全 文 ：自 1958 年巴西学者 Dobereiner 和 Ruschei 等
首次从热带禾本科作物甘蔗的根际分离到具有固氮
能力的细菌—拜叶林克氏菌（Beijerinckia fluminensis）
以来， 人们对非豆科植物与根系联合的特殊固氮菌
展开了广泛研究 [1]。 至今， 报道具联合固氮能力的
禾本科植物至少有 40 属 100 种 [2-5]。 经检索以及查
阅相关资料， 关于剑麻根际联合固氮方面的研究尚
未见报道。
剑麻是热区重要的纤维作物， 广泛应用于渔
业、 航海、 工矿、 运输、 油田、 制药、 饲料、 肥料
等行业,以及用于编织剑麻地毯、 剑麻特种布、 造
纸、 过滤器、 工艺品、 抛光轮等， 综合利用前景广
阔。 目前我国剑麻种植面积 3 万多 hm2， 主要分布
在广东、 广西和海南， 剑麻种植地土壤较为贫瘠，
因而需要施用大量的氮肥和有机肥料。 基于生产上
的需求， 本研究通过对剑麻根际联合固氮菌的分
离、 筛选和鉴定， 希望获得高效优良固氮菌株， 为
进一步制备剑麻固氮微生物肥料， 以及降低剑麻生
产成本奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究的实验材料为剑麻根际土壤样品和根样
品， 分别采自海南省昌江黎族自治县十月田南迪公
热带作物学报 2011， 32（6）： 1097-1101
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-05-17 修回日期： 2011-05-28
基金项目： 国家科技支撑计划（No.2007BAD48B06）， 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助（No.ITBBZX0827）， 948项目（No.
2010-Z6）， 海南省自然科学基金（No.80510）， 国家麻类现代产业技术体系建设专项（No.CARS-19-E17）。
作者简介： 陈河龙（1979年—）， 男， 助理研究员， 研究方向： 剑麻种质资源。 *通讯作者： 张世清， E-mail: zsq04@126.com。
剑麻根际联合固氮菌的分离及固氮活性测定
陈河龙 1， 李庆洋1,3， 易克贤 1,2， 高建明 1，
郑金龙 1， 刘巧莲 1， 张世清 1*
1中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101
2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所， 海南儋州 571737
3 海南大学农学院， 海南儋州 571737
摘 要 通过选用NFM、 CCM、 Ashby及改良的 Dobereiner培养基， 利用气相色谱仪（GC）对海南省昌江县、 广西
扶绥县和广东雷州市三地剑麻种植基地的剑麻根际联合固氮菌进行分离、 纯化及利用乙炔还原法进行固氮活性测定，
获得 50 株具有固氮活性的菌株， 其固氮酶活性最高的菌株是 ASN004， 固氮酶活性为 1 765.659 0 nmol/（mL·h），
具有开发利用的潜力。
关键词 剑麻； 根际； 固氮菌； 乙炔还原法
中图分类号 S154.38+1； S563.8 文献标识码 A
Isolation of Endophytic Diazotrophic Bacteria from Sisal and
Determination of Their Nitrogenase Activity
CHEN Helong1 LI Qingyang1,3 YI Kexian1,2 GAO Jianming1
ZHENG Jinlong1, LIU Qiaolian1, ZHANG Shiqing1
1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, CATAS; Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology,
Ministry of Agriculture， Haikou, Hainan 571101
2 Institute of Environment and Plant Protection, CATAS, Danzhou, Hainan 571737
3 School of Agronomy, Hainan University, Danzhou, Hainan 571737
Abstract The associative nitrogen fixation bacteria in sisal rhizosphere, sampled from Changjiang County in
Hainan Province, Fusui County in Guangxi Zhuang Autonomous Region and Leizhou City in Guangdong Province,
were isolated and purified by Gas Chromatography on the NFM, CCM, Ashby and modified Dobereiner medium.
And their nitrogen -fixing activity was measured by acetylene reduction method. The result indicated that, 50
bacterial strains had nitrogen -fixing activity. And a bacterial strain No. ASN004 with the highest nitrogenase
activity of 1765.6590 nmol/(mL·h) was found and it had good exploitation potential.
Key words Sisal; Rhizosphere; Nitrogen-fixing bacteria; Gas chromatography
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.06.022
第 32 卷热 带 作 物 学 报
菌液浓度
雷州
重复 1 重复 2 重复 3 重复 1 重复 2 重复 3 重复 1 重复 2 重复 3
10-4 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
10-5 ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ ++ ++
10-6 + + + ++ ++ ++ + + +
昌江 扶绥
表 2 根内（HP）菌株处理二
说明： +表示分离到 1～10 个单菌落， ++表示分离到 10～30， +++表示分离到 30 个单菌落以上。
取样地区 菌液浓度
CCM 培养基
重复 1 重复 2 重复 3 重复 1 重复 2 重复 3
海南昌江
10-4 - - - + - -
10-5 - - - - - -
广西扶绥
10-4 - - - + - -
10-5 - - - - - -
广东雷州
10-2 - - - + - -
10-3 - - - - - -
10-4 - - - - - -
NFM 培养基
10-6 - - - - - -
10-6 - - - - - -
表 1 HP 菌株处理一
说明： -表示没有分离到菌株， +表示分离到 1～10 个单菌落。
司剑麻种植基地、 广西壮族自治区扶绥县山圩农场
剑麻种植基地和广东省雷州市东方红农场剑麻种植
基地， 3 基地的剑麻品种均为 H.11648， 所采集的
样地种植剑麻年限均在 10 a左右。
1.2 方法
1.2.1 取样 选定样地， 采用随机取样法采集生
长健康的剑麻根际土壤样品和根样品。 在每个标准
样地内按 “S” 形随机选择 15 株剑麻， 采集根际土
样时先去除表层的杂物和杂草， 然后在剑麻植株的
根部一侧小心的挖掘一个长宽均为 30 cm， 距地表
深度为 30 cm的坑， 让植株一侧的根系裸露， 然后
用小铲子轻轻刮取黏附在根系表面约 2 mm 左右的
土壤， 并用剪刀剪下部分须根； 采集非根际土样时
取同一地块远离植株根系的土壤[6]。 将 15 株剑麻根
际土样、 根样及非根际土样各分成 3 份（每份为 5
株剑麻的混合样）， 并装入经高压消毒的无菌封口
袋中封好并贴上标签， 置于事先准备的冰盒带回实
验室， 在 24 h内处理和测定。
1.2.2 联合固氮菌的分离与纯化
（1）培养基的选择： 选用 NFM、 CMM、 Ashby、
改良 Dobereiner无氮培养基分离、 纯化土样和根样
中具有固氮能力的细菌类群, 并用 LB 斜面培养基
4 ℃保存， 培养基成分见参考文献[7-9]。
（2）联合固氮菌的分离与纯化： 为便于研究,将
根际区分为: 距根系较远（1 cm）土壤（NRS）、 根表
土壤（RS）、 根系表面（RP）和根内（HP）[6]； 剑麻根际
联合固氮菌的分离与纯化方法参考 Hafeez FY[10]、
田宏[3]和田颖[11]的方法。
1.2.3 利用乙炔还原法对菌株进行固氮酶活性测定
（1）操作步骤： 将已纯化的菌株再次分别接入
盛有 NFM、 CCM 半固体培养基和 Dobereiner 液体
培养基的试管内， 密封后， 置于温度为 28 ℃， 湿
度为 85％的人工培养箱内进行培养 [10] （待 24~48 h
后， 向 10 mL 试管内注入 1％体积的乙炔气体， 在
同样条件的人工培养箱内培养 24 h， 测定其固氮酶
活性（测定仪器为北分 SP-2100 气相色谱仪）。
（2）计算方法： 固氮酶活性计算方法参照文献[7]。
2 结果与分析
2.1 剑麻根际联合固氮菌的分离、 纯化
实验结果表明， Hafeez F Y 和田宏的方法对
NRS、 RS、 RP 固氮菌的分离效果较好。 而对 HP
固氮菌分离效果分别见表 1、 2。
从表 1 可以看出， 在 3 处样品采集地 54 个处
理中， 每地只有一个处理能培养出少量的菌群， 田
宏的方法对 HP 处理的效果不明显， 所分离到的菌
群较少。 此外， 在实验过程中， 通过对昌江和扶绥
的样品处理后 HP 固氮菌分离效果不明显， 故而在
雷州的样品处理时把菌液浓度从 10-4、 10-5、 10-6
分别提高至浓度为 10-2、 10-3、 10-4， 但是接种培养
结果没有什么变化， 分离效果仍然较差。
从表 2可以看出， 采用田颖的方法成功培养获
1098- -
第 6 期
30
25
20
15
10
5
0
菌
株
数
菌株数
＞1 000 ＜1001 000～100 0
固氮酶活性/[nmol/（mL·h）]
图 1 固氮酶活性测定结果柱形
菌株编号 菌株采集地 菌株来源部位 培养基 固氮酶活性/[nmol/（mL·h）]
ASN004 CJ HP Ashby 1 765.659 0
ASN006 CJ HP Ashby 1 598.687 8
ASN023 FS RS CCM 1 575.921 1
ASN037 ZJ HP Ashby 1 300.145 1
ASN001 CJ HP Ashby 1 252.794 9
ASN030 FS HP Ashby 1 220.123 2
ASN021 FS HP Ashby 1 195.902 2
ASN020 FS HP Ashby 1 140.435 0
ASN002 CJ HP Ashby 1 120.918 1
ASN003 CJ HP Ashby 1 065.677 2
ASN012 CJ RS CCM 1 055.354 4
ASN009 CJ NRS CCM 1 014.658 5
ASN042 ZJ RP CCM 993.501 1
ASN033 FS NRS NFM 987.7787
ASN019 FS HP Ashby 920.074 3
ASN035 ZJ HP Ashby 876.329 9
ASN022 FS NRS CCM 853.325 9
ASN050 ZJ RS CCM 824.057 9
ASN010 CJ RP NFM 650.144 2
ASN038 ZJ NRS CCM 602.579 3
ASN044 ZJ RS CCM 530.131 3
ASN005 CJ HP Ashby 443.725 9
ASN008 CJ HP Ashby 418.958 5
ASN028 FS HP NFM 397.810 6
ASN049 ZJ RS NFM 366.590 3
表 3-1 剑麻根际菌株固氮酶活性测定结果
得的固氮菌群落比较多， 分离效果较好， 扶绥样品
的分离效果要好于昌江和雷州的样品分离效果。 在
菌液浓度 10-4时， 昌江、 扶绥和雷州的样品都分离
到 30 个单菌落以上； 而在菌液浓度 10-5时， 昌江
和雷州的样品分离到 10～30 个单菌落， 扶绥的样
品都分离到 30 个单菌落以上； 在菌液浓度10-6时，
昌江和雷州的样品分离到 1～10 个单菌落， 扶绥的
样品都分离到 10～30个单菌落以上。
2.2 剑麻根际联合固氮菌酶活性测定
剑麻根际菌株酶活性测定结果如表 3-1 和表
3-2 所示， 并据此绘制固氮酶活性测定结果图、 菌
株来源部位固氮酶活性比较图、 不同采集地菌株数
量和固氮酶活性比较图、 不同培养基培养固氮酶活
性比较图。
在 51株固氮菌株中 50株具固氮酶活性， 只有
1 株没有固氮酶活性（图 1）； 其中固氮酶活性在
100 nmol/（mL·h）以下的菌株有 11 株， 固氮酶活性
在 1 000～100 nmol/（mL·h）之间的有 27 株， 而固氮
酶活性达到 1 000 nmol/（mL·h）以上的有 12 株， 固
氮酶活性高于何福恒等[2]从水稻、 玉米、 甘蔗根际分
离获得的固氮菌固氮酶活性分别为 2～819、 880～894、
299～934 nmol/（mL·h）， 远高于田宏等[3]从草坪草根
际分离的固氮菌活性 37.78～180.20 nmol/（mL·h），
以及田颖等 [11]从小麦根际分离到的固氮酶活性
30.14～100.77 nmol/（mL·h）， 从而表明了从剑麻根
际分离到的菌株具有较高的固氮酶活性。
不同菌株来源部位， 固氮菌数量和固氮酶活性
陈河龙等： 剑麻根际联合固氮菌的分离及固氮活性测定 1099- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
菌
株
数
＞1 000 ＜1001 000～100 0
固氮酶活性/[nmol/（mL·h）]
菌株数量
图 3 菌株采集地菌株数量和固氮酶活性比较
海南昌江
广西扶绥
广东雷州
0 nmol/（mL·h）
＜100 nmol/（mL·h）
1 000～100 nmol/（mL·h）
＞1 000 nmol/（mL·h）
100％
80％
60％
40％
20％
0％
菌
株
数
百
分
比
/％
图 2 菌株来源部位固氮酶活性比较柱形
菌株来源部位
HP RS NRS RP
强弱有所差异， 其顺序为： HP>RS>NRS>RP（图 2）。
这与田宏 [3]研究结果有差别， 禾本科草坪草固氮菌
株来源以 RS和 RP较多， HP和 NRS相对较少。
不同菌株采集地的菌株数量和固氮酶活性有所
差异， 海南昌江的菌株固氮酶活性比较高， 广西扶
绥的次之， 而广东雷州的比较低（图 3）。 这也许与
采集地的土壤类型 C/N 比、 温度、 湿度和氧气分
压等多种因素相关。
菌株编号 菌株采集地 菌株来源部位 培养基 固氮酶活性
ASN017 FS HP Ashby 354.123 0
ASN025 FS RS CCM 313.220 5
ASN027 FS RS CCM 306.657 0
ASN043 ZJ RP NFM 285.341 9
ASN046 ZJ RS CCM 254.750 4
ASN007 CJ HP Ashby 243.258 7
ASN014 CJ RS CCM 222.316 8
ASN024 FS RS NFM 164.474 7
ASN015 CJ RS CCM 139.736 6
ASN018 FS HP Ashby 133.475 0
ASN048 ZJ RS NFM 133.0246
ASN041 ZJ RP CCM 118.534 7
ASN031 FS NRS NFM 113.680 4
ASN026 FS RS CCM 100.394 9
ASN040 ZJ RP NFM 98.534 7
ASN039 ZJ NRS CCM 88.918 3
ASN045 ZJ RS CCM 87.942 4
ASN013 CJ RS NFM 87.849 9
ASN032 FS NRS CCM 60.200 2
ASN047 ZJ RS NFM 49.507 8
ASN011 CJ RP CCM 40.477 6
ASN029 FS HP CCM 25.203 2
ASN036 ZJ HP Ashby 5.874 2
ASN016 FS HP Ashby 4.439 3
ASN034 ZJ HP Ashby 1.800 2
ASN051 ZJ RS CCM 0.000 0
表 3-2 剑麻根际菌株固氮酶活性测定结果
说明： CJ 表示菌株采集地为海南昌江， FS 表示菌株采集地为广西扶绥， ZJ 表示菌株采集地为广东雷州。
1100- -
第 6 期
不同培养基培养效果同样有所差异， 培养菌株数
量和固氮酶活性效果最好的为 Ashby培养基， 其次为
CCM培养基， 最差的培养效果为 NFM培养基（图 4）。
而在何福恒等[2]研究中， 以慢型快长根瘤菌培养基最
好， 其次是琥珀酸钠盐和苹果酸钾盐培养基， 修改伯
克氏培养基没有分离到有明显酶活的菌株。
3 讨论与结论
从剑麻根际分离出来的菌株基本上都具有固氮
能力， 根际不同部位固氮菌的数量有所差异， 分离
到的菌株多数来自 HP（42％）和RS（34％）， 来自
NRS和 RP的分别仅占 14％和 12％。 这与姚拓等[12]
分离燕麦根际固氮菌时各分布部位不同， 其分布呈
RP>RS>NRS≥HP 趋势。 分布趋势与固氮菌在不同
部位所处生态位和菌株本身属性有关。 剑麻根际固
氮菌活性在 1 765.659 0~1.800 2 nmol /（mL·h）
之间 ， 相差较大 ， 其中 12 株固氮酶活性达到
1 000 nmol/（mL·h）以上， ASN004 菌株固氮酶活性
达到 1 765.659 0 nmol/（mL·h）， ASN034 菌株固氮
酶活性仅有 1.800 2 nmol/（mL·h）。 ASN004 菌株固
氮酶活性比姚拓·等 [12]的燕麦根际 CHO3 菌株固氮
酶活性 1 147.9 nmol/（mL·h）、 何福恒等 [2]水稻根际
固氮酶活性 819 nmol/（mL·h）、 玉米根际固氮酶活性
894 nmol/（mL·h）、 甘蔗根际固氮酶活性 934nmol/（mL·h）
高 ， 远高于田宏等 [ 4 ]的草坪草根际固氮酶活性
180.2 nmol/（mL·h）、 田颖等 [11]小麦根际固氮酶活性
100.77 nmol/（mL·h）， 这也许与固氮酶活性受植物种类、
土壤类型（有机质含量影响植物根系固氮酶活性）、
C/N 比、 温度、 湿度和氧气分压等多种因素影响
有关。
本研究从剑麻根际分离出较多优良固氮菌株，
具有较高的固氮酶活性， 具有作为生物氮肥的开发
潜力， 为制备生物菌肥奠定了良好的基础。 但是由
于试验条件和时间的限制， 一些重要的菌株生物学
特性和生理生化机理有待深入研究。 此外， 较高固
氮酶活性的菌株和较低固氮酶活性的菌株并不呈规
律性的出现， 在同一来源地和来源部位共存此两类
菌株， 菌株的固氮酶活性与什么因素直接相关尚待
进一步的研究。
参考文献
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陈河龙等： 剑麻根际联合固氮菌的分离及固氮活性测定
责任编辑： 凌青根
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60％
40％
20％
0％
菌
株
数
百
分
比
/％
＞1 000 ＜1001 000～100 0
固氮酶活性/[nmol/（mL·h）]
图 4 不同培养基培养菌株固氮酶活性比较
NFM 培养基
CCM 培养基
Ashby培养基
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