右[3]）；工业生产中原料成本
太高[3]等。这些因素导致了丁醇生产成本过高，缺乏市场
竞争力。开发高比例燃料丁醇发酵方法不仅可以提高目标
产物丁醇的获得率，而且可降低后续蒸馏工艺的能耗，是
燃料丁醇研究的重要方向之一。目前，丙酮丁醇发酵法工
业生产中大都使用玉米、糖蜜等淀粉质或糖质原料，这不
仅使得生产成本居高不下，而且违背了国家“不与人争粮，
不与粮争地”的生物质能源发展的策略。因此开发低成本
的能够发酵生产丁醇的新型生物质原料，开展高丁醇比例
的燃料丁醇研究具有重要的战略意义和经济价值。
浮萍科（Lemnaceae）植物通常简称浮萍，全世界共有
5个属，38个种[4]，我国有4个属[5]。浮萍淀粉含量高，木质素
含量很少[6]，是用于燃料乙醇和燃料丁醇发酵生产的极具
潜力的原料。以新型水生能源植物浮萍为原料来发酵产
丙酮丁醇具有独特的优势：①浮萍可以吸收水体中的
氮、磷，在综合治理污水的同时生产了大量的生物质[7]；
②浮萍繁殖速度快，约2d~7d可繁殖一代，年产量[7]达
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55t/hm2干重。③浮萍的淀粉含量高，可达75%[8]（干重），
并且丙酮丁醇梭菌能直接利用糊化的淀粉，不需要酵母酒
精发酵的液化和糖化工艺，工艺流程更简单；④浮萍含有
约10%的纤维素，只含有2.4%的木质素[9]，因此添加少量的
纤维素酶后又可以提高发酵得率；⑤丙酮丁醇发酵还产生
氢气（占总废气的37.93%[10]），氢气也是一种清洁能源，收
集利用又可以提高浮萍燃料丁醇的净能源产出率。CHEN
Y等[11]报道尝试利用浮萍中的淀粉发酵产出乙醇，产率为
25.8%（干重）。而以浮萍为原料发酵产丙酮丁醇在国内外
还没有报道。
本实验进行了以少根紫萍为原料，以丙酮丁醇梭菌
ClostridiumacetobutylicumCICC8012为菌种发酵生产燃
料丁醇的研究。初步发酵实验表明，淀粉含量较高的少根
紫萍培养基糊化后可以发酵产生丙酮丁醇。少根紫萍培
养基经降黏后发酵，丁醇和总溶剂分别提高到9.61g/L和
14.80g/L，比没降粘的提高了3.22%和8.82%。研究开发了
一种新型非粮原料少根紫萍发酵生产燃料丁醇，工艺简单，
并且还具有目标产物丁醇在总溶剂的比例高的优点，为
以新型非粮原料浮萍发酵生产燃料丁醇的工业应用提供
了一定基础。
1 材料与方法
1.1材料
菌种：丙酮丁醇梭菌ClostridiumacetobutylicumCICC
8012，购自中国工业微生物菌种保藏中心，发酵产物包括
乙醇（E）、丙酮（A）、丁醇（B），三者称为总溶剂（ABE）。降
粘酶系：本实验室开发。
1.2浮萍原料
少根紫萍：采于四川省成都市邛崃回龙镇（北纬N：
30°17′0.11″，东经E：103° 9′55.10″海拔H：467m），60℃烘干
后打粉，过35目筛后干燥保存。
1.3培养基及培养条件
种子培养基：50g玉米粉加1L水，混匀，煮至微沸后继
续煮1h成糊状，补足水分后分装于厌氧管中，通氮气除氧，
盖好内外塞，121℃灭菌1h，自然pH值。取菌种，以10%的接
种量接种到厌氧管中，沸水浴90s，置于37℃培养箱中静置
培养24h后可作为种子接种到发酵培养基中。
保存培养基：同种子培养基。37℃静置培养至无气体
产生，4℃冷藏保存。
少根紫萍培养基：少根紫萍粉和蒸馏水按1∶7~1∶9（质
量：质量）的比例混匀后，微沸糊化8min~10min，分装50mL
培养基于100mL厌氧瓶内，通氮气除氧，盖好内外塞，121℃
灭菌15min。
玉米培养基：50g玉米粉加1L水，混匀，煮至微沸后继
续煮1h成糊状，补足水分后分装50mL于厌氧瓶中，通氮气
除氧，盖好内外塞，121℃灭菌15min，自然pH值。
发酵条件：将已培养24h的种子液以10%的接种量接
种到发酵培养基中，37℃静置培养72h～90h。
1.4测定方法
溶剂测定：采用FULI9790气相色谱仪测定溶剂含量，
FID检测器，色谱柱为GDX-103，柱箱温度180℃，检测器温
度200℃，进样器210℃，载气为N2，流速30mL/min。以异丁
醇为内标物，进样量1μL。
糖的测定：
（1）HPLC法：样品预处理：参照国标GB/T5009.9-2008
酸水解法[12]：取样品6g左右放入250mL水解瓶中，加入
100mL蒸馏水和30mL6mol/L盐酸溶液。沸水浴水解2h后，
流水迅速冷却，用40%的氢氧化钠调pH值至中性，加入
20mL20%醋酸铅溶液摇匀后静止10min沉淀蛋白质，加水
定容至500mL，过滤，弃去初滤液，取5mL滤液以1mL/min
的流速通过预活化好的反相C18固相萃取小柱，弃去最初
的2mL，收集后面的3mL，再用0.22μm的水系滤膜过滤，滤
液供HPLC分析（色谱条件：水为流动相，流速0.6mL/min，
Bio-RedAminexHPX-87P糖分析柱，300mm×7.8mm，柱温
79℃，进样量20μL，蒸发光检测器ELSD2000，漂移管95℃，
氮气为载气，气压2.8Bar）。
（2）DNS法：对有还原性的单糖采用3，5-二硝基水杨
酸（DNS）比色法[13]。
醪液黏度测定：取20mL醪液，采用DV-2+PRO数字式
黏度计，30℃条件下进行测定，运行10s后读数，重复3次，
取平均值。
1.5计算方法
发酵得率（ABEyield）=总溶剂产量（g/L）/消耗的糖浓度（g/L）
丁醇占总溶剂的比例=丁醇产量（g/L）/总溶剂产量（g/L）×100%
2 结果与分析
2.1高淀粉含量浮萍的筛选及单糖分析
有报道紫背浮萍淀粉含量达为3%～75%[8]。作为燃料
丁醇发酵生产的原料，淀粉含量的高低是首要的筛选指
标，因此选育高淀粉含量的浮萍品种是研究的基础。课题
组采集了绿萍、少根紫萍、多根紫萍、芜萍等大量浮萍品
种，并分析[12]了其淀粉含量，其淀粉含量为12%～47%，其
中淀粉含量最高的是芜萍，但由于在自然环境中芜萍多与
少根紫萍和多根紫萍混居，不易大量收获纯的芜萍；少根
紫萍具有淀粉含量高（干重32.24%，仅次于芜萍），生长快，
适应性强并且易于大量收获等优点，因此选用少根紫萍作
为发酵原料。
HPLC法对少根紫萍酸水解液的单糖组成进行了分
析，结果见图1，HPLC图谱表明少根紫萍酸水解液的单糖
组成有葡萄糖、木糖和半乳糖，其比例为28∶1∶4，含量分别
为32.24%、1.15%、4.61%。这些单糖均可被丙酮丁醇梭菌
利用发酵产丁醇，其可发酵糖含量达38%，表明新型非粮
水生作物少根紫萍作为燃料丁醇发酵生产的原料具有巨
大潜力。
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2.2以少根紫萍为原料的丙酮丁醇初步发酵
分别以玉米和少根紫萍为原料来发酵丁醇，糊化后的
少根紫萍培养基即可直接发酵，47.50g/L的初总糖生成
9.31g/L的丁醇、13.60g/L的总溶剂，发酵得率为0.35，其中丁
醇占总溶剂的比例为68.46%，比玉米发酵的高14.11%，结果
见图2。说明少根紫萍的丙酮丁醇发酵是可行的，并且还具
有发酵后丁醇占总溶剂的比例高的优点。重复3次的试验
表明，少根紫萍的丙酮丁醇发酵丁醇占总溶剂的比例平均
比玉米发酵的高8%。
传统原料的发酵，不管是玉米还是糖蜜，丙酮丁醇发
酵的3种产物比例[8]基本是丁醇∶丙酮∶乙醇=6∶3∶1，但是以
少根紫萍为原料的丙丁发酵丁醇占总溶剂的比例为
68.46%，比玉米发酵的高14.11%。其可能的原因是以少根
紫萍为原料的丙酮丁醇发酵培养基中还原力较强，使得丙
酮丁醇发酵代谢途径中乙酰乙酰辅酶A在强还原力环境
中转换成了丁酰辅酶A生成丁醇而不是转换成乙酰乙酸
生成丙酮的代谢路径[3]。
2.3少根紫萍培养基降黏发酵
少根紫萍培养基直接发酵时出现的问题就是糊化后
的少根紫萍培养基自由水少，黏度很大；而且丙酮丁醇发
酵是静置发酵，导致其发酵时培养基的传质传热效果差。
因此，糊化后培养基黏度较大是少根紫萍燃料丁醇发酵的
不利因素之一。为降低糊化后少根紫萍培养基的黏度，本
实验室开发出了以降黏酶系处理的酶法前处理工艺，结
果见附表。
附表结果表明，降黏酶系处理后，培养基的黏度从
27Pa·s降为0.98Pa·s，降黏后少根紫萍培养基的流动性很
好。少根紫萍培养基经降黏后发酵，丁醇和总溶剂分别
提高到9.61g/L和14.80g/L，比没降黏前提高了3.22%和
8.82%。其中丁醇占总溶剂的比例为64.93%，发酵得率为
0.38。说明少根紫萍培养基经降黏后发酵效果更好。
2.4降黏工艺的糖组分变化
为进一步考察少根紫萍培养基经降粘后发酵丁醇和
总溶剂都增加的原因是降黏酶系处理后可发酵糖的增加
还是由于降黏后培养基自由水释放而使得传质传热效果
更好，对少根紫萍培养基降黏工艺的糖组分变化进行了分
析，HPLC分析结果见图3。降黏前后的HPLC分析表明，降
黏酶系处理后，可发酵糖（主要是葡萄糖）并没有增加，只
是保留时间为6.1min的寡糖有明显增加，说明少根紫萍培
养基经降黏后发酵丁醇和总溶剂都增加的原因不是来自
于降黏酶系处理后可发酵糖的增加。
2.5少根紫萍为原料的丙酮丁醇发酵后的残糖分析
发酵残糖的多少直接关系到丙酮丁醇发酵得率和产
物浓度。同时，过高的残糖也会增加发酵废渣液的COD值，
提高后期处理负荷。如能减少残糖，不仅可以提高发酵得
率和产物浓度，而且发酵干渣的排放量也会相应减少，可
以显著的降低下游工艺废渣的处理负荷，提高处理效率。
附表 降黏酶系的降粘效果
Attached table The effect of viscosity reduction of culture medium of
Landoltia punctata by viscosity reduction enzyme
处理方法 降黏前/（Pa·s） 降黏后/（Pa·s）
降黏酶系处理 27±0.9 0.98±0.23
无降黏酶系处理 27±0.6 25.7±0.9
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HPLC法分析了少根紫萍丙酮丁醇发酵后的残糖，结
果见图4。发酵醪酸水解前，除了有葡萄糖外还有2个寡糖
峰，说明发酵醪中还有不能被丙酮丁醇梭菌Clostridium
acetobutylicumCICC8012水解和利用的寡糖；少量的葡萄
糖则说明发酵醪中含量很少的葡萄糖也还没被菌体利用，
以玉米为原料的丙酮丁醇发酵也是同样的情况。发酵醪酸
水解后，寡糖被水解，生成了木糖和半乳糖，说明发酵醪中
残余的寡糖含有木糖和半乳糖，可能还有葡萄糖，不能被
丙酮丁醇梭菌ClostridiumacetobutylicumCICC8012水解
和利用[15]。
3 结论
实验进行了以少根紫萍（Landoltiapunctata）为原料，
以丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）CICC8012为
菌种发酵生产燃料丁醇的研究，通过对实验结果进行分析
和讨论，得出：（1）糊化后的少根紫萍培养基即可直接发
酵，47.50g/L的初总糖生成9.31g/L的丁醇、13.60g/L的总溶
剂，发酵得率为0.35。说明少根紫萍的丙酮丁醇发酵是可行
的。（2）少根紫萍的丙酮丁醇发酵后丁醇占总溶剂的比例比
玉米的高，最高的丁醇占总溶剂的比例为68.46%，比玉米
发酵的高出14.11%，具有目标产物丁醇在总溶剂的比例高
的优点。（3）针对少根紫萍培养基糊化后粘度较大的问题，
经过降黏处理后发酵，丁醇和总溶剂分别提高到9.61g/L
和14.80g/L，其中丁醇占总溶剂的比例为64.93%。说明少根
紫萍培养基经降粘后发酵效果更好。
本研究开发了一种新型非粮原料少根紫萍发酵生产
燃料丁醇和酶法前处理工艺，具有目标产物丁醇在总溶剂
的比例高的优点，为以新型非粮原料浮萍发酵生产燃料丁
醇的工业应用提供了一定基础。
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