全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（7）：1409–1417 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–12–23；修回日期：2014–06–13
基金项目：中国农业科学院院所基金项目（2060302-2-12）；国家‘863’计划项目（2011AA10020703）；国家公益性行业（农业）科研
专项（201203071）；中国农业科学院科技创新工程项目（2013-2014）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhxiuxin@163.com）
牡丹开花调控转录因子基因 PsCOL4 的克隆、表
达与系统进化分析
王顺利，薛璟祺，朱富勇，张 萍，任秀霞，刘传娇，张秀新*
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：采用 RT-PCR 方法从‘紫罗兰’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）花芽中克隆得到 1
个重要开花调控转录因子基因 CONSTANS-like，其 cDNA 全长 1 125 bp，编码 373 个氨基酸。序列比对和
结构域分析表明，此蛋白包含两个 B-box 型锌指结构和 1 个 CCT 结构域，与拟南芥的 AtCOL4 最为相似，
将其命名为 PsCOL4，GenBank 登录号为 KF113358。系统进化树分析表明，PsCOL4 与葡萄编码的 VvCOL4
的亲缘关系最近，属于第 1 群组 CO 类似基因。实时定量 PCR 表明，PsCOL4 在不同组织器官中均有表
达，其中茎和叶中的表达量最高，根中最低。在花芽不同发育时期，PsCOL4 的表达呈现递减趋势。不同
光周期条件下，PsCOL4 的表达稍有不同，短日照条件下在叶中的表达有所增加，茎中稍有减少。
关键词：牡丹；光周期途径；CONSTANS 基因；PsCOL4；实时定量 PCR
中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1409-09

Molecular Cloning，Expression and Evolutionary Analysis of the Flowering-
regulating Transcription Factor Gene PsCOL4 in Tree Peony
WANG Shun-li，XUE Jing-qi，ZHU Fu-yong，ZHANG Ping，REN Xiu-xia，Liu Chuan-jiao，and ZHANG
Xiu-xin*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：One important flowering-regulating transcription factor gene CONSTANS（CO）was
obtained from tree peony（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）by RT-PCR. The full cDNA length of PsCOL4
was 1 125 bp，and could encode 373 amino acids. Sequence alignment and motif analysis showed that the
deduced amino acids contained 2 B-box zinc figure motifs near the amino terminus and 1 conserved CCT
domain near the carboxy terminus. It was designated as PsCOL4 and the GenBank accession was
KF113358，according to its high identity of AtCOL4 in Arabidopsis. Phylogenetic analysis showed that it
has close relationship with Vitis vinifera. The results of qRT-PCR revealed that the highest expression
levels were appeared in the stems of P. suffruticosa，flowed by leaves and buds. The expression pattern of
PsCOL4 from bud swelling to big-like flower-bud showed a decreased trend. The expression of PsCOL4
has a few differences under different photoperiod treatments. The expression of PsCOL4 increase in leaves

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and decreased in stems under short day photoperiod，compared with that in long day photoperiod.
Key words：tree peony；photoperiod pathway；CONSTANS；PsCOL4；qRT-PCR

牡丹（Paeonia suffruiticosa）原产于中国，主要分布于中国的中部、西南部和西北部（李嘉珏，
1999；Cheng，2007；Yuan et al.，2011）。牡丹是多年生木本花卉，自然花期相对集中（北京地区一
般为 4 月底到 5 月初）而且很短，单株自然花期约为 10 d，因此不能满足人们在不同节日赏花的需
求。另外，牡丹的童期较长，一般为 3 ~ 5 年，大大增加了优良品种培育的难度（李嘉珏，1999）。
因此深入开展牡丹成花的分子机理研究，对指导牡丹生产具有十分重要的意义。
CONSTANS（CO）蛋白是光周期途径中的一个关键的调控转录因子，属于锌指蛋白，含有保
守的 B-box 结构域和 CCT 结构域（Putterill et al.，1995）。长日照条件会激活 CO 基因的转录表达，
随后积累的 CO 蛋白通过激活下游基因 FLOWERING LOCUS T（FT）和 SUPPRESSOR OF
OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）的转录表达，进而促进植株开花（An et al.，2004）。
在拟南芥中共发现了 17 个 CO 类似基因（Putterill et al.，1995；Robson et al.，2001），根据锌指结
构域突变的情况，可以将这 17 个基因分成 3 个组：第 1 组包括 CO 和 COL1 ~ COL5，有 2 个 B-box；
第 2 组包括 COL6 ~ COL8 和 COL16，含有 1 个 B-box；第 3 组包括 COL9 ~ COL15，含 1 个锌指结
构和第 2 个分叉锌指（Robson et al.，2001）。随后 CO 类似基因先后在单、双子叶植物中被发现，
其功能主要是在光照诱导下激活 FT 或其相关基因，促进植株开花（Yano et al.，2000；Suarez-Lopez
et al.，2001；Griffiths et al.，2003；Nemoto et al.，2003；Ben-Naim et al.，2006；Almada et al.，2009；
Herrmann et al.，2010；Huang et al.，2011）。由此可见，CO 类似基因在植物开花时间控制途径上的
作用十分重要。尽管在牡丹中已经克隆得到了部分与花发育有关的基因，如：APETALA1（任磊 等，
2011a）、APETALA2（任磊 等，2011b）和 SEPALATA（任磊 等，2011c），但是还未见有开花促进
途径中的基因报道。因此克隆开花促进途径中的关键基因，对研究牡丹花期调控具有重要意义。
本研究中以牡丹栽培品种‘紫罗兰’为试验材料，利用 RT-PCR 的方法，克隆得到了 CO 同源
基因的全长 cDNA 序列，同时采用实时荧光定量 PCR 探讨了 CO 基因在‘紫罗兰’牡丹不同器官、
不同发育时期的花芽以及在不同光周期条件下的表达情况，为进一步研究牡丹 CO 同源基因的功能
及其在成花转变中的作用奠定了基础，也为牡丹花期调控研究提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
引自菏泽牡丹园的牡丹栽培品种‘紫罗兰’（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）栽种于中国农业
科学院蔬菜花卉研究所牡丹资源圃中，于 2013 年春季收取其在膨大期、显蕾期、小风铃期和大风铃
期的花芽，用于后续表达分析研究。2013 年春季于栽种育苗钵中幼苗叶片长到 10 cm 左右时，将其
移至光照培养箱中（BYC4-100，宁波欧普），经不同光周期处理后取其根、茎和叶，用于后续表达
分析。
组织器官表达分析取样：收取移至培养箱之前的幼苗根、茎和叶，液氮速冻后–80 ℃保存备用。
光周期处理：培养温度为 25 ℃，光照强度为 500 μmol · m-2 · s-1，设置 8 h/16 h 和 16 h/8 h 两种
光/暗周期处理，先在各光周期处理条件下生长 3 d，然后于第 4 天收取幼苗的根、茎和叶，液氮速
冻后保存于–80 ℃备用。
7 期 王顺利等：牡丹开花调控转录因子基因 PsCOL4 的克隆、表达与系统进化分析 1411










图 1 牡丹 PsCOL4 的 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 PCR amplification result on agarose gel of PsCOL4
1.2 RNA 的提取和 cDNA 的合成
提取花芽总 RNA（Li et al.，2010；Wang et al.，2012）。取 1 μL 利用 NanoDrop ND-1000 分光
光度计测定 RNA 浓度，并判断其质量。然后取 1 μg 高质量的 RNA，利用 OligdT 和随机引物合成
cDNA 链，具体步骤参照 Promega 的 M-MLV Reverse Transcriptase 说明书（Promega，M1701，USA）。
1.3 引物设计与 PCR 反应体系
根据本实验室 454 转录组测序所得到的 CO 的 5′和 3′的部分序列以及已发表的 CO 类似基因的
序列，利用 Primer 5.0 软件设计了 1 对可以扩增 PsCOL4 完整开放读码框（Open Reading Frame，ORF）
的正、反向引物，PsCO-1F：5′-ATGGGTAGAGAAGAGGGGAG-3′；PsCO-1R：5′-TTATCAAAACGA
TGGAACGAT-3′。以上述反转录的 cDNA 为模板进行 PCR 反应，反应体系为 50 μL。94 ℃预变性 4
min；94 ℃变性 45 s，54 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 80 s，34 个循环，72 ℃延伸 10 min。扩增产物经
过琼脂糖凝胶电泳分离后，选取目的条带进行切胶、回收，连接到 Promega 的 pGEM-T 载体上
（Promega，Madison，WI 53711-5399，USA），经过遗传转化，将重组质粒转入大肠杆菌 DH5α 中。
最后利用菌液 PCR 鉴定阳性克隆，并随机选取 3 个阳性克隆送至北京华大基因公司进行测序。
1.4 序列分析与系统进化树的构建
利用 BioEidt 7.0 软件，对克隆得到的 cDNA 序列进行翻译，然后利用 NCBI 中的 protein blast
进行相似蛋白的搜索，并下载相似性 > 50%的蛋白序列，最后利用 DNAMAN 5.0 进行蛋白序列比
对，利用 MAGA4.1 构建系统进化树，具体步骤参考 Wang 等（2011）的报道。
1.5 实时定量 PCR 反应
设计 1 对引物 qPsCO-1F：5′-TTGATACCAAACCCTAACGC-3′，qPsCO-1R：5′-TGATTCTGAAC
CACCTCCG-3′，其扩增子的长度为 242 bp。选择表达相对稳定的 actin 基因（JN105298）作为内参
基因（张玉喜 等，2011），RTactin1F：5′-GAGAGATTCCGTTGCCCAG-3′；RTactin1R：5′-TCCTTG
CTCATTCTGTCTGC-3′，扩增子长度为 191 bp。qRT-PCR 反应体系为 20 μL。94 ℃预变性 3 min；
94 ℃变性 15 s，55 ℃复性 15 s，72 ℃延伸 20 s，40 个循环。最后利用 CFX96 real-time system（Bio-Rad）
自带软件来计算 PsCOL4 在不同发育时期的表达，每个 PCR 反应至少 3 次重复。
2 结果与分析
2.1 牡丹 PsCOL4 cDNA 全长的克隆与序列分析
以‘紫罗兰’牡丹花芽的 cDNA 为模板，
克隆得到了一个 1 125 bp 大小的含有完整开放
读码框的 cDNA 序列（图 1），编码 373 个氨基
酸。核苷酸 NCBI blast 分析发现，克隆得到的
cDNA 序列与森林草莓（Fragaria vesca）的
CONSTANS-like 4 相似性最高，其推导的氨基
酸序列与葡萄的 CONSTANS-like 4 相似性最
高，故将其命名为 PsCOL4（CONSTANS-like 4），
GenBank 登录号为 KF113358。
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2.2 牡丹 PsCOL4 编码氨基酸的同源性分析
氨基酸比对（图 2）发现，PsCOL4 含有典型的 B-box 和 CCT 结构域，属于 CO 家族。两个 B-box
型锌指构型为 CX2CX8CX7CX2CX4HX8H 和 CX2CX8CX7CX4HX8H，与拟南芥 CO 蛋白构型
（Putterill et al.，1995）类似。
比对发现 PsCOL4 的 COOH 区域末端的 8 个氨基酸也高度保守，由 GYGI/VVPSF 构成，PsCOL4
的中部区域保守性很低，但仍有少数氨基酸序列表现为高度保守（图 2）。基于氨基酸序列的同源性
分析表明，PsCOL4 蛋白同葡萄 VvCOL4 蛋白的一致性最高，为 69%，与其他植物来源 CO 类似蛋
白的一致性较低。但其在 B-box 锌指结构和 CCT 结构域处高度保守，推断 PsCOL4 是具有生物功能
的 CO 类似基因。



图 2 PsCOL4 基因的推测氨基酸序列与其他植物 CO 蛋白的多序列比对
PsCO：牡丹（KF113358）；VvCOL4：葡萄（XM_002263422)；AtCO：拟南芥（NP_97088）。
Fig. 2 Alignments of the PsCOL4 deduced amino acid sequences with other CO proteins from plants
PsCO：Paeonia suffruticosa（KF113358）；VvCOL4：Vitis vinifera（XM_002263422)；AtCO：Arabidopsis thaliana（NP_97088）.

2.3 牡丹 PsCOL4 系统进化分析
为了探讨牡丹 PsCOL4 与来自拟南芥中的 CO 基因家族的关系，首先利用拟南芥中的 17 个 CO
和 CO 类似蛋白与 PsCOL4 构建了系统进化树，以耐盐蛋白（NP_849598）作为外源群。结果表明
PsCOL4 与 CO 类似蛋白的第一组群聚为一枝，属于 group I（图 3），这也表明将克隆得到的 CO 类
似基因命名为 PsCOL4 的合理性。
利用来自其他物种的 16 个 CO 和 CO 类似蛋白构建了系统进化树，来探讨 PsCOL4 与它们之间
的系统进化关系。结果表明：单、双子叶植物编码的 CO 类似蛋白，各聚为一枝；PsCOL4 与其他
物种编码的 CO-like-4 蛋白聚到一起，与葡萄中的 VvCOL4 聚在一起，可以推测其与葡萄的亲缘关
系最近，与单子叶植物编码的 CO 类似基因亲缘关系最远（图 4）。
7 期 王顺利等：牡丹开花调控转录因子基因 PsCOL4 的克隆、表达与系统进化分析 1413


图 3 牡丹 PsCOL4 与拟南芥 CO-like 蛋白的系统进化分析
STO（SALT TOLERANCE，NP_849598）作为外源群。
Fig. 3 Phylogenetic relationship among PsCOL4 and Arabidopsis CO-like proteins
The Arabidopsis accession numbers are indicated in the Figure and STO（SALT TOLERANCE，NP_849598）as out-group.




图 4 牡丹 PsCOL4 与其他物种 CO 蛋白的系统进化分析
自展值（1 ~ 1 000）标记各个节点，STO 蛋白（SALT TOLERANCE，NP_849598）作为外源群。
Fig. 4 Phylogenetic relationship among CO and CO-like proteins
Boot-strap values from 1 000-replicates were indicated at each node and STO（SALT TOLERANCE，
NP_849598）was used as out-group.
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图 6 牡丹 PsCOL4 在不同发育时期花蕾中的表达
a、b 表示在 P ≤ 0.05 水平上差异显著。
Fig. 6 Expression pattern analysis of PsCOL4 gene in different
developmental buds
a，b indicate significant difference at 0.05 level.
2.4 PsCOL4 在牡丹不同组织器官和不同发育时期花芽中的表达分析
通过对不同组织器官中 PsCOL4 的表达分析（图 5）发现，PsCOL4 在牡丹根、茎、叶和花芽中
都有表达，但表达量存在一定的差异。在根中的表达量最低，茎和叶中的表达量最高。推测幼苗时
期的牡丹中，PsCOL4 在茎和叶中发挥的作用更大。
PsCOL4 在不同发育时期花蕾中的表达（图 6）分析表明，从花芽膨大期到大风铃时期，PsCOL4
的表达呈现递减趋势。可以推测 PsCOL4 在花芽发育早期的大量表达，便于尽早启动下游基因 FT
或者 SOC1 的表达，最终调控牡丹花的正常开放。这与葡萄中解除休眠的花芽呈现递减的趋势相同
（Almada et al.，2009）。因此推测 PsCOL4 是牡丹开花调控的重要转录因子。






2.5 PsCOL4 在不同处理条件下牡丹根、茎和
叶中的表达
两种光周期条件下，PsCOL4 在根中的表
达量都比较低，在茎和叶中的表达量都比较高
（图 7）。
与长日照条件下相比，短日照条件下
PsCOL4 在叶片和根中的表达有增加的趋势，
而在茎中呈现降低的趋势。
总的来说，不同光周期对 PsCOL4 的表达
有一定的影响，这同拟南芥 CO 基因和番茄
SlCOL1 基因的表达模式（Putterill et al.，1995；
叶雪凌 等，2008）不同。
3 讨论
被子植物中的光周期开花调控已经在很多植物中研究过，结果表明不管是单子叶植物还是双子
叶植物，它们调控的分子机理是十分保守的（Yanovsky & Kay，2003）。光周期途径是亲缘关系较远
的植物中最保守的开花响应途径，它通过整合光照和生物钟等环境信号决定植株开花时间（杨修勤
图 5 牡丹 PsCOL4 在幼苗的根、茎、叶和成年花蕾中的表达
a、b、c 表示在 P ≤ 0.05 水平上差异显著。
Fig. 5 Expression analysis of PsCOL4 gene in root，stem，leaf
and bud in tree peony by qRT-PCR
a，b，c indicate significant difference at 0.05 level.
图 7 在长日照和短日照处理下牡丹 PsCOL4 在幼苗中的表达
a、b 表示在 P ≤ 0.05 水平上差异显著。
Fig. 7 Expression analysis PsCOL4 gene in tree peony seedlings
under long and short day conditions
a，b indicate significant difference at 0.05 level.
7 期 王顺利等：牡丹开花调控转录因子基因 PsCOL4 的克隆、表达与系统进化分析 1415

等，2013）。而 CO 基因是生物钟和开花时间基因之间监测日照长度的重要元件，在光周期途径中发
挥核心功能。CO 蛋白可以整合光信号和生物钟信号，诱导开花途径下游基因 FT 和 SOC1 的表达,
进而促进植株开花（An et al.，2004）。目前在很多物种中都发现了 CO 的同源基因，它们均含有保
守的 B-box 型锌指结构和 CCT 基序（Putterill et al.，1995；Yano et al.，2000；Suarez-Lopez et al.，
2001；Griffiths et al.，2003；Guo et al.，2007；叶雪凌 等，2008；Almada et al.，2009；郑本川 等，
2013）。本试验中首次克隆得到了 1 个光周期途径中的 CO 基因 PsCOL4，PsCOL4 含有 2 个 B-box
结构和 1 个 CCT 基序结构，与拟南芥第 1 组群的 CO 类似基因具有相同的特点，属于 CO 类似基因。
CO 基因家族中成员的数量在不同植物中也是不同的。拟南芥中至少有 17 个基因，番茄中至少有 4
个基因，而葡萄中至少有 14 个推测的 CO 基因（Griffiths et al.，2003；Ben-Naim et al.，2006；Almada
et al.，2009）。因此推测 CO 类似基因在牡丹中可能也不止一个成员。
PsCOL4 基因在牡丹不同组织器官中均有表达，但是表达量存在差异，根中的表达量最低。而
葡萄中 VvCO 和 VvCOL1 也是在根中的表达量最低（Almada et al.，2009）。叶雪凌等（2008）在研
究番茄 CONSTANS 类似基因在不同组织器官中的表达发现，SlCOL1 在番茄的根、茎和叶片
中也均有表达，不过番茄叶片中的表达量最高。在甘蓝型油菜的研究中证实，CO 基因在不同组织
器官中的表达受到油菜品系、取样时间的影响，在整个生育期内，早熟和晚熟甘蓝型油菜品系的 CO
基因以叶片中的表达量最高，茎和蕾中表达量次之，且早晚表达量高于中午时分（郑本川 等，2013）。
在马铃薯不同发育时期，StCOL 基因的表达也存在差异，在块茎形成前，StCOL 在叶片中表达量也
是最高，而在块茎形成后，其在根中的表达量最高（Guo et al.，2007）。因此推测在幼苗期，牡丹茎
中高表达的 PsCOL4 利于茎尖的生长（Wigge et al.，2005）。对 PsCOL4 在不同发育时期花芽中的表
达研究中发现，其在花芽膨大期的表达量最高，其可能的原因是高表达的 CO 将是诱导植物开花的
开始。在拟南芥、杨树和黑麦的研究中也表明 CO 基因转录的增加与开花起始阶段是对应的（Putterill
et al.，1995；Yuccer et al.，2002；Martin et al.，2004）。综合 PsCOL4 蛋白结构特点以及在花芽中的
表达模式，可以推测 PsCOL4 是调控牡丹开花的重要转录因子。不同光周期研究证实，在短日照条
件下，PsCOL4 的表达量总体呈上升的趋势，与葡萄中的 VvCO 和 VvCOL1 表达趋势相同，与拟南
芥和黑麦中的 CO 同源基因表达趋势相反（Putterill et al.，1995；Martin et al.，2004；Almada et al.，
2009），其原因可能是由于不同植物的生态习性和发育状态所导致。总之，牡丹光周期途径中的 CO
基因的成功克隆，可以为以后深入研究牡丹开花诱导途径的分子机理奠定了理论基础。

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关于申报 2014 年度“华耐园艺科技奖”的通知

为了加快园艺科技的发展，促进科研与生产的紧密衔接，中国园艺学会和北京华耐农业发展有限公司联合设立
“华耐园艺科技奖”，经科技部国家科学技术奖励工作办公室批准，对在国内园艺科技领域做出突出贡献的科研成
果进行奖励，由中国园艺学会具体承办。经 2014 年 4 月 2 日第十二届一次常务理事会研究决定，对 2014 年华耐园
艺科技奖管理办法进行了调整，奖励名额 8 个（果树、蔬菜专业各 3 个，西甜瓜和观赏园艺专业各 1 个，奖金 5 万
元；特等奖 1 个，奖金 10 万元；可空缺）。现将有关事宜通知如下：
一、奖励范围：
华耐园艺科技奖奖励在全国园艺作物的种质资源、育种、生物技术、栽培、病虫害防治、贮藏加工等科学研究、
技术推广中取得突出成绩的科研成果。
二、申报条件：
1. 属于华耐园艺科技奖奖励范围的科研成果。2. 不存在成果权属、完成单位、完成人等方面的争议。3. 尚未
获得国家、省部级科技奖励的科研成果。
三、申报要求：
1. 由成果完成单位自愿申请，填写华耐园艺科技奖申请表（http：//cshs.org.cn），提供必要的成果奖励证明或
评价材料，经所在工作单位领导同意推荐并加盖公章、2 名正高级专业技术职务同行专家（其中有 1 名外单位的专
家）联名推荐上报。
2. 将申请表的纸质材料一式两份邮寄至中国园艺学会办公室，同时将电子版发至中国园艺学会邮箱（cshs@caas.cn）。
邮件封面请写华耐园艺科技奖申报材料字样。
3. 申报截止时间 2014 年 8 月 31 日止（以邮戳为准），过期不予受理。
四、联系方式：
受理单位：中国园艺学会华耐园艺科技奖办公室
联系人：蒋淑芝，电话：010-82109526；张彦，电话：010-82109528
通信地址：北京中关村南大街 12 号 中国农业科学院蔬菜花卉研究所（邮编 100081）
电子邮箱：cshs@caas.cn；网址：http：//cshs.org.cn（具体详情请查阅中国园艺学会网站）
中国园艺学会
2014 年 5 月 20 日