全 文 ：中国农业科学 2009,42(10):3516-3521
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.10.017

收稿日期：2008-12-09；接受日期：2009-04-13
基金项目：国家“十一五”科技支撑重大项目（2006BAD08A09）
作者简介：卢宗志（1969－），男，吉林延吉人，副研究员，博士研究生，研究方向为农田杂草。Tel：0434-6283179；E-mail：luzongzhi1969@163.com。
通信作者张朝贤（1955－），男，河南郏县人，研究员，博士，研究方向为杂草科学。Tel：010-62815937；E-mail：cxzhang@wssc.org.cn


抗苄嘧磺隆雨久花 ALS 基因突变研究
卢宗志 1，2，3，张朝贤 2，傅俊范 1，李茂海 3，李贵军 3
（1 沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110000；2 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；3 吉林省农科院植物保护研究所，吉林公主岭 136100）

摘要：【目的】近年来，中国东北水稻田抗药性雨久花发生严重，部分地区用苄嘧磺隆已无法有效控制该杂
草的危害。为明确该杂草抗药性发生的根本原因，本试验从分子水平上研究了稻田杂草雨久花（Monochoria
korsakowii）对苄嘧磺隆的抗药性机理，以确定导致抗药性产生的乙酰乳酸合成酶（ALS）氨基酸突变位点。【方
法】利用 PCR 技术，通过对抗药性雨久花生物型和敏感性雨久花生物型 ALS 片段进行扩增和基因克隆，最后对 DNA
序列进行测序比对。【结果】与敏感性的雨久花 ALS 相比，抗药性雨久花生物型的 ALS 共有 3 处发生突变，即第
197 位脯氨酸突变为组氨酸，第 200 位蛋氨酸突变为缬氨酸，第 388 位精氨酸突变为组氨酸，其中第 197 位突变
与诸多文献报道相符。【结论】抗药性雨久花 ALS 第 197 位的突变可能是雨久花对苄嘧磺隆产生抗药性的主要原因。
其它 2个氨基酸突变是否也导致杂草对苄嘧磺隆产生抗药性未见相关报道，有待进一步研究。
关键词：乙酰乳酸合成酶；苄嘧磺隆；雨久花；抗药性

Molecular Basis of Resistance to Bensulfuron-Methyl
in Monochoria korsakowii
LU Zong-zhi1,2,3, ZHANG Chao-xian2, FU Jun-fan1, LI Mao-hai3, LI Gui-jun3
(1College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110000; 2Institute of Plant Protection, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193; 3Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences,
Gongzhuling 136100, Jilin)

Abstract: 【Objective】 In recent years, Monochoria korsakowii has been a serious problem in paddy fields in northeast of
China. It has become a weed which is very difficult to control by bensulfuron-methyl in some areas in the region. The objective of
this study is to understand the molecular basis of the resistance mechanism to bensulfuron-methyl in Monochoria korsakowii and to
find the specific mutation sites in amino acid sequence of acetolactate synthase (ALS) in the resistant Monochoria korsakowii
biotype. 【Method】Using the PCR method, fragments that encode the ALS were cloned from Monochoria korsakowii, susceptible (S)
and resistant (R) biotypes to bensulfuron-methyl respectively, and sequenced subsequently. 【Result】 The result showed that the
nucleotide sequence of R M. korsakowii biotype differed from that of the S biotype by three nucleotide substitutions, that were
proline (Pro) 197 substituted by histidine (His), methionine (Met) 200 by valine (Val), and arginine (Arg) 388 by histidine (His)，
among those, the amino acid substitution of Pro197 (CCT) to His (CAT) had been reported in many other resistant weeds.
【Conclusion】 It is clear that the substitution of Pro197 may be responsible for the resistance to bensulfuron-methyl in the R M.
korsakowii biotype. The functions of the other two mutations in the R biotype need to be further investigated.
Key words: acetolactate synthsas; bensulfuron-methyl; Monochoria korsakowii; herbicide resistance

0 引言
【研究意义】雨久花（Monochoria korsakowii）
是雨久花科（Ponteriaceae）雨久花属（Monochoria）
植物，是中国北方各省区稻田的主要恶性杂草，该杂
草能在较短的时间内对水稻造成郁蔽，遮光和降低水
10 期 卢宗志等：抗苄嘧磺隆雨久花 ALS 基因突变研究 3517
温，导致水稻严重减产[1]。目前用于水稻田防除该类
杂草的药剂主要是磺酰脲类除草剂，该类药剂属于乙
酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂，该酶是催化支链氨基
酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸生物合成过程中的一个
关键酶。抑制 ALS 活性可使杂草因缺失这 3 种氨基酸
死亡。ALS 抑制剂主要有磺酰脲类（SU），咪唑啉酮
类（IMI），三唑并嘧啶磺酰胺类（TP）、嘧啶水杨
酸类（pyrimidinylsalicylidacids）等[2-3]。然而，由于该
类除草剂作用位点单一和大量的重复使用，导致了抗
该类除草剂杂草的大量出现[4-13]。截止目前，世界各
地已有 98 种杂草对 ALS 抑制剂产生了抗药性[14]。抗
药性雨久花的报道最早见于日本和韩国[15-16]，但有关
ALS 基因序列变异方面却未见报道。本文通过对抗药
性雨久花进行 ALS 基因突变研究，从基因和分子水平
了解其抗药性机制，可为水稻生产上防止或延缓抗药
性杂草的发生以及培育和筛选抗除草剂的作物品种提
供理论依据。【前人研究进展】第一例抗 ALS 抑制剂
的杂草是发现于 1987 年的麦田杂草刺莴苣（Lactuca
serriola），该田块经连续五年使用氯磺隆而导致该杂
草产生了抗药性[17-18]。一般来讲乙酰乳酸合成酶对该
酶抑制剂活性的降低是杂草产生抗药性的主要原因，
其次是对除草剂代谢的增强。目前由靶标位点氨基酸
突变产生的杂草抗药性报道较多，而且抗性能稳定遗
传，其抗性基因在克隆并导入拟南芥后，仍然拥有抗
性功能[3]。在大多数情况下，杂草对 ALS 抑制剂抗性
的产生是由于 ALS 基因产生一个或几个突变所致。在
田间发现的抗药性杂草中，ALS 基因中 6 个保守氨基
酸中任何一个的改变都可以导致对 ALS 抑制剂抗药
性的产生。这 6 个氨基酸的改变以拟南芥氨基酸排列
顺序为标准，分别是第 122 位丙氨酸（Ala122）被苏氨
酸取代，第 197 位脯氨酸（Pro197）被组氨酸、苏氨酸、
精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸或谷氨
酰胺所取代，第 205 位丙氨酸（Ala205）被缬氨酸所取
代，第 376 位天门冬氨酸（Asp376）被谷氨酸所取代，
第 574 位的色氨酸（Trp574）被亮氨酸所取代，第 653
位丝氨酸（Ser653）被苏氨酸或天门冬酰胺所取代[2-3]。
其中 Pro197、Asp376、Ser653 这 3 个位点的改变对磺酰
脲类除草剂产生较强的抗药性而 Ala205 的改变对磺酰
脲类除草剂产生较低水平的抗药性[3,8]。【本研究切入
点】中国从 20 世纪 90 年代初期开始大量使用磺酰脲
类除草剂苄嘧磺隆和吡嘧磺隆防治水田阔叶杂草，至
今已有 18 年的历史。近几年东北地区稻田杂草雨久花
危害日益严重，部分地区用苄嘧磺隆和吡嘧磺隆已无
法有效控制该类杂草的发生。危害严重的田块，杂草
群落的种群组成减少，甚至成为群落的唯一优势种。
根据笔者的调查和省内同行的研究，该类杂草在吉林
省多个地区已产生了抗苄嘧磺隆和吡嘧磺隆的杂草生
物型[19-21]。【拟解决的关键问题】本研究的目的是从
分子水平上鉴定是否雨久花对苄嘧磺隆的抗药性是由
ALS 基因突变所致，并明确其产生抗药性突变的基因
位点。为今后制定雨久花防除策略和延缓其抗药性种
群的发展提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试植物
抗药性雨久花种子于2006年9月采自吉林省柳河
县三元浦镇，该稻区多年连续使用磺酰脲类除草剂苄
嘧磺隆和吡嘧磺隆，稻田雨久花已对磺酰脲类除草剂
产生抗药性，种子采回后室内盆栽，在雨久花 2～3 叶
期经苄嘧磺隆 67.5g a.i./hm2茎叶喷雾处理存活结实。
对照敏感性雨久花种子于 2006 年秋采自吉林省
柳河县三元浦镇附近水泡自生雨久花。在雨久花 2～3
叶期经苄嘧磺隆 20 g a.i./hm2茎叶喷雾处理死亡，秋后
在旁边采集种子以备试验使用。
为打破种子休眠，将种子浸泡在水中，放入 4℃
储藏柜 1 个月，其间换水两次，以去掉抑制萌发的物
质，然后在光照培养箱内按 17℃/10 h 暗周期，28℃/14 h
光周期，共 48 h 后播入直径为 25 cm 装有稻田土的塑
料盆内。放置到温室中，生长条件为 25℃/14 h 光周期，
14℃/10 h 暗周期，待植株长到 3～5 叶期，分别取同
等部位幼嫩叶片，放入－80℃冰箱保存。以备试验使
用。
1.2 DNA 的提取
利用改良的 CTAB 法[22]提取雨久花 DNA。
A 取少量新鲜嫩叶片于 1.5 ml 微量离心管内在
液氮中研磨；
B 加入 700 μl 2×CTAB（同时加入 2% ß-巯基
乙醇）提取液，于 65℃震荡水浴中放置 30 min；
C 冷却，加入 500 μl[酚﹕氯仿﹕异戊醇（25﹕
24﹕1）]，震荡至形成乳浊液；
D 12 000 r/min，室温离心 5 min；
E 将上层水相转入新的离心管中，加入 0.2 μl
的 RNA 酶（10 mg·ml-1），37℃放置 1 h；
F 重复[氯仿﹕异戊醇（24﹕1）]抽提 1 次，离
心，将水相转入无菌离心管中；
G 加入 0.8 倍体积的异丙醇，颠倒离心管数次，
3518 中 国 农 业 科 学 42 卷
离心，沉淀即为基因组 DNA；
H 用 70%的乙醇洗涤沉淀 2 次，空气中干燥，
向每管中加入 30 μl ddH2O 溶解沉淀。
1.3 引物的设计与合成
通过美国生物技术信息公司（NCBI）基因库
（GenBank）登录的 X51514（拟南芥）等 7 种植物的
ALS 氨基酸序列，找出几种植物共有的同源保守区，
利用 Primer premier 5 程序各设计了 3 条上游引物和 3
条下游引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
上游引物：F1 CGGATACGCSCGCTCACTG
F2 TGACGCCTTCCARGAGACGC
F3 GGTCTTGGTGTTTACCCTCTGG
下游引物：R1 CACCAGGATTACCGACSGCAG
R2 CCCTCCAGGCTGAGAAATCC
R3 GGGAGGCGGGAGACATAACC
S=C 或 G, R=A 或 G
1.4 雨久花 ALS 基因片段的扩增、克隆及测序
利用上述 6 个引物，共设计 8 个组合，分别为：
F1-R1，F1-R2，F1-R3，F2-R1，F2-R2，F2-R3，F3-R1，F3-R2。
PCR 反应条件如下：94℃预变性 4 min，94℃变性 45 s，
60℃退火 60 s，72℃延伸 90 s，共 30 循环；72℃后延
伸 8 min，4℃保存。扩增产物在 0.8%TAE 琼脂糖凝
胶中电泳。
采用美国OMEGA BIO-TEK公司生产的E.Z.N.A.
Gel Extraction Kit 试剂盒对 PCR 产物进行回收。将回
收片段连接到 T-easy 载体，然后转到大肠杆菌感受态
细胞 TOP10 中，涂布于含有 Ampicilin 和 X-gal/ITPG
的 LB 固体培养基上培养过夜，挑取白色菌落到含
Ampicilin LB 培养液中过夜震荡培养，然后利用 SDS
碱裂解法[22]提取质粒。对重组质粒按上述 PCR 条件进
行扩增，经电泳检测，出现目的片段的为阳性克隆。
序列测定采用美国 ABI 公司的 3730XL 测序仪和双脱
氧链终止法进行，委托上海生工生物工程技术服务有
限公司完成。
2 结果与分析
2.1 ALS 基因片段的扩增与克隆
在上述 PCR 反应条件下，共有 3 个组合可扩增出
相应的 ALS 片段，其中 F1-R1组合得到的片段最长，
约为 1 200 bp，该扩增产物在 0.8%TAE 琼脂糖凝胶中
电泳的图像见图 1-A。对该片段进行回收，回收条带
清晰，与浓度 50 ng·μl-1 的 λDNA mark 相比，回收片


A：抗药性、敏感性生物型雨久花 ALS 基因 PCR 扩增；B：抗药性、
敏感性生物型雨久花 ALS 基因片段与重组质粒的 PCR 鉴定；1：抗药
性雨久花；2：敏感性雨久花；M：200 bp DNA 分子量标准
A: Amplification of ALS fragments from susceptible- and resistant-
Monochoria korsakowii plants by PCR method; B: Identification of the
insertion of the fragments from susceptible- and resistant- Monochoria
korsakowii biotype by PCR method; 1: susceptible biotype; 2: resistant
plants. M: 200bp DNA Marker

图 1 雨久花 ALS 基因片段扩增与克隆
Fig. 1 Amplification and clone of M. korsakowii ALS gene
fragments

段浓度约为 10 ng·μl-1。
对由上述片段重组的质粒重新进行 PCR 鉴定，由
2 种生物型扩增出的片段均呈阳性。其片段大小与最
初 PCR 产物大小相同见图 1-B。
2.2 雨久花 ALS 基因片段的生物信息学分析
对测序结果在 NCBI 中进行 BLAST，然后将得到
的雨久花 ALS 基因片段与拟南芥 ALS 基因片段用
DNAman 软件进行同源性比对，结果发现，得到的雨
久花 ALS 基因序列与拟南芥的基因序列同源率为
66.75%，蛋白同源性为 76.67%，证明扩增到的雨久花
ALS 基因序列是正确的。对扩增出的抗药性和敏感性
雨久花基因片段测序结果用 DNAman 软件进行比对，
其序列对比结果如下：
与敏感性生物型相比，抗药性雨久花 ALS 编码区
克隆部分与敏感性雨久花共有 3 个氨基酸残基发生突
变（图 2），即第 197 位脯氨酸突变为组氨酸，第 200
位蛋氨酸突变为缬氨酸，第 388 位精氨酸突变为组氨
酸。在这 3 个突变位点中，只有第 197 位氨基酸的突
变被诸多研究抗药性机理的文献报道，第 197 位脯氨
酸可导致杂草抗药性生物型对磺酰脲类除草剂产生抗
药性，而试验中检测到的另外 2 个氨基酸的突变是否
也会导致抗药性，至今未见报道。同样可导致杂草对
磺酰脲类药剂产生抗药性的第 205 位氨基酸残基和第
376 位氨基酸残基没有发生突变，2 种生物型在这 2
个位点完全一致。
10 期 卢宗志等：抗苄嘧磺隆雨久花 ALS 基因突变研究 3519



R：抗药性雨久花 ALS DNA 序列及对应氨基酸序列；S：敏感性雨久花 ALS DNA 序列及对应氨基酸序列；A：拟南芥 ALS DNA 序列及对应氨基酸
序列。文中所有氨基酸和基因碱基的编码皆以拟南芥氨基酸和基因碱基编码为标准。黑色字体为突变位点
R: ALS DNA and corresponding amino acid sequence from resistant- Monochoria korsakowii biotype; S: ALS DNA and corresponding amino acid sequence
from susceptible- Monochoria korsakowii biotype; A: ALS DNA and corresponding amino acid sequence from Abrabidopsis thaliana. The numbers of amino
acid and DNA base are based on the numbers of that from Abrabidopsis thaliana. The black letters indicate the mutant sites

图 2 抗药性生物型与敏感性生物型雨久花突变部分 ALS 基因及其氨基酸的比较
Fig. 2 The comparison of mutant parts of ALS gene and amino acid sequences from the susceptible- and resistent- Monochoria
korsakowii plants

3 讨论
基因突变可导致杂草抗药性的产生。本试验中，
只扩增出的 ALS 基因中间部分约 1 200 bp 的片段，其
中含有能使杂草对磺酰脲类除草剂产生抗药性的 3 个
突变位点，即 Pro197，Ala205，Asp376。在雨久花抗药
性生物型中，ALS 基因第 197 位氨基酸为组氨酸，而
敏感性生物型雨久花第 197 位氨基酸为脯氨酸。而其
它 2 个位点的完全相同，说明抗药性生物型雨久花的
ALS 基因在第 197 位氨基酸位点发生了突变。前人研
究证实，这种突变是导致地肤（Kochia scoparia）、
鸭舌草（Monochoria vaginalis）、田芥菜（Raphanus
raphanistrum）、野罂粟（Papaver rhoeas）和萤蔺
（Scirpus juncoides var. ohwianus）等对磺酰脲类除草
剂产生抗药性的分子基础[5,7,23-25]。因此，该突变可能
是雨久花对磺酰脲类除草剂产生抗药性的主要原因。
而发生在第 200 位和第 388 位的氨基酸突变是否也会
导致雨久花对磺酰脲类除草剂产生抗药性目前还未见
报道，需进一步研究予以证实。因为目前在田间的抗
药性杂草和实验室有目的筛选的抗药性绿藻、酵母和
细菌中，已发现有 17 个 ALS 基因位点的改变可导致
对 ALS 抑制剂的抗药性[3]，而这 17 个位点中不包括
第 200 位和第 388 位的氨基酸。
ALS 基因中，杂草对 ALS 抑制剂产生抗药性的 6
个氨基酸突变位点中，Ala122和 Ser653氨基酸的改变对
咪唑啉酮类除草剂产生抗药性，对磺酰脲类除草剂不
产生抗药性或有低水平的抗药性。第 197 为氨基酸可
被多个氨基酸取代，是突变种类最多的一个位点。该
位点的突变主要是对磺酰脲类除草剂产生抗药性，但
在反枝苋（Amaranthus retroflexus）中该位点的突变也
可导致对咪唑啉酮类除草剂的抗药性[3]。用咪唑啉
酮类除草剂咪唑乙烟酸对抗药性雨久花进行防治，
结果发现抗药性雨久花对该除草剂没有交互抗药
性（未发表）。在抗药性苍耳生物型中，发现 Ala205
突变为缬氨酸对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂都有较
低程度的抗药性[3]。Asp376位点以前只在人工选择的酵
母中发现，直到 2007 年才在绿穗苋（Amaranthus
hybridus L.）中发现，该位点突变为谷氨酸后，杂草
对各类 ALS 抑制剂均产生抗药性[8]。在豚草和一些苋
属植物中 Trp574 突变为亮氨酸也对磺酰脲类和咪唑啉
酮类除草剂有较强的抗药性[3]。由于本研究未扩增出
该片段的两端序列，特别是能导致对磺酰脲类除草剂
产生抗药性的第 574 个位点的氨基酸是否发生变异还
不清楚，所以有必要对整个 ALS 基因全长进行扩增，
以便更全面地了解雨久花对磺酰脲类除草剂的抗药性
机制。
3520 中 国 农 业 科 学 42 卷
4 结论
本研究通过对抗药性和敏感性雨久花生物型
DNA 片段进行测序比对，首次从分子水平上明确了雨
久花对苄嘧磺隆的抗药性机理。结果表明，与敏感性
雨久花生物型 ALS 相比，抗药性雨久花生物型 ALS
基因共有 3 次发生突变，即第 197 位脯氨酸突变为组
氨酸，第 200 位蛋氨酸突变为缬氨酸，第 388 位精氨
酸突变为组氨酸，其中第 197 位突变与诸多文献报道
相符，说明该突变位点可能是雨久花对苄嘧磺隆产生
抗药性的主要原因，其它 2 个氨基酸突变是否也导致
杂草对苄嘧磺隆产生抗药性，还需进一步的研究。

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（责任编辑 毕京翠，李 莉）



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