全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2012，24(3):459 － 463 http:/ /www． zjnyxb． cn
赵美娜，邱海萍，姜华，等． 马唐生防菌 Col-68 发酵条件的筛选［J］．浙江农业学报，2012，24(3):459 － 463．
马唐生防菌 Col-68发酵条件的筛选
赵美娜1，2，邱海萍2，姜 华2，张 震2，毛雪琴2，王教瑜2，柴荣耀2，杜新法2，王艳丽2，* ，孙
国昌2，*
(1 浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江金华 321004;2 浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基
地，浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021)
收稿日期:2011 － 08 － 29
基金项目:科技部 863 项目(2006AA10A214);浙江省科技计划项目(2004C32013);杭州市科技发展项目(20052432B17)
作者简介:赵美娜(1986 －)，女，陕西咸阳人，在读硕士研究生，主要从事植物病理学方向研究，E-mail:zmn861226@ sina． com，Tel:
13868121368;
* 通讯作者:王艳丽，E-mail:wangylaa@ yahoo． com． cn;孙国昌，E-mail:sungc@ sina． com
摘 要:为了最大程度增强马唐生防菌 Col-68 在发酵过程中产孢能力以及次生代谢产物除草活性，试验以
Col-68 发酵滤液对马唐种子根、芽生长的抑制率为活性指标，综合不同培养条件下菌株产孢的差异，利用单
因素筛选试验筛选出了适合该菌株发酵的不同碳氮源、碳氮比及初始碳源适宜浓度。研究结果表明，在初始
pH = 6. 5，每 300 mL锥形瓶装液 120 mL，接种 100 μL菌原液，28℃、160 r·min －1震荡培养 10 d的最佳发酵条
件下，菌株活性差异显著，以蔗糖为碳源时 Col-68 活性、产孢量以及对马唐根长抑制率最高，蔗糖浓度在 30 ～
50 g·L －1时菌株产孢量以及对马唐根长抑制率较高，发酵最适宜利用的氮源为硝酸钠，最佳碳氮比则为 2. 5∶
1. 0。同时，不同条件下的发酵滤液对马唐根生长的抑制率均明显高于对芽生长的抑制率。
关键词:生物除草剂;Col-68;马唐;发酵条件
中图分类号:S 476 文献标志码:A 文章编号:1004 － 1524(2012)03 － 0459 － 05
Optimization of fermentation conditions of biocontrol strain Col-68 Colletotrichum hanaui a-
gainst Digitaria sanguinalis
ZHAO Mei-na1，2，QIU Hai-ping2，JIANG Hua2，ZHANG Zhen2，MAO Xue-qin2，WANG Jiao-yu2，CHAI Rong-yao2，
DU Xin-fa2，WANG Yan-li2，* ，SUN Guo-chang2，*
(1College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China;2 State Key Laboratory
Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control，Institute of Plant Protection Microbiology，Zhejiang
Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China)
Abstract:Optimization of four parameters，including initial total sugar concentration，carbon source，nitrogen source
and carbon-nitrogen ratio (C /N)，was surveyed by using single factor experiment for the optimal production of sporu-
lation of biocontrol strain Col-68 and the increasing activity of fermentation filtrate against Digitaria Sanguinalis root
growth． The optimal fermentation medium was as follows:the optimal carbon source was surcose，the optimal nitrogen
source was nitrate nitrogen，carbon-nitrogen ratio was 2. 5∶ 1. 0，and an initial total sugar concentration between of 30
～ 50 g·L －1 ． The suitable fermentation conditions were as follows:initial pH 7. 0，temperature 28℃，medium volume
120 mL·300 mL －1，inoculum volume 5% (v /v)，for 10 day． In such optimal nutrition and environmental condi-
tions，the maximum sporulation and herbicidal activity of fermentation filtrate of were obtained． The results also
showed that the inhibition of fermentation filtrate of the strain Col-68 to Digitaria Sanguinalis root growth was signifi-
cantly higher than the sprout．
Key words:biocontrol fungus;Col-68;Digitaria sanguinalis;fermentation
化学除草剂因具有高效、省工和增产等的优
点，而被广泛应用于农业生产［1］。然而长期使用
化学除草剂可导致杂草种群抗性的产生;同时还
会造成土壤板结，环境污染;残留的化学农药还
可能通过食物链被人体吸收，直接危害人类健
康［2］。因此，开发防除效果好、安全、无污染、低
残留的除草剂是今后发展的趋势。生物除草剂
是利用自然界中原本存在的生物在各自生命过
程中产生的各种生物活性物质开发的除草剂［3］，
具有靶标性强、无污染、无残留等优势。生物除
草剂不仅可以降低化学除草剂的用量，个别活性
超强的生物除草制剂甚至可以替代化学除草剂。
生物除草剂不同于化学除草剂的生成方式———
化学合成，而大部分是通过发酵特异菌株再通过
一定提纯流程获得，因此发酵条件是生物除草剂
商品化开发的前提基础［4］。碳氮源是微生物代
谢所需的糖、蛋白质、核酸等一系列生命物质所
必需的基本原料，是影响发酵产物活性及产量得
重要因素。发酵条件中的不同碳氮源、碳氮量及
碳氮比确定是菌株发酵条件优化的首要任务。
菌株 Col-68 是由本实验室在罹病的杂草马
唐(Digitaria sanguinalis)上分离，经鉴定为弯孢
型炭疽菌(Colletotrichum hanaui)［5］。前期研究
表明该菌对杂草马唐具有很好的生防效果，且对
玉米、花生等经济作物安全无毒，具有开发成为
生物除草剂的潜力。本试验旨在研究筛选利于
菌株发酵的碳氮源、明确碳源用量及碳氮比，为
将该菌进一步开发为生物除草剂提供基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
菌株 Col-68 由本实验室分离保存。试验所
用化学试剂均为分析纯。供试马唐种子由本实
验室在田间采集获得。
1． 2 菌种活化
挑取保存于斜面的菌种少许，接种于 PSA平
板［6］，28℃黑暗培养 3 ～ 5 d 后，挑取菌落周围 2
～ 3 块直径为 5 mm 的菌丝块，接种到麸皮培养
基(30 g·L －1麸皮消煮 30 min 后的滤液) ，28℃
160 r·min －1振荡培养 3 ～ 4 d后，双层滤纸过滤收
集孢子，制成孢子悬液备用。
1． 3 发酵培养液的制备
发酵基础培养基:称取硫酸铵 2 g·L －1;磷酸
氢二钾 0. 65 g·L －1;氯化钙 0. 08 g·L －1;磷酸钠
0. 5 g·L －1;七水合硫酸镁 0. 2 g·L －1;酵母粉 2 g·
L －1;蒸馏水定容至 1 000 mL。
碳氮源筛选时，发酵基础培养基中加入碳氮
源葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、硝酸钠、硝
酸铵、硫酸铵、蛋白胨和尿素各 30 g·L －1;碳量筛
选时，加入碳源蔗糖各 10，30，50，70，90 g·L －1;碳氮
比筛选时，加入 40 g·L －1碳源蔗糖和相应比例氮源
硝酸钠，使 C/N为 1. 25∶ 1. 00，2. 5∶ 1. 00，5∶ 1，10∶ 1，
20∶ 1。混合均匀后调解 pH =6. 5，分装入 300 mL
的锥形瓶中，每瓶装液 120 mL，121℃灭菌 20 min
后待用。
1． 4 产孢测定
每瓶发酵基础培养基中加入 100 μL 的孢子
悬液，28 ℃，160 r·min －1振荡培养 3 d 后，每天固
定时间吸取 1 mL培养液，双层滤液过滤后，用血
球计数板统计产孢情况，摇菌 10 d左右后将发酵
液用双层擦镜纸过滤去除菌丝，11 000 r·min －1室
温离心 15 ～ 20 min，吸取上清，121 ℃高压灭菌
20 min备用。
1． 5 除草活性测定
马唐种子消毒与催芽:取适量马唐种子无菌
水浸泡过夜，用 1%次氯酸钠浸泡 10 min，无菌水
洗涤 3 ～ 5 次，然后将马唐种子置于浸润的滤纸
上，25 ℃光照培养 4 ～ 5 d，长出芽点后待用。
直径 3 cm的试管加入 4 g 蛭石，2 mL 相应
组别发酵培养滤液和 28 mL 双蒸水，振荡混匀后
121℃灭菌 20 min，静置一夜使发酵液渗透均匀，
每管接入 10 ～ 15 粒出芽的马唐种子，25℃光照
培养 10 d 后，测量每管种子根长和芽长，计算出
每处理根(芽)平均长度和对照根(芽)平均长
度，按抑制率公式计算出根芽生长抑制率，拍照
并记录数据，以上试验每处理 3 次重复，试验重
复 2 次。
根长(芽长)抑制率(%)=［(对照根(芽)长
度 － 处理根(芽)长度)/对照根(芽)长度］×
·064· 浙江农业学报 第 24 卷 第 3 期(2012 年 5 月)
100%
1． 6 数据分析
本试验数据所有统计分析利用 SPSS17. 0 软
件完成，采用 Duncans进行显著性比较。
2 结果与分析
2． 1 碳氮源对菌株发酵液除草活性的影响
图 1 表明，当利用蔗糖为碳源时，菌株产孢
量显著高于其他 4 种碳源，最高可达 9 × 106 cfu·
mL －1。在氮源筛选方面，蛋白胨为菌株发酵的氮
源时，产孢量最高可达 9 × 106 cfu·mL －1，其次为
硝酸钠，可达 6. 8 × 106 cfu·mL －1。硫酸铵和尿素
作为氮源时菌株产孢较为相似，产孢量为 5 种供
试氮源中最低。
不同碳氮源发酵的培养滤液对菌株除草活
性影响的试验(表 1)表明，不同碳氮源的发酵滤
液均对马唐种子根的生长具有一定抑制作用，如
图 1 示，抑制率可达 50%以上，而在对马唐幼苗
芽的抑制上却并不明显，乳糖和麦芽糖的碳源甚
至对马唐芽生长还有一定的促进作用。对马唐
根长抑制率最高是以蔗糖为碳源的蔗糖发酵滤
液，可达 81%。因而在随后的试验中选用蔗糖为
进一步发酵的碳源。硫酸铵为氮源的发酵液对
马唐根长抑制率最高 87%，氮源硝酸钠的发酵滤
液对马唐根的根长抑制率可达到 57%。尽管硫
酸铵为氮源时发酵液抑制活性最高，但菌株的产
孢量却最差，不利于持续的发酵生产。而在进行
发酵液进一步萃取时，以蛋白胨为氮源的发酵液
酯化现象严重，不利于随后除草活性物质的分离
与纯化，因此，综合考虑选用硝酸钠为氮源用于
菌株 Col-68 的进一步开发研究。
注:A表示清水对照，B、C 表示 Col-68 在不同发酵条件下的
发酵滤液对马唐根(芽)生长的影响
图 1 不同发酵条件对马唐根(芽)长抑制率的影响
Fig． 1 Effect of fermentation conditions on inhibition activity
of fermentation filtrate produced by biocontrol strain Col-68
against root(sprout)growth of Digitaria sanguinalis
2． 2 碳含量对菌株发酵液除草活性的影响
根据碳源筛选试验确定蔗糖为最佳碳源，选
择5个蔗糖含量梯度，考察不同初始碳含量浓度
图 2 不同碳、氮源对菌株 Col-68 产孢量的影响
Fig． 2 Effect of different carbon and nitrogen sources on sporulation of the strains Col-68
·164·赵美娜，等． 马唐生防菌 Col-68 发酵条件的筛选
图 3 不同碳源含量对 Col-68 产孢量的影响
Fig． 3 Effect of sucrose concentration on sporulation of the
strains Col-68
表 1 Col-68 不同碳氮源发酵滤液对马唐根(芽)长抑制
率的影响
Table 1 Effect of carbon and nitrogen sources on inhibition
activity of fermentation filtrate produced by biocontrol strain
Col-68 against root(sprout)growth of Digitaria sanguinalis
碳源 根长抑制
率 /%
芽长抑制
率 /%
氮源 根长抑制
率 /%
芽长抑制
率 /%
葡萄糖 67 b 5 b 硝酸钠 57 b 12 d
蔗糖 81 a 12 a 硝酸铵 48 bc 29 c
乳糖 0 d － 硫酸铵 87 a 55 a
麦芽糖 58 b － 蛋白胨 54 b 5 e
淀粉 67 b 7 b 尿素 46 c 47 a
注:表中同一列不同行之间没有相同小写字母表示 0. 05 水平上
显著性差异;－表示对根芽生长有一定的促生作用。下同。
表 2 不同蔗糖含量对马唐根(芽)抑制率的影响
Table 2 Effect of sucrose concentration on inhibition activi-
ty of fermentation filtrate produced by biocontrol strain Col-68
against root(sprout)growth of Digitaria sanguinalis
碳含量 /(g·L －1) 根长抑制率 /% 芽长抑制率 /%
0 0 d 0 d
10 88 b 11 b
30 94 a 18 b
50 91 a 66 a
70 61 c 2 d
90 58 c 5 d
对菌株活性的影响。图 2-A 表明，过高和过低的
糖含量对菌株的产孢量均具有一定的抑制作用，
蔗糖含量趋于中间浓度，在 30 ～ 50 g·L －1之间时
菌株的产孢量最高，平均可达 3 × 106 cfu·mL －1。
利用发酵 10 d 后的菌株发酵滤液培养马唐
种子时，发现选用的 5 个蔗糖浓度梯度对马唐种
子根长抑制率均可达 60%以上，其中浓度为 30
和 50 g·L －1时的根长抑制率甚至可达到 90%以
上。30 g·L －1时蔗糖浓度的发酵滤液对马唐芽长
抑制率可达 18%，50 g·L －1时可达 66%，其他蔗
糖浓度的发酵滤液对芽长抑制率相对较小。综
上所述，在选用蔗糖量为 30 ～ 50 g·L －1之间时菌
株 Col-68 的活性较高。
2． 3 不同碳氮比对菌株发酵液除草活性的影响
碳氮比 2. 5∶ 1. 0 的菌株活性最高，在第 9 天
产孢量最高可达到 5. 6 × 106 cfu·mL －1，对马唐根
长抑制率可达 75%，对芽长抑制率最高可达
34%。碳氮比其次为 5∶ 1 和 1. 25∶ 1. 00 菌株活性
较好，产孢量可达 2 × 106 cfu·mL －1左右，发酵滤
液对马唐根长抑制率可以达到 77%和 76%，芽
长抑制率也可达到 19%和 34%。10 ∶ 1 和 20 ∶ 1
的碳氮比发酵时菌株活性较差，产孢量只有 1 ×
106 cfu·mL －1左右，对马唐根的根长抑制率也只
有 65%左右(表 3)。
表 3 不同碳氮比对 Col-68 产孢量以及该发酵滤液对马
唐根(芽)生长的影响
Table 3 Effect of C /N ratio on sporulation and inhibition
activity of fermentation filtrate produced by biocontrol strain
Col-68 against root(sprout)growth of Digitaria sanguinalis
碳氮比 第 9 天产孢量 /
(× 106 cfu·mL －1)
根长抑制率
/%
芽长抑制率
/%
1. 25∶ 1. 00 2. 00 b 76 a 34 a
2. 5∶ 1. 0 5. 60 a 75 a 29 a
5∶ 1 2. 12 b 77 a 19 b
10∶ 1 1. 30 c 62 b 4 c
20∶ 1 0. 89 c 66 b －
3 讨论
以往的研究表明，真菌的培养需要 40% ～
63%的碳、7% ～ 10%的氮［7］，不同的碳、氮源影
响菌株的产孢量和孢子的萌发，过量的碳、氮源
会降低孢子中的蛋白质含量，从而影响孢子的萌
发，最终使孢子的致病力下降［8］。不同碳氮比对
菌株活性具有很大影响［9］。本研究表明，Col-68
的产孢和除草活性与碳、氮源密切相关，蔗糖为
碳源时菌株的产孢量和发酵滤液的除草活性最
·264· 浙江农业学报 第 24 卷 第 3 期(2012 年 5 月)
强，过高的碳含量和过低的碳含量都会抑制菌株
的活性，蔗糖浓度 30 ～ 50 g·L －1时菌株的活性较
高。硝酸钠为菌株发酵的氮源时更利于菌株后
期的研发。碳氮比在 2. 5 ∶ 1. 0 时有利于产孢。
碳、氮源的确定，有利于产孢或代谢产物中活性
成分的生成，为进一步开发商品化生物源除草剂
提供依据。
在现阶段农业生产上生物源除草剂还无法
完全替代化学除草剂的使用［10］。通过对生防菌
的发酵条件的优化筛选出利于产孢和代谢产物
中活性成分的产生，可以增强菌株对杂草的防除
效果，对生物源除草剂的开发和减少化学除草剂
的使用具有重大意义。由于生物源除草剂存在
生防菌寄主单一，发酵条件不稳定以及剂型加工
困难等问题，因而大多数生物除草剂还仅限于研
究试验阶段，不能直接用于商品化开发，甚至有
些商品化菌株由于无法突破这种局限性，而被退
出市场［11］。目前登记注册用于防除杂草真菌除
草剂只有不到十种，如防除弗吉尼亚田皂角(Ae-
schynomene virginica)的 Collego，用 Devine 防除恶
性杂草莫伦藤(Morrenia odorata Lind．) ，防除油
莎草(Cyperus esculentus L．)的 Dr． Biosedge，以及
防控圆叶锦葵(Malva pusilla Sm．)的 Biomal
等［12 － 14］。早在 1963 年我国从山东济南罹病的
大豆菟丝子上分离制成真菌除草剂鲁保一号，虽
然对生物除草剂研究起步较早，但开发商品化除
草剂的进程缓慢，对生防菌株除草机理了解认识
不深入是其中的一个原因［15］。本试验发现，菌株
Col-68 的发酵液对马唐根的生长具有明显抑制
作用，而对马唐芽的生长作用不明显。生长素可
以调节植物的生长状况，一般根比芽对生长素更
敏感，所以根对生长素所需要的最适浓度要比芽
低［16］。因此，我们推测菌株 Col-68 发酵过程中
能够产生某种代谢产物对根的伸长具有直接抑
制作用或可以通过影响植物体内生长素的浓度
达到抑制植物根的伸长，进而影响到植物对养分
的吸收，最终导致植物正常生长受阻，实现防除
杂草的目的。但具体的除草机制需要在后续研
究中明确。
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(责任编辑 陈华平)
·364·赵美娜，等． 马唐生防菌 Col-68 发酵条件的筛选