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高羊茅雄性不育株花粉母细胞减数分裂染色体行为观察



全 文 :554-560
04/2012
草 业 科 学
PRATACULTURAL SCIENCE
29卷04期
Vol.29,No.04
高羊茅雄性不育株花粉母细胞
减数分裂染色体行为观察
付 薇,吴佳海,陈 伟,王小利,牟 琼
(贵州省草业研究所,贵州 贵阳550006)
摘要:采用卡宝品红染色制片法,对高羊茅(Festuca arundinacea)雄性不育植株花粉母细胞减数分裂过程及异常
行为进行观察,结果发现,高羊茅减数分裂进程与小花大小、花药长度、色泽有较为密切的关系。减数分裂周期具
有不同步性,同一制片中可观察到2~4个不同时期的分裂相,这种现象是高羊茅在进化过程中环境适应的一种
表现,有利于增强种群繁殖稳定性。本研究还发现,减数分裂过程中存在大量单价体、染色体桥、落后染色体、不
均等分离、微核、三分体等异常现象,初步分析确定这些小孢子异常分裂是导致高羊茅花粉败育的重要原因之一。
关键词:雄性不育植株;高羊茅;花粉母细胞;减数分裂
中图分类号:S544+.903.2;Q943   文献标识码:A   文章编号:1001-0629(2012)04-0554-07
  高羊茅(Festuca arundinacea)是禾本科羊茅属
的一种多年生草本植物,它可用作长期放牧草地的
优良牧草,经过选育后,高羊茅也是适应性很广的优
良草坪草种[1]。贵州省草业研究所经过多年的田间
寻找,于1998年6月在该所试验驻地发现了一株高
羊茅雄性不育植株,现处于鉴定初期[2]。目前,国内
雄性不育系的研究报道多见于作物品种[3-5],牧草
及草坪草雄性不育的研究利用相对较少。国外,法
国已把黑麦草(Lolium perenne)的雄性不育系用于
生产,加拿大选育出苜蓿(Medicago sativa)雄性不
育系20DRE。对三叶草(Trifolium repens)、苏丹
草(Sorghum sudanense)的雄性不育也有一些研
究[6],但高羊茅雄性不育系的发现及利用至今未见
报道。
目前,国内对高羊茅的研究主要集中在良种选
育[7]、引种适应性[8]、栽培技术[9-10]、愈伤组织培
养[11]、分子标记[12]等方面。有关高羊茅细胞学的研
究较少,仅见于蔡华等[13]、白宇辉和陈阳莉[14]对高
羊茅核型分析报道,而针对雄性不育植株的研究更
为鲜见。因此,本试验以贵州省草业研究所发现的
高羊茅雄性不育株(编号 A072003)为材料,采用卡
宝品红染色制片法,对花粉母细胞减数分裂过程及
异常行为进行较为细致的观察,以期揭示高羊茅不
育材料花粉母细胞减数分裂过程中染色体变化的行
为规律,寻找高羊茅花粉败育的细胞学依据,丰富高
羊茅的细胞遗传学内容,为高羊茅发育生物学及小
孢子败育等方面提供必要的细胞遗传学信息,为利
用高羊茅雄性不育株开展杂交育种工作,选育一批
适用于草坪及饲草兼水保功能的优良品种奠定理论
基础,也为高羊茅发育生物学和育种学提供必要的
细胞遗传学信息。
1 材料与方法
1.1材料 以贵州省草业研究所独山基地内种植
的高羊茅雄性不育植株(编号 A072003)为试材,选
取抽穗初期的高羊茅花序进行试验。
1.2方法 于2011年5月上旬,采用连续取材观
察的方法于早晨9:00至中午12:30,选取生长健康
的高羊茅幼穗,用卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰乙酸
体积比为3∶1)于室温下固定3h后,用95%的乙
醇清洗3次,转入70%乙醇中,4℃冰箱保存。采用
压片法制取减数分裂制片。用镊子夹取花药,将其
置于载玻片上,加1滴卡宝品红进行染色,然后用镊
子夹破(花粉囊),挤出花粉母细胞,并尽可能地将其
夹碎,去残渣,染色1~3 min后,加盖玻片并紧压,
* 收稿日期:2011-06-22  接受日期:2011-09-14
基金项目:贵州省基金“高羊茅雄性不育材料的鉴定及遗传机理研究”[黔科合J字(2007)2074号]
作者简介:付薇(1985-),女,四川广汉人,实习研究员,硕士,从事牧草栽培研究工作。E-mail:fuweiwei49@163.com
通信作者:吴佳海 E-mail:wujiahai2003@yahoo.com.cn
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使花粉母细胞进一步分散,用吸水纸吸去多余的染色
剂后于日本OLYMPUS公司BH-2型多功能光学显
微镜下镜检,放大倍数为40×10倍,并用Adobe Pho-
toshop 7.0对图片的亮度和对比度进行优化。
2 结果与分析
2.1花粉母细胞减数分裂与花蕾形态特征相
关性 高羊茅每朵小花具有3枚花药,通过取样观
察,发现A072003材料的花粉母细胞的发育程度与
小花大小、花药长度、花药颜色紧密相关,处于减数
分裂期的小花纵径为0.05~0.07cm,花药长度为
0.07~0.18cm,此间大小的小花能够观察到花粉发
育的各个时期(表1)。
2.2高羊茅花粉母细胞减数分裂染色体行为
观察 通过卡诺液固定、卡宝品红染色、压片及镜
检等操作,本试验观察到了部分高羊茅在减数分裂
过程中染色体的一系列行为变化特征。
表1 花粉母细胞减数分裂进程与花器官形态比较
Table 1 Morphological comparison between meiosis process and floral organ morphology
发育时期
Development stage
小花大小Floral size
横径
Transverse diameter/cm
纵径
Longitudinal diameter/cm
花药长度
Anther length/cm
花药颜色
Anther color
减数分裂之前
Before meiosis <
0.05 <0.50 <0.07 深绿色Dark green
减数分裂时期
Meiosis phase
0.05~0.10  0.50~0.70  0.07~0.18 浅绿色Reseda
减数分裂之后
After meiosis >
0.10 >0.70 >0.18
黄绿色或淡黄色
Yelowish green or light yelow
2.2.1第1次减数分裂 减数分裂的细线期,细胞
核内的染色体细长如线,核仁处于核膜附近,在这一
时期染色体相互缠绕,密集簇拥到核的一边(图
1A)。偶线期,细胞核内同源染色体联会,染色体开
始逐步的分散开,较之于细线期略微变短、增粗,但
颜色较浅,显微镜下无法辨认染色单体(图1B)。此
时,由于同源染色体的联会配对,染色体继续螺旋化
变短加粗,颜色加深,减数分裂进入粗线期 (图
1C)。双线期,染色体进一步螺旋化缩短变粗,配对
的同源染色体彼此排斥并开始分离,但不完全分开,
发生过交换的部位仍连在一起,形成交叉结,并能观
察棒状、环状和 V状二价体(图1D)。当减数分裂
进行至终变期,染色体超螺旋化,二价体缩至最短,
呈现出“纽扣状”形态,染色体向核周边移动,均匀分
散排列于细胞核内,核仁变小并逐步消失(图1E)。
中期Ⅰ时,核膜、核仁消失,纺锤体形成,染色体高度
凝缩,二价体整齐地聚集在赤道板上,行为特征主要
表现为“环形”和“重叠型”(图1F)。后期Ⅰ,二价体
中的2条同源染色体在纺锤丝的牵引下彼此分开并
向两极移动,此时父母本染色体得以重组 (图1G)。
末期Ⅰ染色体移到两极后松散变细,逐渐形成2个
子核,但细胞质不分裂(图1H)。
2.2.2第2次减数分裂 高羊茅花粉母细胞在第1
次减数分裂完毕之后,细胞核没有 DNA复制,染
色质在很短的时间内通过螺旋化缩短、变粗,进入
前期Ⅱ时期(图1I)。到了中期Ⅱ,染色体显著缩
短,每个染色体的着丝点排列在赤道板上面,纺锤
丝中部明显(图1J)。后期Ⅱ可观察到着丝粒一分
为二,位于赤道板上的姐妹染色单体在各自纺锤
丝的牵引下向细胞两极移动(图1K)。末期Ⅱ染
色体被拉向两极,纺锤丝消失,核膜、核仁出现,染
色体又变细长,形成4个圆形的新核(图1L)。此
时核周围形成细胞壁,4个子细胞紧密相连发育成
四分体小孢子(图1M)。四分体初期细胞质浓厚、
细胞壁不明显,以后体积慢慢变大,发育为成熟游
离花粉粒。
2.3高羊茅花粉母细胞减数分裂周期不同步
现象 高羊茅花粉母细胞减数分裂过程中,存在着
一定程度的非同步性分裂现象,主要表现在,高羊茅
同一花序的不同小花内、同一朵小花的不同花药内,
更甚是同一花药内都存在减数分裂时期不同步的现
象,制片中可同时观察到不同减数分裂时期并存的
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图1 高羊茅花粉母细胞减数分裂过程及分裂不同步性
Fig.1 Meiosis process and cycle asynchrony of tal fescue polen mother cels
注:A为细线期;B为偶线期;C为粗线期;D为双线期;E为终变期;F为中期Ⅰ;G为后期Ⅰ;H为末期Ⅰ;I为前期Ⅱ;J为中
期Ⅱ;K为后期Ⅱ;L为末期Ⅰ;M为四分体时期Ⅱ;N、O为同一制片中不同时期分裂相。
Note:A.Leptoten;B.Zygotene;C.Pachytene;D.Diplotene;E.Diakines;F.Metaphase I;G.Anaphase I;H.Telophase I;I.Pro-
phaseⅡ;J.MetaphaseⅡ;K.AnaphaseⅡ;L.TelophaseⅠ;M.Tetrad;N,O.The asynchronism of meiotic process,showing three
stages on each temporary preparation.
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现象(如:后期Ⅱ、末期Ⅱ、四分体时期并存,末期Ⅰ、
前期Ⅱ并存)(图1N、图1O)。因此,在高羊茅花粉
母细胞减数分裂的同一制片中可观察到大量2~4
个不同时期的分裂相。
2.4高羊茅花粉母细胞分裂异常行为 高羊
茅雄性不育材料的花粉母细胞减数分裂过程大量存
在单价体、染色体桥、落后染色体、微核、不同步分裂
等异常现象,减数分裂产物有三分体(图2A),中期
Ⅱ可观察到少量呈60°角的纺锤体(图2B)。
2.4.1单价体 在减数分裂的终变期,大量花粉母
细胞存在因没有同源染色体而不能联会的单价体,
这些单价体因不配对常呈棒状或弯曲成 V形而独
立于赤道板之外(图2C),有时其自身的两臂也会配
对发生交叉而成环状(图2D)。
2.4.2染色体桥和片段 在减数分裂中,正常的染
色体同倒位染色体之间发生交叉互换,会使配子染
色体上某一区段缺失或重复,两条同源染色体无法
直线配对,而是以一个圆圈完成同源部分的配对,这
个由两条同源染色体形成的圈被称作倒位环。一个
倒位杂合体如果着丝粒在倒位环的外面,则在减数
分裂后期会出现“染色体桥”(图2E)和“片段”(图
2F)的现象,即一条染色单体的两端都有一个着丝
粒,成为跨越两端的“桥”,同时伴随一个没有着丝粒
的断片。染色体桥在染色体移向两极进入子细胞时
被拉断,造成很大缺失,而染色体断片则不能进入子
细胞的核内,所以由此形成的配子往往是死亡的。
2.4.3落后染色体 花粉母细胞在分裂过程中受
到损伤,导致染色体不同步移动或者不移动形成
落后染色体,这一异常分裂现象在减数分裂中期
Ⅰ,后期Ⅰ,后期Ⅱ和末期Ⅱ都有发现(图2G、2H、
2I、2J),减数分裂过程单价体及落后染色体的存在
证明了高羊茅雄性不育株的基因组具有较强的杂
合性。
2.4.4不同步分裂 高羊茅不育材料中有少数花粉
母细胞由于纺锤丝异常,2个子细胞在分裂时不伴
随胞质同步分裂而成,如2个子细胞中,其中一个子
细胞的染色体正在纺锤丝牵引下向两极移动,而另
外一个子细胞的染色体已经全部聚集在两极(图
2K、图2L)。
2.4.5微核 微核主要是由染色体断片、落后染色
体引起的,发生断裂或滞后的染色体不能随纺锤丝
的牵引进入两极,或滞留于赤道板上,或随机分布在
主核之外,逐渐形成直径小于主核的圆形或椭圆形
微小核,一直到末期Ⅱ再形成微核,这类细胞形成的
配子部分不育。该异常现象在中期Ⅱ、前期Ⅰ、四分
体时期比较常见(图2M,2N,2O)。
3 讨论与结论
本试验中,高羊茅减数分裂进程与小花大小、花
药长度、颜色有密切关系,通过分析花器官形态特征
与减数分裂进程的相关性,并充分利用这种相关性
估测减数分裂进程可取得事半功倍的效果。本试验
发现,高羊茅不育株A072003处于减数分裂期时的
小花纵径为0.05~0.07cm,花药长度为0.07~
0.18cm,此间大小的小花能够观察到花粉发育的各
个时期。以花药长度、颜色作为减数分裂进程、花粉
粒成熟度的主要判断依据,比较简便、直观。不过,
由于高羊茅穗子发育与播种时间、土壤环境、气候条
件等密切相关,因此以小花、花药大小、色泽作为采
样依据,本研究只是一种探索总结,是否适用于其他
高羊茅不育材料还有待进一步证实。
试验中还发现,高羊茅花粉母细胞减数分裂过
程存在着一定程度的非同步性分裂现象,同一花序
的不同小花内、同一朵小花的不同花药内,更甚是同
一花药内都存在减数分裂时期不同步的现象。因
此,在高羊茅花粉母细胞减数分裂的同一制片中可
观察到2~4个不同时期的分裂,这一不同步现象在
辛培尧等[15]、张伟等[16]、张彩霞等[17]研究中都有报
道。王君等[18]在观察通辽杨 (Populus simonii
Carr×P.nigra L.‘Tongliao’)减数分裂染色体行
为过程中也曾指出,各个分裂相的不同步性可以起
到延长花期的作用,也有利于增加两性功能,对种群
繁殖后代有利,是植物适应当地环境条件的一种进
化表现。田如霞等[19]在研究锦鸡儿(Caragana mi-
crophylla)花粉母细胞染色体行为中也表明,减数
分裂的不同步现象反映出异花授粉植物的同步性比
自花授粉植物低的一般规律。
本研究发现了染色体桥、片段、落后染色体、微
核、不均分离等异常现象。其中落后染色体的频率
最高,在中期Ⅰ、后期Ⅱ、中期Ⅲ、后期Ⅳ4个时期
中均能发现,可能是由于某些染色体同源化程度不
高导致的。而往往花粉的育性与花粉母细胞减数分
裂过程紧密相关,高羊茅雄性不育材料花粉母细胞
减数分裂过程中出现了大量的染色体桥和片段,而
在分裂后期Ⅰ这些染色单体桥在倒位环内只有一次
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图2 高羊茅花粉母细胞减数分裂异常现象观察
Fig.2 Observation of abnormal meiosis of polen mother cels in tal fescue
注:A为60°角纺锤体;B为三分体;C为终变期 (→示棒状、V状单价体);D为终变期(→示环状单价体);E为中期Ⅰ(→示染
色体桥);F为中期Ⅰ(→示染色体片段);G~J为中期Ⅰ、后期Ⅰ、后期Ⅱ、末期Ⅱ(→示落后染色体);K~L为分裂不同步;
M~O为前期Ⅱ、中期Ⅱ、四分体(→示微核)。
Note:A.MetaphaseⅡwith 60degree spindles;B.Triad;C.Diakines(→shows Clavate and V univalent);D.Diakines(→shows
annular univalent);E.MetaphaseⅠ(→shows chromosome bridge);F.MetaphaseⅠ(→shows chromosome fragment);G~J.
MetaphaseⅠ,anaphaseⅠ,anaphaseⅡ,telophaseⅡ(→shows lagged chromosomes);K-L.Meiotic asynchrony;M-O.
ProphaseⅡ,metaphaseⅡ,tetrad(→shows micronucleus).
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交换,涉及2条染色单体产生的配子50%可育,当
别的染色体分向两极时,桥也拉长,一直到拉断形成
染色体断片为止。这一观察同何丽霞[20]在黄牡丹
(Paeonia lutea)花粉母细胞减数分裂过程当中及栗
茂腾和蔡和田[21]在披碱草减数分裂中所发现的现
象相似。潘泽惠等[21]在观察伞形科植物减数分裂
时认为,一些种类的染色体发生杂合性结构差异,致
使减数分裂时产生双着丝点染色体,在后期Ⅰ形成
染色体桥和断片。后期Ⅰ染色体桥是一种不稳定结
构,在以后的细胞分裂过程中将开始“断裂-融合一
桥”循环,致使这条染色体从细胞中丢失,结果导致
遗传物质的减少。此外,由于落后染色体和染色体
桥造成了染色体的不均匀分配,导致了减数分裂的
一些异常结果,形成有遗传组成不平衡的配子,产生
不同遗传组成的花粉粒。以上都是导致高羊茅花粉
败育的重要原因之一。本研究还在终变期发现了大
量的单价体,有棒状、V状、环状单价体,这种环状单
价体在小麦(Triticum aestivum)中已有报道,李万
隆和李振声[23]指出环状单价体的研究对染色体特
异性配对等基本理论问题有重要的意义。张正海
等[24]在小胡杨(Populus simonii×P.euphratica)
染色体行为观察中指出,小胡杨二分体和三分体的
形成是由于中期Ⅱ纺锤体的合并以及减数第2次分
裂的不同步所造成的,纺锤体行为影响着减数分裂
的胞质分裂,从而导致二分体、三分体等不同构型的
减数分裂产物出现。由此分析,本试验第2次减数
分裂过程中观察到的三分体,可能同中期Ⅱ中发现
的60°角纺锤体有关。三分体、二分体或包含微小
孢子的二分体释放出的小孢子可能将形成未减数分
裂花粉,导致败育。
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Meiosis and chromosome behavior of polen mother cels in
male-sterile plant of Festuca arundinacea
FU Wei,WU Jia-hai,CHEN Wei,WANG Xiao-li,MOU Qiong
(Guizhou Institute of Prataculture,Guiyang 550006,China)
Abstract:The meiosis process and abnormal behavior of polen mother cels(PMCs)in tal fescues(Festu-
ca arundinacea)were observed with carbol fuchsin staining.The results of this study showed that the mei-
osis process of tal fescues was closely correlated with the floret size,anther length and color.The meiotic
cycle asynchrony was founded and two to four different division phases were observed in the same slice pro-
duction,which was an evolutional behavior of adaptation of tal fescue to the condition,benefiting to
increased stability of population reproduction.Abnormal chromosome behaviors were observed in PMCs
from tal fescue,including a mass of univalent,chromosome bridges,laggard chromosomes,unequal
supranational chromosomes,micronucleus and triad,which was possible reasons resulted in abortive pol-
len of tal fescue.
Key words:male-sterile plant;tal fescue;polen mother cels;meiosis
Corresponding author:WU Jia-hai E-mail:wujiahai2003@y
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《草业科学》2012年征订启事
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单位的师生提供交流平台,同时为基层科技人员的成果交流创造机会。另外,本刊广告服务项目范围为
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