全 文 ：林业科学研究 2010, 23(1):1 ～ 5ForestResearch
文章编号:1001-1498(2010)01-0001-05
版纳龙竹 CONSTANS同源基因的克隆与序列分析＊
崔丽莉 1, 2 , 杨汉奇 2＊＊ , 杨宇明 1
(1.西南林学院保护生物学学院 ,云南昆明 650224;2.中国林业科学研究院资源昆虫研究所 ,云南昆明 650224)
摘要:以版纳龙竹基因组 DNA为模板 , 采用前人基于水稻 CO同源基因 Hd1序列的保守区所设计的特异引物
COS1和 COA1, 运用 PCR方法扩增出一条 1 520 bp的 DNA片段 , 并克隆到 pGEM-T载体 。测序和序列分析结
果显示:该片段含有 1个 590 bp的内含子 , 编码区 930 bp共编码 310个氨基酸;该基因被命名为 DxCO1, 其
DNA序列在 GenBank中的注册号为 GQ358925。在 GenBank中进行同源性检索的结果显示:其核苷酸序列与
其它禾本科植物 CO同源基因的氨基酸序列同源性高达 81% ～ 91%;推测的 DxCO1蛋白质序列与其它种子
植物 CO同源基因蛋白质序列的系统发育分析结果显示:DxCO1与小麦 Hd1-like等 5个基因聚成了一个强烈
支持的 分 支;另 外 , 在 该 片 段 推 测 的 蛋 白 质 序 列 的 氨 基 端 含 有 一 个 类 似 锌 指 蛋 白 的 B-box
(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)结构域 , 羧基端含有一个 CCT(CO, CO-like, TOC1)结构域 。序列和结构的高度同
源性表明:DxCO1是版纳龙竹的 1个 CO-like基因 , 可能对其开花调控有着重要作用 。
关键词:版纳龙竹;CONSTANS基因;克隆;序列分析
中图分类号:S722.3 文献标识码:A
收稿日期: 2009-09-02
基金项目:中国林业科学研究院资源昆虫研究所中央级科研单位基本科研业务费专项(Riri200702M),国家林业局 948项目(2008-4-
30),国家林业科技支撑项目(2006BAD19B0301),云南省科技厅联合支持国家科技项目(2007GA014)和云南竹藤科学创新团队项目
作者简介:崔丽莉(1985-),女 ,云南昆明人,硕士 ,从事植物保护生物学研究.
＊致谢:中国科学院西双版纳热带植物园田波博士和中国科学院昆明植物研究所杨俊波 、李洪涛博士在实验中给予了宝贵的建议 , 特此
致谢 !
＊＊通讯作者:yanghanqikm@yahoo.com.cn
CloningandSequenceAnalysisofCONSTANSHomologous
GenefromDendrocalamusxishuangbannaensis
CUILi-li1 , YANGHan-qi2 , YANGYu-ming1
(1.ColegeofBiologyConservation, SouthwestForestryUniversity, Kunming 650224, Yunnan, China;
2.ResearchInstituteofResourcesInsects, ChineseAcademyofForestry, Kunming 650224, Yunnan, China)
Abstract:CONSTANS(CO)isoneofthekeygenescontrolingfloweringtimeofthefloweringplantsinPhotoperiod
Pathways.Incurentstudy, twoprimers, COS1 andCOA1 , basedontheconservedregionofHd1sequencesfrom
CO-likegeneofrice(Oryzasativa), wereemployedtoamplifya1 520 bpfragmentbypolymerasechainreaction
(PCR)withgenomicDNAofDendrocalamusxishuangbannaensisD.Z.Li＆ H.Q.Yang.Thefragmentwas
clonedintoapGEM-Tvectorandthensequenced.Resultofthe1 520 bpfragmentclonedintoapGEM-Tvector
producedafragmentofgene, i.e.DxCO1, withaccessionnumberGQ358925 inGenBank.TheDNAsequence
analysisindicatedthatDxCO1 includedoneintronof590 bpandtwoexonsencodingputative310 aminoacids.
UsinghomologyanalysesofDNAsequence, DxCO1washomologoustotheothersixCO-likegenesfromGramineae
plantswith81%-91% supports, respectively.Phylogeneticanalysis, basedonproteinsequencesofDxCO1 and
theknownCO-likegenesofseedplantinGenBank, showedthatDxCO1 andotherfiveCO-likegenesfrom
林 业 科 学 研 究 第 23卷
Gramineaeplantsclusteredintoamonophylywithbootstrapvalueof92%.Meanwhile, therewasazinc-fingerB-
box(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)domainnearaminoterminusandaCCT(CO, CO-like, TOC1)domainnearcarboxy
terminusinputativeaminoacidsequenceofDxCO1.TheseresultssuggestedthatDxCO1belongedtoCO-likegene
family, anditmighthavethesamefunctionofcontrolingfloweringtimelikeotherCOhomologousgenes.
Keywords:Dendrocalamusxishuangbannaensis;CONSTANShomologousgene;cloning;sequenceanalysis
CONSTANS(CO)基因是植物光周期调控开花
途径中的关键基因之一 ,对拟南芥(Arabidopsisthali-
ana(L.)Heynh)、水稻(OryzasativaL.)等模式植
物开花时间调控机理的研究发现 ,它编码一类具有
2个 B-box锌指结构的转录因子 ,可以直接激活开花
整合因子 FT和 SOC1的表达 ,决定了植物能否感受
日照长度的变化 ,如在长日照条件下 , CO基因能够
促进拟南芥开花 ,但在短日照条件下 , CO基因对拟
南芥开花时间的促进作用不大 [ 1-5] 。由于植物 CO
基因在开花时间调控途径上的重要性 ,该类基因的
功能和作用机制一直是近年来植物学研究的热点之
一 [ 6-12] 。木本竹子(本文简称竹子)是植物界中开
花现象最奇特的类群之一。大多数竹子具有漫长的
开花周期 ,一般为 3 ～ 120 a,而且大部分呈群体开
花 、群体死亡的状况;到目前为止 ,竹子开花原因和
调控机理仍不清楚 [ 13-17] 。版纳龙竹(Dendrocalamus
xishuangbannaensisD.Z.Li＆H.Q.Yang)是最近
定名的一种牡竹属大型丛生竹 ,仅分布于云南省南
部 ,是一种用途广泛 、经济价值极高的优良材用竹
种 [ 18] 。近年来 ,在版纳龙竹的种苗培育过程中 ,得
到了大量开花植株和花器官材料 ,为研究竹子开花
的分子机理提供了良好的实验材料 。本文以版纳龙
竹的幼叶为试验材料 , 提取其基因组 DNA,用聚合
酶链式反应(PCR)扩增的方法进行了 CO同源基因
的分子克隆研究 ,期望能为从分子水平上认识竹子
开花的分子机理等研究积累资料。
1 材料与方法
1.1 材料
在云南景洪市南糯山采集版纳龙竹幼嫩叶 , 用
CTAB法 [ 19]提取并纯化基因组 DNA作为模板 。采
用已报道的基于水稻 CO同源基因 Hd1序列的保守
区所设计的 1对特异引物 COS1和 COA1[ 15] ,由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成 ,上游引物为
COS1:5′-GGCGCCGAGCGTGGTGTACT-3′, 下游引
物为 COA1:5′-GCCCTTGATCCGGGGTCGT-3′。载
体 pGEM-T购自 Promega公司 , PCR试剂购自宝生
物工程(大连)有限公司。
1.2 PCR扩增
采用 Touchdown(TD)—PCR扩增基因片段 。反
应体系(50 μL)为:ddH2O38 μL;10 ×LATaq
Bufer5 μL;dNTP4 μL;两端引物各 1μL;总 DNA
0.5 μL;LATaq0.5 μL。反应程序为:94 ℃预变
3 min;94 ℃变性 1min, 64℃退火 1min, 72℃延伸
1 min, 5个循环;余下程序为 94 ℃ 1 min, 62 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 5个循环;94 ℃ 1 min, 60 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 5个循环;94 ℃ 1 min, 58 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 5个循环;94 ℃ 1 min, 56 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 15个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃
保温。
1.3 目的片段的克隆
把 PCR扩增得到的目的片段纯化后 , 连接到
pGEM-T载体 , 4℃放置 5h,连接产物转化感受态细
胞(TIANGENDH5α),涂平板于含 Amp/X-gal/IPTG
的 LB固体培养基上 , 在培养箱中以 37 ℃培养 16 h
左右 , 挑取白色菌落 , 再采用 PCR法进行扩增 。反
应体系(20μL)为:ddH2O14μL, 10×LATaqBufer
2 μL, dNTP2μL,通用引物 T3和 T7各 0.5 μL, LA
Taq0.3μL, 1个白色菌落。反应程序为:97 ℃预变
1 min;94 ℃变性 40 s, 50 ℃退火 40 s, 70 ℃延伸
1 min, 30个循环后 , 70℃延伸 7min, 4 ℃保温。
1.4 目的片段的测序及分析
PCR扩增所得目的片段的纯化产物由上海生物
工程技术有限公司进行测序 。测定的序列用 DNA
Star生物软件比较 、翻译 , 用 Blast工具在 NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov)网站数据库中进行同源序
列的在线分析和比较。运用 GenScan进行基因结构
预测。利用 PHYLIP3.69[ 20]分析所得基因与 Gen-
Bank中已知种子植物 CO同源基因的系统发育
关系。
2 结果与分析
2.1 PCR产物的扩增和克隆
以版纳龙竹基因组 DNA为模板 ,通过上下游引
物进行了 PCR扩增 ,得到长度为 1 500bp左右的条
带(图 1A),经纯化后连接到 pGEM-T载体并转化到
2
第 1期 崔丽莉等:版纳龙竹 CONSTANS同源基因的克隆与序列分析
DH5α感受态细胞中 ,再次通过 PCR所得目的片段
(图 1B)纯化后送交上海生工进行正反向测序 ,经拼
接后获得长为 1 520bp的序列(图 2)。
A中 M为 Marker, I为扩增产物;
B中 M为Marker, I为阳性克隆
图 1 PCR扩增结果(A)和阳性克隆的 PCR鉴定(B)
2.2 基因序列与同源性分析
利用 GenBank/NCBI中的 Blast工具进行比较
分析 ,结果显示获得了 CO同源基因的 1个片段 ,该
片段全长 1 520bp,含 1个内含子 ,长度为 590bp,剪
切点位置符合 GT-AG规律;其外显子区共 930 bp,
推测编码 310 个氨基酸。本基因片段命名为
DxCO1, GenBank注册号为 GQ358925。用 Blast工具
在 GenBank数据库中进行禾本科代表植物的核苷酸
序列同源搜索 ,结果如表 1所示(草丝竹序列由中国
科学院西双版纳热带植物园田波博士惠赠)。从表
中可以看出:所克隆出片段与其他禾本科植物的 CO
同源基因核苷酸序列的同源性达到 81% ～ 91%。
同源性最高的为禾本科竹亚科高山竹子草丝竹
(Yushaniaandropogonoides(Hand.-Mazz.)Yi), 达
91%;最低为水稻 ,其同源性为 81%。另外 ,在预测
的氨基酸序列的第 39到第 75个氨基酸区间发现了
类似 于 动 物 蛋 白 B-box基 因 的 锌 指 结 构
(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)[ 21]以及羧基端的 CCT结
构域(第 273到第 310个氨基酸区间)[ 22-23] 。
核苷酸序列中的划线部分为引物序列 ,大写字母示编码区;氨基酸序列中的阴影部分示锌指结构和 CCT结构域
图 2 DxCO1核苷酸序列和预测的氨基酸序列
3
林 业 科 学 研 究 第 23卷
表 1 DxCO1与禾本科代表植物 CO同源基因核苷酸序列的同源性比较
基因 GenBank登记号 同源性 /% 植物种类
YaCO1 尚未登记 91 草丝竹(Yushaniaandropogonoides(Hand.-Mazz.)Yi)
TaHd1-2geneforHd1-likeprotein AB094488.1 87 小麦(TriticumaestivumL.)
COL1 DQ534011.2 84 黑麦草(LoliumperenneL.)
conz1 ZM118116 84 玉米(ZeamaysL.)
CONSTANS-likeprotein AF490470.1 83 大麦(HordeumvulgareL.)
Hd1geneforheadingdate1 AB433218.1 81 水稻(OryzasativaL.)
运用 PHYLIP3.69所得到的 DxCO1基因与已
知种子植物 CO同源基因氨基酸序列的系统发育树
如图 3所示。 DxCO1与 5种禾本科植物的 CO-like
基因聚在分支 A上 , 并得到了 92%的靴带分析
(Bootstrap)支持率 ,其中 , DxCO1与小麦的 Hd1-like
蛋白(GI:36789817)的关系最近 ,并得到了强烈的支
持(98%)。小麦的 Hd1-like蛋白在短日照条件下对
其开花时间有促进作用 [ 8] 。
图 3 推测的 DxCO1蛋白质序列与GenBank中种子植物 CO-like基因蛋白质序列的系统发育关系分析
物种缩写后面的数字为其蛋白质序列在 GenBank中的编号(GI),分支上方数值代表大于 75%的靴带值。 Pp:海岸松(PinuspinasterAi-
ton);Gm:大豆(Glycinemax(L.)Mer.);Ps:豌豆(PisumsativumL.);Pa:挪威云杉(Piceaabies(L.)H.Karst.);Cc:中国辣椒(Capsicum
chinenseJacq.);Zm:玉米;OsJG:水稻;Fp:草甸羊茅(FestucapratensisHuds.);Lp:黑麦草;Dx:版纳龙竹;Ta:小麦;Mv:维吉尼亚玉兰;Pd:美
洲黑杨(PopulusdeltoidsMarsh);In:大叶牵牛(Ipomoeanil(L.)Roth);Cr:红叶藜(ChenopodiumrubrumL.);Le:番茄(Lycopersiconesculentum
Mil.);Sta:马铃薯(Solanumtuberosumsubsp.andigenaL.);At:拟南芥;Bn:油菜(BrasicanapusL.);Sa:白芥(SinapisalbaL.);Hvv:大麦;
Rs:萝卜(RaphanussativusL.);Mi:芒果(MangiferaindicaL.)。
3 讨论
从营养生长转变到生殖生长(成花转变)是植
物生长发育中一个非常重要的事件 ,受复杂的基因
调控网络所控制 。 CO基因是植物光周期促进开花
途径中一个重要的成花转变调控基因 ,它是连接生
理钟和花分生组织决定基因的桥梁[ 7] 。目前 ,国内
外对多个物种中的 CO同源基因进行克隆 ,研究表
4
第 1期 崔丽莉等:版纳龙竹 CONSTANS同源基因的克隆与序列分析
明:这些物种中的 CO同源基因具有保守的 B-box型
锌指结构与核定位区域(CCT结构域),具有调控植
物开花时间的功能 ,但是不同植物中的 CO同源基
因作用机理存在一定差异 [ 5, 8, 23-24] 。长期以来 ,对竹
子奇特的开花习性的研究多集中于形态学观测和生
理学实验手段[ 13-14, 16] ,而以分子生物学技术手段从
基因表达和调控水平研究竹子成花分子机理还少见
报道[ 15, 17] 。截止目前为止 ,竹子 CO同源基因的分
离和克隆仅见于温带高山竹子草丝竹 [ 15] 。本研究
首次从热带大型丛生竹版纳龙竹基因组 DNA中分
离出一个 CO同源基因的片段 DxCO1,核苷酸序列
和氨基酸序列分析显示:它与其它种子植物(特别是
禾本科植物)的 CO同源基因有很高的同源性 ,并在
预测的氨基酸序列中存在相同的 B-box型锌指结构
与 CCT结构域 ,这种序列和结构上的相似性有理由
推测 DxCO1确实是版纳龙竹中的一个 CO-like基
因 ,对其开花调控有着重要作用。本文的结果对于
深入探索竹子成花机理 ,揭示植物开花机制多样性
具有重要的意义 ,同时也为下一步版纳龙竹 CO同
源基因全长序列克隆以及功能研究打下了良好的
基础。
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