全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 1) : 1 5
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 01-0001-05
版纳龙竹 CONSTANS 同源基因的克隆与序列分析 *
崔丽莉1 , 2, 杨汉奇2* * , 杨宇明1
( 1. 西南林学院保护生物学学院 , 云南 昆明 650224; 2. 中国林业科学研究院资源昆虫研究所 , 云南 昆明 650224)
摘要: 以版纳龙竹基因组 DNA 为模板, 采用前人基于水稻 CO 同源基因 Hd1 序列的保守区所设计的特异引物
COS1 和 COA1, 运用 PCR 方法扩增出一条 1 520 bp 的 DNA 片段, 并克隆到 pGEM-T 载体。测序和序列分析结
果显示: 该片段含有 1 个 590 bp 的内含子 , 编码区 930 bp 共编码 310 个氨基酸 ; 该基因被命名为 DxCO1, 其
DNA 序列在 GenBank 中的注册号为 GQ358925。在 GenBank 中进行同源性检索的结果显示 : 其核苷酸序列与
其它禾本科植物 CO 同源基因的氨基酸序列同源性高达 81% ～ 91% ; 推测的 DxCO1 蛋白质序列与其它种子
植物 CO 同源基因蛋白质序列的系统发育分析结果显示 : DxCO1 与小麦 Hd1-like 等 5 个基因聚成了一个强烈
支持 的 分 支 ; 另 外, 在 该 片 段 推 测 的 蛋 白 质 序 列 的 氨 基 端 含 有 一 个 类 似 锌 指 蛋 白 的 B-box
( Cx2 Cx8Cx7 Cx2 Cx4Hx8 H) 结构域 , 羧基端含有一个 CCT( CO, CO-like, TOC1) 结构域。序列和结构的高度同
源性表明 : DxCO1 是版纳龙竹的 1 个 CO-like 基因, 可能对其开花调控有着重要作用。
关键词: 版纳龙竹; CONSTANS基因; 克隆; 序列分析
中图分类号: S722.3 文献标识码: A
收稿日期 : 2009-09-02
基金项目 : 中国林业科学研究院资源昆虫研究所中央级科研单位基本科研业务费专项 ( Riri200702M) , 国家林业局 948 项目 ( 2008 -4-
30) , 国家林业科技支撑项目 ( 2006 BAD19B0301) , 云南省科技厅联合支持国家科技项目 ( 2007 GA014) 和云南竹藤科学创新团队项目
作者简介 : 崔丽莉 ( 1985-) , 女 , 云南昆明人 , 硕士 , 从事植物保护生物学研究 .
* 致谢 : 中国科学院西双版纳热带植物园田波博士和中国科学院昆明植物研究所杨俊波、李洪涛博士在实验中给予了宝贵的建议 , 特此
致谢 !
* * 通讯作者 : yanghanqikm@ yahoo. com. cn
Cloning and Sequence Analysis of CONSTANS Homologous
Gene from Dendrocalamus xishuangbannaensis
CUI Li-li1, YANG Han-qi2, YANG Yu-ming1
( 1. College of Biology Conservation, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China;
2. Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, Yunnan, China)
Abstract: CONSTANS ( CO) is one of the key genes controlling flowering time of the flowering plants in Photoperiod
Pathways. In current study, two primers, COS1 and COA1, based on the conserved region of Hd1 sequences from
CO-like gene of rice ( Oryza sativa) , were employed to amplify a 1 520 bp fragment by polymerase chain reaction
( PCR) with genomic DNA of Dendrocalamus xishuangbannaensis D. Z. Li & H. Q. Yang. The fragment was
cloned into a pGEM-T vector and then sequenced. Result of the 1 520 bp fragment cloned into a pGEM-T vector
produced a fragment of gene, i. e. DxCO1, with accession number GQ358925 in GenBank. The DNA sequence
analysis indicated that DxCO1 included one intron of 590 bp and two exons encoding putative 310 amino acids.
Using homology analyses of DNA sequence, DxCO1 was homologous to the other six CO-like genes from Gramineae
plants with 81% - 91% supports, respectively. Phylogenetic analysis, based on protein sequences of DxCO1 and
the known CO-like genes of seed plant in GenBank, showed that DxCO1 and other five CO-like genes from
～
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
Gramineae plants clustered into a monophyly with bootstrap value of 92% . Meanwhile, there was a zinc-finger B-
box ( Cx2Cx8 Cx7 Cx2Cx4 Hx8 H) domain near amino terminus and a CCT ( CO, CO-like, TOC1) domain near carboxy
terminus in putative amino acid sequence of DxCO1. These results suggested that DxCO1 belonged to CO-like gene
family, and it might have the same function of controlling flowering time like other CO homologous genes.
Key words: Dendrocalamus xishuangbannaensis; CONSTANS homologous gene; cloning; sequence analysis
CONSTANS ( CO) 基因是植物光周期调控开花
途径中的关键基因之一, 对拟南芥( Arabidopsis thali-
ana ( L. ) Heynh) 、水稻 ( Oryza sativa L. ) 等模式植
物开花时间调控机理的研究发现, 它编码一类具有
2 个 B-box锌指结构的转录因子, 可以直接激活开花
整合因子 FT 和 SOC1 的表达, 决定了植物能否感受
日照长度的变化, 如在长日照条件下, CO 基因能够
促进拟南芥开花, 但在短日照条件下, CO 基因对拟
南芥开花时间的促进作用不大 [ 1 - 5 ] 。由于植物 CO
基因在开花时间调控途径上的重要性, 该类基因的
功能和作用机制一直是近年来植物学研究的热点之
一 [ 6 - 12 ] 。木本竹子 ( 本文简称竹子) 是植物界中开
花现象最奇特的类群之一。大多数竹子具有漫长的
开花周期, 一般为 3 ～ 120 a, 而且大部分呈群体开
花、群体死亡的状况; 到目前为止, 竹子开花原因和
调控机理仍不清楚 [ 13 - 17 ] 。版纳龙竹( Dendrocalamus
xishuangbannaensis D. Z. Li & H. Q. Yang) 是最近
定名的一种牡竹属大型丛生竹, 仅分布于云南省南
部, 是一种用途广泛、经济价值极高的优良材用竹
种 [ 18] 。近年来, 在版纳龙竹的种苗培育过程中, 得
到了大量开花植株和花器官材料, 为研究竹子开花
的分子机理提供了良好的实验材料。本文以版纳龙
竹的幼叶为试验材料, 提取其基因组 DNA, 用聚合
酶链式反应( PCR) 扩增的方法进行了 CO 同源基因
的分子克隆研究, 期望能为从分子水平上认识竹子
开花的分子机理等研究积累资料。
1 材料与方法
1. 1 材料
在云南景洪市南糯山采集版纳龙竹幼嫩叶, 用
CTAB 法 [ 19] 提取并纯化基因组 DNA 作为模板。采
用已报道的基于水稻 CO 同源基因 Hd1 序列的保守
区所设计的 1 对特异引物 COS1 和 COA1[ 15] , 由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成, 上游引物为
COS1: 5′-GGCGCCGAGCGTGGTGTACT-3′, 下 游 引
物为 COA1: 5′-GCCCTTGATCCGGGGTCGT-3′。载
体 pGEM-T 购自 Promega 公司, PCR 试剂购自宝生
物工程( 大连) 有限公司。
1.2 PCR 扩增
采用 Touchdown( TD) —PCR 扩增基因片段。反
应体系 ( 50 μL) 为: ddH2 O 38 μL; 10 × LA Taq
Buffer 5 μL; dNTP 4 μL; 两端引物各 1 μL; 总 DNA
0. 5 μL; LA Taq 0. 5 μL。反应程序为: 94 ℃预变
3 min; 94 ℃变性 1 min, 64 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸
1 min, 5 个循环; 余下程序为 94 ℃ 1 min, 62 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 5 个循环; 94 ℃ 1 min, 60 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 5 个循环; 94 ℃ 1 min, 58 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 5 个循环; 94 ℃ 1 min, 56 ℃
1 min, 72 ℃ 1 min, 15 个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃
保温。
1.3 目的片段的克隆
把 PCR 扩增得到的目的片段纯化后, 连接到
pGEM-T载体, 4 ℃放置 5 h, 连接产物转化感受态细
胞( TIANGEN DH5α) , 涂平板于含 Amp/ X-gal / IPTG
的 LB 固体培养基上, 在培养箱中以 37 ℃培养 16 h
左右, 挑取白色菌落, 再采用 PCR 法进行扩增。反
应体系( 20 μL) 为: ddH2O 14 μL, 10 ×LA Taq Buffer
2 μL, dNTP 2 μL, 通用引物 T3 和 T7 各 0. 5 μL, LA
Taq 0. 3 μL, 1 个白色菌落。反应程序为: 97 ℃预变
1 min; 94 ℃变性 40 s, 50 ℃退火 40 s, 70 ℃延伸
1 min, 30 个循环后, 70 ℃延伸 7 min, 4 ℃保温。
1.4 目的片段的测序及分析
PCR 扩增所得目的片段的纯化产物由上海生物
工程技术有限公司进行测序。测定的序列用 DNA
Star 生物 软件 比较、翻译, 用 Blast 工 具在 NCBI
( www. ncbi. nlm. nih. gov) 网站数据库中进行同源序
列的在线分析和比较。运用 GenScan 进行基因结构
预测。利用 PHYLIP 3. 69[ 20 ] 分析所得基因与 Gen-
Bank 中已知种子植物 CO 同源基因的系统发育
关系。
2 结果与分析
2.1 PCR 产物的扩增和克隆
以版纳龙竹基因组 DNA 为模板, 通过上下游引
物进行了 PCR 扩增, 得到长度为 1 500 bp 左右的条
带( 图 1A) , 经纯化后连接到 pGEM-T 载体并转化到
2
第 1 期 崔丽莉等: 版纳龙竹 CONSTANS同源基因的克隆与序列分析
DH5α感受态细胞中, 再次通过 PCR 所得目的片段
( 图 1B) 纯化后送交上海生工进行正反向测序, 经拼
接后获得长为 1 520 bp 的序列( 图 2) 。
A 中 M为 Marker, I为扩增产物 ;
B 中 M 为 Marker, I 为阳性克隆
图 1 PCR 扩增结果 ( A) 和阳性克隆的 PCR 鉴定 ( B)
2.2 基因序列与同源性分析
利用 GenBank/NCBI 中的 Blast 工具进行比较
分析, 结果显示获得了 CO 同源基因的 1 个片段, 该
片段全长 1 520 bp, 含 1 个内含子, 长度为 590 bp, 剪
切点位置符合 GT-AG 规律; 其外显子区共 930 bp,
推测 编 码 310 个 氨 基 酸。本 基 因 片 段 命 名 为
DxCO1, GenBank 注册号为 GQ358925。用 Blast工具
在 GenBank 数据库中进行禾本科代表植物的核苷酸
序列同源搜索, 结果如表 1 所示( 草丝竹序列由中国
科学院西双版纳热带植物园田波博士惠赠) 。从表
中可以看出: 所克隆出片段与其他禾本科植物的 CO
同源基因核苷酸序列的同源性达到 81% ～ 91% 。
同源性最高的为禾本科竹亚科高山竹子草丝竹
( Yushania andropogonoides ( Hand. -Mazz. ) Yi) , 达
91% ; 最低为水稻, 其同源性为 81% 。另外, 在预测
的氨基酸序列的第 39 到第 75 个氨基酸区间发现了
类 似 于 动 物 蛋 白 B-box 基 因 的 锌 指 结 构
( Cx2 Cx8 Cx7 Cx2 Cx4 Hx8 H)
[ 21 ] 以及羧基端的 CCT 结
构域( 第 273 到第 310 个氨基酸区间) [ 22 - 23 ] 。
核苷酸序列中的划线部分为引物序列 , 大写字母示编码区 ; 氨基酸序列中的阴影部分示锌指结构和 CCT 结构域
图 2 DxCO1 核苷酸序列和预测的氨基酸序列
3
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
表 1 DxCO1与禾本科代表植物 CO 同源基因核苷酸序列的同源性比较
基因 GenBank 登记号 同源性 /% 植物种类
YaCO1 尚未登记 91 草丝竹 ( Yushania andropogonoides ( Hand. -Mazz. ) Yi)
TaHd1-2 gene for Hd1-like protein AB094488. 1 87 小麦 ( Triticum aestivum L. )
COL1 DQ534011. 2 84 黑麦草 ( Lolium perenne L. )
conz1 ZM118116 84 玉米 ( Zea mays L. )
CONSTANS-like protein AF490470. 1 83 大麦 ( Hordeum vulgare L. )
Hd1 gene for heading date 1 AB433218. 1 81 水稻 ( Oryza sativa L. )
运用 PHYLIP 3. 69 所得到的 DxCO1 基因与已
知种子植物 CO 同源基因氨基酸序列的系统发育树
如图 3 所示。DxCO1 与 5 种禾本科植物的 CO-like
基因聚在分支 A 上, 并得到了 92% 的靴带分析
( Bootstrap) 支持率, 其中, DxCO1 与小麦的 Hd1-like
蛋白( GI: 36789817) 的关系最近, 并得到了强烈的支
持( 98% ) 。小麦的 Hd1-like 蛋白在短日照条件下对
其开花时间有促进作用 [ 8 ] 。
图 3 推测的 DxCO1 蛋白质序列与 GenBank 中种子植物 CO-like 基因蛋白质序列的系统发育关系分析
物种缩写后面的数字为其蛋白质序列在 GenBank 中的编号 ( GI) , 分支上方数值代表大于 75 % 的靴带值。Pp: 海岸松 ( Pinus pinaster Ai-
ton) ; Gm: 大豆 ( Glycine max ( L. ) Merr. ) ; Ps: 豌豆 ( Pisum sativum L. ) ; Pa: 挪威云杉 ( Picea abies ( L. ) H. Karst. ) ; Cc: 中国辣椒 ( Capsicum
chinense Jacq. ) ; Zm: 玉米 ; OsJG: 水稻 ; Fp: 草甸羊茅 ( Festuca pratensis Huds. ) ; Lp: 黑麦草 ; Dx: 版纳龙竹 ; Ta: 小麦 ; Mv: 维吉尼亚玉兰 ; Pd: 美
洲黑杨 ( Populus deltoids Marsh) ; In: 大叶牵牛 ( Ipomoea nil ( L. ) Roth) ; Cr: 红叶藜 ( Chenopodium rubrum L. ) ; Le: 番茄 ( Lycopersicon esculentum
Mill. ) ; Sta: 马铃薯 ( Solanum tuberosum subsp. andigena L. ) ; At: 拟南芥 ; Bn: 油菜 ( Brassica napus L. ) ; Sa: 白芥 ( Sinapis alba L. ) ; Hvv: 大麦 ;
Rs: 萝卜 ( Raphanus sativus L. ) ; Mi: 芒果 ( Mangifera indica L. ) 。
3 讨论
从营养生长转变到生殖生长 ( 成花转变) 是植
物生长发育中一个非常重要的事件, 受复杂的基因
调控网络所控制。CO 基因是植物光周期促进开花
途径中一个重要的成花转变调控基因, 它是连接生
理钟和花分生组织决定基因的桥梁 [ 7 ] 。目前, 国内
外对多个物种中的 CO 同源基因进行克隆, 研究表
4
第 1 期 崔丽莉等: 版纳龙竹 CONSTANS同源基因的克隆与序列分析
明: 这些物种中的 CO 同源基因具有保守的 B-box型
锌指结构与核定位区域( CCT 结构域) , 具有调控植
物开花时间的功能, 但是不同植物中的 CO 同源基
因作用机理存在一定差异 [ 5, 8 , 2 3 - 2 4] 。长期以来, 对竹
子奇特的开花习性的研究多集中于形态学观测和生
理学实验手段 [ 13 - 1 4, 16 ] , 而以分子生物学技术手段从
基因表达和调控水平研究竹子成花分子机理还少见
报道 [ 15, 17 ] 。截止目前为止, 竹子 CO 同源基因的分
离和克隆仅见于温带高山竹子草丝竹 [ 15 ] 。本研究
首次从热带大型丛生竹版纳龙竹基因组 DNA 中分
离出一个 CO 同源基因的片段 DxCO1, 核苷酸序列
和氨基酸序列分析显示: 它与其它种子植物( 特别是
禾本科植物) 的 CO 同源基因有很高的同源性, 并在
预测的氨基酸序列中存在相同的 B-box 型锌指结构
与 CCT 结构域, 这种序列和结构上的相似性有理由
推测 DxCO1 确实是版纳龙竹中的一个 CO-like 基
因, 对其开花调控有着重要作用。本文的结果对于
深入探索竹子成花机理, 揭示植物开花机制多样性
具有重要的意义, 同时也为下一步版纳龙竹 CO 同
源基因全长序列克隆以及功能研究打下了良好的
基础。
参考文献:
[ 1] impson G G, Dean C. Arabidopsis, the rosetta stone of flowering
time [ J] . Science, 2002, 296: 285 - 289
[ 2] Mouradov A C F, Coupland G. Control of flowering time: interacting
pathways as a basis for diversity [ J] . Plant Cell, 2002, Suppl:
111 - 130
[ 3] Datta S, Hettiarachchi G H C M, Deng X W, et al. Arabidopsis
CONSTANS-LIKE3 is a positive regulator of red light signaling and
root growth [ J] . Plant Cell, 2006, 18 ( 1) , 70 - 84
[ 4] Miller T A, Muslin E H, Dorweiler J E. A maize CONSTANS-like
gene, conz1, exhibits distinct diurnal expression patterns in varied
photoperiods [ J] . Planta, 2008 , 227 ( 6) : 1377 - 1388
[ 5] Takahashi Y, Teshima K M, Yokoi S, et al. Variations in Hd1 pro-
teins, Hd3a promoters, and Ehd1 expression levels contribute to di-
versity of flowering time in cultivated rice [ J] . Proc Nation Acad
Sci, 2009 , 106 ( 11) : 4555 - 4560
[ 6] Putterill J, Robson F, Lee K, et al. The CONSTANS gene of Arabi-
dopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities
to zinc finger transcription factors [ J] . Cell, 1995 , 80 ( 6) : 847 -
857
[ 7] Suarez-Lopez P, Wheatley K, Robson F, et al. CONSTANS medi-
ates between the circadian clock and the control of flowering in Ara-
bidopsis[ J] . Nature, 2001 , 410 : 1116 - 1120
[ 8] Nemoto Y, Kisaka M, Fuse T, et al. Characterization and functional
analysis of three wheat genes with homology to the CONSTANS flow-
ering time gene in transgenic rice [ J] . Plant J, 2003, 36 ( 1 ) :
82 - 93
[ 9 ] Holefors A, OPseth L, Rosnes A K R, et al. Identification of
PaCOL1 and PaCO2, two CONSTANS-like genes showing decreased
transcript levels preceding short day induced growth cessation in Nor-
way spruce [ J] . Plant Physiol Biochem, 2009, 47 ( 2 ) : 105 - 115
[ 10] lmada R, Cabrera N, Casaretto J A, et al. VvCO and VvCOL1 ,
two CONSTANS homologous genes, are regulated during flower in-
duction and dormancy in grapevine buds [ J] . Plant Cell Rep,
2009, 28 ( 8 ) : 1193 - 1203
[ 11] Hassidim M, Harir Y, Yakir E, et al. Over-expression of CON-
STANS-LIKE5 can induce flowering in short-day grown Arabidopsis
[ J] . Planta, 2009, 230 ( 3) : 481 - 491
[ 12] Kim S Y, Yu X H, Michaels S D. Regulation of CONSTANS and
FLOWERING LOCUS T expression in response to changing light
quality [ J] . Plant Physiology, 2008, 148 ( 1) : 269 - 279
[ 13] 辉朝茂 , 杨宇明 , 杜 凡 , 等 . 云南竹亚科珍稀种质资源及其
开花结实研究 [ J] . 世界竹藤通讯 , 2007 , 5 ( 2) : 15 - 20
[ 14] 杜 凡 , 薛嘉榕 , 杨宇明 , 等 . 15 年来云南竹子的开花现象及其
类型的研究 [ J] . 林业科学 , 2000 , 36( 6 ) : 57 - 68
[ 15] 田 波 . 竹类植物开花时间相关基因的克隆与功能分析 [ D] .
昆明 : 中国科学院昆明植物研究所 , 2005
[ 16] 王 泾 . 云南竹类开花规律研究及人工促进竹子 开花的试验
[ D] . 昆明 : 西南林学院资源学院 , 2005
[ 17] 田 波 , 陈永燕 , 严远鑫 , 等 . 一个竹类植物 MADS 区基因的
克隆及其在拟 南芥中 的表达 [ J] . 科 学通 报 , 2005, 50 ( 2 ) :
145 - 151
[ 18] Mao W, Yang H Q, Li D Z. Dendrocalamus xishuangbannaensis
( Poaceae: Bambusoideae) , a new species from Yunnan, China
[ J] . Ann Bot Fennici, 2009 , 46 ( 6) : 574 - 576
[ 19] Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf material [ J] . Phytochem Bull, 1987, 19
( 1) : 11 - 15
[ 20 ] Felsenstein, J. PHYLIP-Phylogeny Inference Package [ J] . Cladis-
tics, 1989, 5 ( 2) : 164 - 166
[ 21] Torok M, Elkin L D. Two B or not two B? Overview of the rapidly
expanding B-box family of proteins [ J] . Differentiation, 2000, 67
( 1) : 63 - 71
[ 22] Strayer C, Oyama T, Schultz T F, et al. Cloning of the Arabidopsis
clock gene TOC1, an autoregulatory response regulator homolog
[ J] . Science, 2000, 289: 768 - 771
[ 23] Robson F, Costa M, Hepworth S R, et al. Functional importance of
conserved domains in the flowering-time gene CONSTANS demon-
strated by analysis of mutant alleles and transgenic plants [ J] .
Plant J, 2001 , 28 ( 6) : 619 - 631
[ 24] Komeda Y. Genetic regulation of time to flower in Arabidopsis thali-
ana [ J] . Annu Rev Plant Biol, 2004, 55 : 521 - 535
5