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小花吊兰染色体制片优化与核型分析



全 文 :·生物技术· 北方园艺2016(01):76~79
第一作者简介:李磊(1990-),男,硕士研究生,研究方向为药用植
物种质评价。E-mail:captain0305@163.com.
责任作者:严寒静(1972-),女,博士,副教授,现主要从事药用植物
种质评价等研究工作。E-mail:yanhanjing1211@163.com.
基金项目:广州市科技资助项目(2014KP000051)。
收稿日期:2015-08-19
DOI:10.11937/bfyy.201601020
小花吊兰染色体制片优化与核型分析
李   磊,沈 吉 焚,何 梦 玲,严 寒 静
(广东药学院 中药学院,广东 广州510006)
  摘 要:以小花吊兰根尖为试材,采用常规压片法制备染色体玻片标本,研究了取材时间、预
处理方法、解离方法以及染色时间对小花吊兰根尖细胞染色体制片效果的影响,优化制片技术并
进行核型分析,以期为小花吊兰建立更加稳定、明晰的品种鉴定方法。结果表明:于8:00取小花
吊兰根尖,0.05%秋水仙素预处理3h,卡诺氏液固定,1.0mol/L盐酸60℃下解离15min,改良卡
宝品红染色15min,所得小花吊兰染色体制片效果较好。对小花吊兰体细胞染色体数目进行统
计,核型分析表明,细胞染色体数为2n=2x=16,中部着丝粒染色体(m)为3对,近中部着丝粒染
色体(sm)为4对,近端部着丝粒染色体(st)1对,核型公式为2n=2x=16=6m+8sm+2st,核型属
2A型,核型不对称系数为64.39%。
关键词:小花吊兰;染色体;核型分析
中图分类号:S 681.9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2016)01-0076-04
  小花吊兰(Chlorophytum laxum R.Br)属百合科
(Liliaceae)吊兰属(Chlorophytum)植物,又名三角草、疏
花吊兰、土麦冬、山韭菜。广布于非洲和亚洲的热带、亚
热带地区,生于湿润肥沃的草地、庭园、山坡阴蔽处或岩
石边,我国分布于广东、海南、广西等地。小花吊兰为有
毒植物,具有清热解毒、消肿止痛的作用,能治疗毒蛇咬
伤,跌打肿痛[1],可用鲜品捣烂敷患处,是广东恩平、台
山、新会、中山常用地方药材[2]。
大部分吊兰属植物生长于非洲地区,而生长于亚洲
的,特别是印度地区的吊兰属植物被发现具有较大形态
学以及染色体特征的多样性[3]。吊兰属分类复杂、难于
鉴别,全球约有100余种吊兰属植物[4],因此除了从形
态、显微等方法鉴别,染色体核型分析技术作为一个鉴
别手段的补充,可以作为一个分类指标识别不同物种。
由于小花吊兰的野生资源量较少,且不易栽培,目前对
其研究较少,国内对其染色体数目、核型分析的研究尚
鲜见报道,国外学者SHIVA 等[5]已证实小花吊兰属于
二倍体植物,PATIL等[6]曾发现过较为罕见的小花吊兰
四倍体品种,因此需要建立更加稳定、明晰的鉴别方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
  供试材料采自中山市,分批移栽至广东药学院,经
田素英副教授鉴定为百合科吊兰属植物小花吊兰(C.
laxum)。
1.2 试验方法
于2015年4月13日07:30—09:30选取小花吊兰
根尖,每隔30min取材1次,用0.02%秋水仙素处理
3h,以确定合适的取材时间;以0.02%~0.10%秋水仙
素、0.002mol/L 8-羟基喹啉、冰水混合液分别处理一定
时间,择优确定预处理方法,预处理液及处理时间见表
1;取出经预处理的根尖,用蒸馏水漂洗2~3次,后转入
0.075mol/L KCl低渗液中,25℃处理30min,再漂洗2~
3次,投入卡诺固定液中室温固定18~24h,固定后取出
冲洗2~3次,放入0.1mol/L与1.0mol/L的盐酸中,
在60℃恒温水浴锅中解离10、15、20min,确定较优解离
方法;取出经解离的根尖,漂洗2~3次后转移至蒸馏水
中,室温下低渗处理10min,取根尖,只保留分生区,置
于清洁的载玻片上,滴加1~2滴20%改良卡宝品红溶
  表1 预处理液及处理时间
  Table 1 Reagent and time for pretreatments
预处理液种类及浓度
Diferent reagents and concentrations
预处理时间
Diferent pretreatment times/h
4℃0.02%、0.05%、0.10%秋水仙素 2、3
4℃0.002mol/L 8-羟基喹啉 2、3
冰水混合液 24
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北方园艺2016(01):76~79 ·生物技术·
液,染色10、15、20min,考察较宜的染色时间。
1.3 项目测定
常规法压片后,对分散较好的染色体装片于ZEISS
Axioplan 2显微镜及AxioVision 4.1图像分析系统下镜
检与拍照,并用MetaSystems软件系统进行核型分析和
染色体配对。
统计观察30个以上可准确计数染色体的根尖有丝
分裂中期细胞,其中85%以上的细胞具有恒定一致的染
色体数,即可认为是该植物的染色体数目。核型分析采
用李懋学等[7]提出的标准进行,核型取5个典型中期细
胞的平均值,测量染色体长臂和短臂,计算染色体相对
长度、相对长度指数、着丝粒指数、臂比值;染色体相对
长度指数(I.R.L)参考KUO等[8]提出的方法计算;根据
LEVAN等[9]的命名法则,来确定染色体的着丝点位置;
染色体核型分类按照STEBBINS[10]提出的方法来区分
核型对称或不对称程度。染色体相对长度(%)=染色
体长度/染色体组总长度×100;染色体相对长度指数
(I.R.L)=染色体长度/全组染色体平均长度;着丝粒指
数(%)=短臂/染色体长度×100;臂比(r)=长臂(L)/短
臂(S)。
2 结果与分析
2.1 制片优化
2.1.1 取材时间的确定 试验结果显示,08:00取材的
根尖分生区细胞染色体多数呈粗短条状,边缘清晰;过
早取材的染色体呈凌乱的毛线头状,边缘不清晰;过晚
取材的染色体散乱,边缘模糊。因此08:00的小花吊
兰细胞处于有丝分裂中期的比例较高,该时间点适于
取材。
2.1.2 预处理方法优化 该试验考察了不同预处理液、
浓度以及处理时间对染色体观察效果的影响,由表2可
见,0.05%或0.10%秋水仙素处理3h,显微镜视野中期
细胞多、染色体分散效果好、分辨程度清晰,同时考虑到
试验成本,最终确定0.05%秋水仙素处理3h为适宜
  表2 不同预处理方法的效果比较
  Table 2 Efect of diferent pretreatment methods
预处理液
Pretreatment
reagents
预处理时间
Pretreatment times
/h
中期细胞
Metaphase
cels
分散效果
Dispersion
efect
分辨程度
Distinguish
degrees
0.02%秋水仙素
2 少 团状 模糊
3 少 团状 模糊
0.05%秋水仙素
2 较多 较好 较清晰
3 多 好 清晰
0.10%秋水仙素
2 较多 较好 较清晰
3 多 好 清晰
8-羟基喹啉0.002mol/L
2 少 团状 模糊
3 少 团状 模糊
冰水混合物 24 少 团状 模糊
的预处理方法。
2.1.3 解离方法优化 考察了酸解时间和解离浓度对
染色体观察效果的影响,由表3可知,盐酸浓度过低或
解离时间过短会导致细胞分散不完全、染色体过于聚
集,盐酸浓度过高或解离时间过长会导致原生质体破
碎、染色体分散过度,因此1.0mol/L盐酸60℃下解离
15min制片效果较好。
表3 不同解离条件的效果比较
  Table 3 Efect diferent dissociation condition
解离时间
Times of dissociation
/min
解离浓度
Concentrations of dissociation
/(mol·L-1)
观察效果
Observation
efect
10
0.1 细胞未分散,染色体部分聚集
1.0 细胞未完全分散,染色体部分聚集
15
0.1 细胞未完全分散,染色体部分聚集
1.0 细胞较清晰,染色体分散良好
20
0.1 原生质体破碎严重,染色体分散过度
1.0 原生质体破碎严重,染色体分散过度
2.1.4 染色时间优化 染色剂选择为20%改良卡宝品
红溶液,同时考察染色时间为10、15、20min的观察效
果。结果表明,15min时染色体较清晰,对比度良好,适
宜观察;染色时间过短则细胞染色体颜色较浅,对比度
较弱,不宜观察;染色时间过长则细胞染色体颜色过深,
模糊成团状,也不宜观察,故选择染色时间为15min。
2.1.5 制片优化结论 最终确定08:00为较宜的取材
时间,将小花吊兰根尖以0.05%秋水仙素预处理3h,
0.075mol/L KCl溶液前低渗30min,卡诺氏液固定过
夜,1.0mol/L盐酸60℃下解离15min,蒸馏水后低渗
10min,改良卡宝品红染色15min,所得小花吊兰染色体
制片效果较好,显微镜视野内观察到染色体较分散、着
丝点较清晰的中期细胞(图1)。
图1 小花吊兰染色体形态
Fig.1 The chromosome morphology of C.laxum
2.2 核型分析
2.2.1 染色体数目 统计的细胞数目在30个以上,其
中85%以上的细胞具恒定一致的染色体数,由多个细
胞染色体统计得出小花吊兰的染色体数目为16条,即
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图2 小花吊兰核型图
Fig.2 Karyotype of chromosome in C.laxum
2n=2x=16。染色体核型图见图2。
2.2.2 染色体相对长度及核型分析 试验结果表明,小
花吊兰染色体数目为2n=2x=16,其中第2、3、8号为中
部着丝粒染色体(m),第1、5、6、7号为近中部着丝粒染
色体(sm),第4号为近端部着丝粒染色体(st);1~3号
为中长染色体(M2),4~7号为中短染色体(M1),第8号
为短染色体(S)。染色体核型分析参数见表4、图3。核
型公式为2n=2x=16=6m+8sm+2st,染色体相对长度
在9.41%~15.68%,平均相对长度为12.50%,染色体
长度比为1.67,臂比大于2:1染色体占37.5%,按照
STEBBINS[10]的核型分类标准,小花吊兰的核型属2A
型,核型不对称系数为64.39%。
表4 染色体核型分析参数
  Table 4 Karyotype parameters of chromosome in C.laxum
染色体编号
No.
相对长度
Relative length
(S+L=T)/%
相对长度系数
Relative length
index
着丝粒指数
Centromere
index/%
臂比
Arm
ratio
类型
Type
1  5.40+10.28=15.68  1.25  34.44  1.90 sm
2  6.45+7.84=14.29  1.14  45.12  1.22 m
3  5.40+8.01=13.41  1.07  40.26  1.48 m
4  2.54+10.00=12.54  1.00  20.28  3.93 st
5  4.18+8.01=12.19  0.98  34.29  1.92 sm
6  4.18+7.84=12.02  0.96  34.78  1.88 sm
7  3.10+7.35=10.45  0.84  29.67  2.37 sm
8  4.36+5.05=9.41  0.75  46.30  1.16 m
图3 小花吊兰染色体模式图
Fig.3 Karyotype pattern of chromosome in C.laxum
3 讨论
3.1 染色体制片优化的探究
关于制片取样的时间,可能与植物种类、外界环境、
取样部位等因素有关。不同植物的细胞分裂调控机制
存在差别,取材时间便有所不同,如蓝花丹(Plumbago
auriculata)初生根[11]在09:00—09:30取材进行制片观
察到的细胞中期分裂相较多,又如甜瓜(Cucumis melo
L.)嫩芽叶尖[12]的最佳取材时间为08:00左右;外界环
境包括光照、温度、空气、水分、土壤条件等,植物内在的
生理变化会受到外在环境的影响,并且在自身遗传物质
调控下有序地完成[13];取材部位可以选择根尖、茎尖、幼
叶、愈伤组织等,一般能进行细胞分裂的植物组织或单
个细胞都可以作为取材的对象[14],而不同部位的细胞分
裂规律有一定差异,应视具体情况而分析。为了保证细
胞处在分裂的旺盛时期,显微镜视野中能够观察到较多
分裂中期的状态,取材时间一般在08:00—11:00或
13:00—15:00进行[15],该试验选择08:00取材与小花吊
兰独特的生长节律性有关,具体内在机制有待更深入地
探究。
对材料预处理的目的在于使更多细胞处于分裂中
期的状态,从而便于染色体观察,常用的预处理方法有
使用秋水仙素、对二氯苯水溶液、8-羟基喹啉溶液及其混
用等化学方法,也有用冰水混合物处理的物理方法[16],
其中秋水仙素为较常用的预处理液,其作用机制主要是
阻碍纺锤体的形成与活动。不同植物所适宜的预处理
液种类及处理方法有所不同,应根据研究对象、考察目
的、试验成本和实际可操作度来选择合适的方法。如
李倩等[17]在进行2种观赏性吊兰(Chlorophytum como-
sum)核型分析时选择以0.10%秋水仙素处理3.5h,而
小花吊兰与其同为吊兰属(Chlorophytum),因此该试验
主要考察了秋水仙素的处理方法。
常用解离方法有酶解与酸解,通过解离,细胞之间
的果胶层被去除,细胞壁得到软化,从而便于压片,酶解
法一般用低浓度果胶酶(1%~2%)和纤维素酶(1%~
5%)混合液,酸解法一般在60℃下盐酸中解离,其中酸
解法较为经济便捷。百合科(Liliaceae)植物染色体一
般数量较少、形状较大,便于观察;李益锋等[18]在龙牙
百合(Lilium browni var.viridulum)核型分析中选择以
1.0mol/L盐酸于60℃恒温水浴中解离8~10min,小
花吊兰与其同属百合科;李国泰[19]在吊兰(Chlorophy-
tum comosum)核型分析中选择以1.0mol/L盐酸60℃恒
温下解离8min,小花吊兰与其同为吊兰属。因此该试
验选择了酸解法,并考察了解离的适宜条件。
3.2 进化程度的探讨
核型进化基本趋势一般由对称向不对称发展,核型
不对称系数越接近50%,核型的对称程度越高,进化程
度越低,不对称的核型多见于特化的、衍生的以及较进
化的植物类群中[20]。对广东中山所生小花吊兰进行的
核型分析显示,其不对称系数为64.39%,核型属2A型;
李国泰[19]对吊兰进行核型分析,测得不对称系数为
72.58%,核型属3B类;李倩等[17]对2种观赏吊兰进行
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核型分析,测得金边吊兰(Chlorophytum comosumcv.
variegatum)不对称系数为69.4%,核型属3A类,金心
吊兰(Chlorophytum comosumcv.medio-pictum)不对称
系数为68.1%,核型属3B类。由此推测,小花吊兰在吊
兰属中染色体对称性较大,是相对较为原始的物种。关
于其在吊兰属中进化程度、系统地位的问题,仍有待进
一步探讨,从而作出明确的界定。
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Optimization of Chromosome Mounting Technique and Karyotype
Analysis of Chlorophytum laxumR.Br
LI Lei,SHEN Jifen,HE Mengling,YAN Hanjing
(Colege of Traditional Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong 510006)
Abstract:Taking the root-tips of Chlorophytum laxumR.Br as test materials,using a conventional chromosome mounting
technique to prepare the slice specimens of chromosomes and its karyotype was analyzed.The efect of sampling time,
permanent,dissociation and staining time on cytological observation were analyzed.The results showed that the optimum
materials should be achieved at 08:00AM,pretreated with 0.05%colchicine for 3hours,fixing chromosomes in Kano’s
fluid,then dissociated in 1.0mol/L hydrochloric acid at a temperature of 60℃for 15minutes.Karyotype analysis of C.
laxumshowed that the chromosome number was 16and the karyotype formula was 2n=2x=16=6m+8sm+2st.3pairs
were metacentric(m),4pairs were submetacentric(sm),and 1pair were subtelocentric(st).The karyotype of C.laxum
was type 2Aand the karyotype asymmetry coeficient was 64.39%.
Keywords:Chlorophytum laxumR.Br;chromosome;karyotype analysis
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