全 文 ：小单孢菌属 X46马唐致病菌的筛选
孙祎敏 1 ,冀营光1 ,郭淑娟 2 ,李 楠1 　
(1.河北化工医药职业技术学院 ,河北石家庄 050026;2.石药集团营养保健品事业部 ,河北石家庄 050026)
摘要　[目的]研究小单孢菌属X46马唐致病菌的筛选方法及致病作用。 [方法 ]采用改良的高氏I号培养基从马唐、稗草根际土壤中分
离出 1株马唐致病菌 X46,对其最优化产毒素条件进行测定并对其安全性进行评估。 [结果]经鉴定 ,马唐致病菌X46为小单孢菌属;其
最优化培养条件为:在高氏 I号培养液中 , 300ml三角瓶装液量 30ml,初始pH值 6.0～ 6.5,采用 10%接种量 , 180r/min28℃发酵 120h
即可使毒素产生量最大。该菌对玉米 、番茄和黄豆具有明显的促生长作用 ,对小麦有轻微的抑制作用 ,对黄瓜生长抑制作用明显。 [结
论] X46是一株具有开发为中国北方用生物除草剂的潜力菌株。
关键词　生物除草剂;小单孢菌属;马唐;筛选
中图分类号　Q939.9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)30-16913-03
ScreeningofDigitariasanguinalisPathogenicBacteriaX46BelongingtoMicromonosporaceae
SUNYi-minetal　(HebeiVocationalColegeofChemicalandPharmaceutical, Shijiazhuang, Hebei050026)
Abstract　 [ Objective] ThestudyaimedtoresearchthescreeningmethodandthepathogenesisfunctionofDigitariasanguinalispathogenic
bacteriaX46belongingtoMicromonosporaceae.[ Method] AstrainofD.sanguinalispathogenicbacteriaX46 wassegregatedfromtherhizo-
sphereofD.sanguinalisandEchinochloacrusgalli(L.)Beauv.byusingtheimprovedGauseNo1medium.Itsoptimizationconditionofpro-
ducingtoxinwasdeterminedanditssecuritywasestimated.[ Result] D.sanguinalispathogenicbacteriawasidentifiedasMicromonosporaceae
anditstheoptimizationcultureconditionswereasfolowings:intheGauseNo1medium, filing30mlcultureliquidin300mlflaskswithits
initialpHof6.0-6.5 and10%inoculationconcn.andfermentingat180r/minand28℃for120h, whichcouldproducethemaximuma-
mountoftoxin.D.sanguinalispathogenicbacteriaX46showedtheobviousactionofpromotingthegrowthonthemaize, tomatoandsoybean,
thelightcontrolactiononthewheatandtheobviouscontrolactiononcucumber.[ Conclusion] D.sanguinalispathogenicbacteriaX46isapo-
tentialstrainthatwilbedevelopedasthebiologicalherbicideinNorthChina.
Keywords　 Biologicalherbicide;Sanguinalis;D.sanguinalis;Screening
基金项目　河北省教育厅资助项目(Z2007443)。
作者简介　孙祎敏(1969-),女 ,河北沧州人 ,硕士 ,副教授 , 从事菌种
选育研究。
收稿日期　 2010-08-02
　　世界上恶性杂草分布范围广 ,繁殖能力强 ,生长期长 ,其
中尤以马唐 、稗草为甚 。在我国北方较干旱区域常导致多种
农作物减产 ,并且对化学除草剂具有群体抗性 [ 1] 。目前 ,美
国及阿根廷等国学者在研究马唐的生物防控方法方面取得
了一定进展 [ 2] ;国内相似报道很少。笔者从马唐 、稗草根际
土壤中分离到 1株致病菌 ,着重对其最优化产毒素条件进行
测定并对其安全性进行初步评估 ,以期为进一步研究应用该
菌提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌株。供试菌株从石家庄郊县 、邯郸郊县 、天津郊县
采样分离得到 。
1.1.2　培养基。改良高氏 I号培养基:NaCl0.5 g/L,
KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4 1.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, KNO3 1.0
g/L, FeSO4 · 7H2O0.01g/L,淀粉 10g/L,纤维素(粉碎过 60
目筛)5g/L, pH值 6.0,琼脂 20 g/L。发酵培养基:改良高氏
I号培养基 ,不加琼脂。
1.1.3　模式杂草种子。马唐(Digitariasanguinalis)、稗草 [ Echi-
nochloacrusgali(L.)Beauv.] ,仲夏采集 ,发芽率在 92%以上。
1.1.4　模式作物种子。玉米(ZeamaysL.)、黄豆(Glycine
max)、小麦(TriticumaestivumL.)、黄瓜(Cucumisativus)、番茄
(Solanumlycopersicum)均购自种子市场 ,发芽率在 99%以上 。
1.2　方法
1.2.1　菌株分离 。根据小单孢菌对淀粉 、纤维素等有机质
的强分解能力 ,使用改良高氏 I号培养基进行筛选。
1.2.2　最佳培养条件的确定。对分离到的菌株初始 pH
值 、培养温度 、通气量 、培养时间和接种量等参数进行测定 ,
监测其对除草毒素分泌的影响。
1.2.3　潜力菌株除草活性评估 。
1.2.3.1　毒素的制备。将筛选到的菌株放在最佳培养条件
下 ,让其充分生长 ,将培养液进行离心沉淀 , 3 000r/min离心 20
min,取上清 ,装入 100 ml三角瓶 , (90±1)℃水浴灭菌 15 min。
1.2.3.2　活体喷雾抑制试验。按营养土∶蛭石 =1∶1的比例
配好试验用土。小塑料杯装土至 7成 ,每杯植入等量饱满的模
式种子 ,以喷壶喷雾湿润后温室模拟自然光照下培养 ,待苗长
至 1叶期时 ,喷雾处理 ,对照采用 pH值 6.0的清水处理。发酵
液 1∶40稀释 ,喷雾剂量为 10 ml,重复 3次。光照黑暗条件交
替 , 28℃、60%湿度保湿 2 d,在第 3天移入温室并在 12 d后剪
取地上部分测鲜重和根部测根长 ,计算其抑制率 [ 3] 。
1.2.3.3　安全性评估。参见文献 [ 3-4] 。
1.2.4　菌种鉴定。通过对菌种生长的个体及菌落形态特征和
生理生化特征 ,根据伯杰氏鉴定手册(第 9版)进行鉴定 [5-6] 。
2　结果与分析
2.1　菌株分离　采用改良高氏 I号培养基分离菌株 ,结果
在平板上产生相对清澈的透明圈 ,透明圈内淀粉几乎完全分
解 ,纤维素约 37%被分解利用 ,筛选到 1株仅有基内菌丝的
菌株 X46。
2.2　最佳培养条件
2.2.1　初始 pH值的选择。选用初始 pH值为 6.0的改良培
养液培养菌株 X46,产生的毒素对马唐的抑制效果达 80%
(图 1),并且原料比较廉价 ,适合于大规模开发。
2.2.2　培养温度及通气量的确定。在 28℃条件下 , X46菌
株产生菌素效果较好(图 2),抑制率达到 75%,差异显著(P
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(30):16913-16915 责任编辑　张彩丽　责任校对　况玲玲DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.30.105
图 1　初始 pH值对 X46产生毒素的影响
Fig.1　EfectofdifferentpHvalueontoxinproducedfromX46
<0.05)。由图 3可见 ,当 250 ml三角瓶装液量为 20、30 ml,
摇床转速为 180 r/min时 ,对马唐的抑制效果都是很强的 ,抑
制率分别为 78%、79%,差异显著(P>0.05)。因此 ,装液量
也是影响毒素产生的主要影响因子之一。
图 2　培养温度对 X46产生毒素的影响
Fig.2　EfectofculturetemperatureontoxinproducedfromX46
图 3　通气量对 X46产生毒素的影响
Fig.3　EfectofairconditionsontoxinproducedfromX46
2.2.3　培养时间及接种量的确定。由图 4可见 ,抑制效果
在培养时间为 5d时基本达到顶峰 ,抑制率 81.5%,超过 5 d
后 ,效果提高不明显 ,差异不显著(P>0.05)。由图 5可见 ,
在 10%接种量条件下 X46所制备毒素毒力产生的抑制率在
70%,差异显著(P<0.05)。因此 ,采用 10%接种量发酵 5 d
为最优选择。
2.2.4　生长曲线 。液体培养基中长时间培养 ,菌种菌丝呈
微球状 ,因此 ,笔者采用计数和测定吸光度 2种方法来测定
其生长曲线 ,结果 2条曲线都在 120 h附近进入平台期(图
6),发酵结果基本一致。
2.3　活性评估
2.3.1　喷雾抑制结果。喷雾后测定得出 , X46对马唐的鲜重
图 4　培养时间对 X46产生毒素的影响
Fig.4　EffectofculturetimeontoxinproducedfromX46
图 5　接种量对 X46产生毒素的影响
Fig.5　EffectofinoculationontoxinproducedfromX46
图 6　X46菌株生长曲线的测定
Fig.6　TwocheckingmethodsforgrowingcurveofX46
抑制率在 70%以上 ,根长缩短 65%,呈显著差异(P<0.05)。
喷雾后 48h无变化 ,但一般在第 3天 ,就会出现叶片失绿 ,但重
新喷施灭菌水后 2d即可恢复生长 ,已变黄的叶子虽然继续变
黄 ,但新生叶不再失绿 ,不会影响到马唐的生长。可见毒素对
马唐的作用仅限在触杀 ,所以不是理想的生测方法。但是 ,当
加大喷液量时 ,抑制作用较明显。由此推测 ,当加大喷液量时 ,
会有富余的毒素渗透到马唐根茎部 ,最终起作用的仍然是毒素
对纤维的分解作用 ,限制了根茎部正常的生理功能 ,从而使地
上部分鲜重受到抑制。在喷施灭菌水恢复生长后 ,继续喷施 ,
则新生叶会受到一定的抑制 ,抑制率约 12%。
2.3.2　安全性评估。笔者选定北方旱田主要作物 ,单子叶的
小麦 、番茄和玉米 ,双子叶的黄豆和黄瓜进行安全性测定 ,结果
毒素对小麦和黄瓜具有部分抑制作用 ,对芽的抑制率分别为
7.5%和 14.0%,对根的抑制率分别为 12.0%和 31.0%,对发芽
率作用不明显;对玉米 、番茄和黄豆的抑制作用很弱 ,可以忽
略 ,部分试样甚至促进其生长 ,对根的抑制率分别为 9.4%、
16914 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
-13.0%和 -34.0%,芽长抑制率分别为 -43.75%、-32.00%
和 -47.50%;其促模式作物生长作用均大于 32%。由此可以
得出 , X46菌株具有一定的除草活性 ,对我国北方旱田作物基
本无害 ,但对过冬小麦有轻微的抑制作用 [ 7] 。
2.4　菌种鉴定　X46菌株在琼脂培养基上 ,只有基内菌丝 ,
生长良好 ,在基内菌丝分化的孢子梗上均着生单个孢子 ,能
分解利用淀粉 、纤维素 ,革兰氏阳性 ,细胞壁Ⅱ型 ,不抗酸 ,菌
落呈胡核桃状 ,适合生长在 28℃,属于中温菌 ,喜酸性环境 ,
好氧 ,经对照伯杰氏鉴定手册(第 8版)[ 5] ,应属于放线菌目
中的小单孢菌属。
3　讨论
通过试验得到 X46菌株在改良的高氏 I号液体培养基
上 , 300ml三角瓶装液量 30 ml,初始 pH值 6.0 ～ 6.5,采用
10%接种量 , 180r/min28℃发酵 120h即可使毒素产生量最
大;当使摇床转速提高到 250 r/min,装液量也提高到 60 ml
时 ,其他条件不变 ,可以取得与最佳条件下类似的结果 。这
说明毒素的产生是伴随菌株的生长而存在的 ,在一定程度上
有量的积累。
迄今尚未见关于放线菌用于生物除草剂产生致病毒素
的正式研究报道 [ 8] 。这是因为微生物除草剂的研究主要集
中于真菌领域孢子制剂的研制 [ 9] ,从而能在市场开发中尽快
形成产品;放线菌的致病机理研究还没有全面展开 ,只能从
一些细菌 [ 3]和真菌病原菌毒素的研究中加以借鉴 ,而且毒素
的研究有其固有的困难 [ 10] 。目前 ,虽然科学工作者们不断
努力研究开发 ,但总的来说 ,这一研究工作取得的成就是相
当缓慢的。
毒素的抑制作用往往只是致病过程中的一个方面 ,该物
质可能是杂环酰亚胺类化合物 [11] ,活性成分的提取和检验有
待进一步研究。放线菌杀草方式是多种多样的 ,从笔者研究的
效果看 ,该菌可以分解利用纤维素 ,从与杂草根部接触的效果
和子叶的幼苗期接触效果来看 ,可以作为生防潜力菌;另一方
面 ,它们也可以对根部产生强烈的抑制 ,引起根的生长点和芽
的生长点细胞的变形 、萎缩和停止分裂 ,这说明毒素的作用是
全方位的 [ 12] ,为将来进一步的研究奠定了基础。
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(上接第 16912页)
含量为蚕蛹﹥金龟子 ,但铜 、钴等微量元素含量则是金龟子
﹥蚕蛹 ,这说明以上 2种昆虫作为食品在矿质元素营养方面
是各有优点的 。
表 4　暗黑鳃金龟子和蚕蛹的营养元素比较
Table4　ComparisonofnutrientelementsbetweenHolotrichiaparallela
Motschulskyandsilkwormchrysalis
元素Elem-ents
金龟子Holotrichiaparalela
蚕蛹Silkwormchrysalis
元素Elem-ents
金龟子Holotrichiaparallela
蚕蛹Silkwormchrysalis
Na 213.4 59.6 Cr 0.057 0.077Mg 534.666 927.8 Co 0.534 0.005K 2 851 3 810.667 Ni 1.006 未检出
Ca 247.167 222.1 Mo 0.246 0.031Fe 71.095 18.319 V 0.047 0.001Cu 8.770 3.406 Al 21.312 0.712
Zn 38.452 40.17 Sb 0.006 0.004Se 0.108 0.150 Ba 2.893 0.454
3　讨论
暗黑鳃金龟成虫的基本营养成分检测采用了 2010年我
国最新的国家标准检测方法 ,其中蛋白质的测定采用了杜马
斯燃烧法。该研究还采用微波消解法 -电感耦合等离子体
质谱 ICP-MS法测定了暗黑鳃金龟成虫所含的金属元素种类
和浓度。
暗黑鳃金龟成虫蛋白含量高 ,含丰富的粗纤维和矿质元
素 ,并且重金属等有毒元素含量在限量以内。所以 ,笔者认
为暗黑鳃金龟成虫可以作为一种安全的食品 ,营养丰富;如
果将捕捉或饲养的金龟子成虫烘干粉碎后添加到动物饲料
中 ,不但能提高饲料的蛋白含量和矿物质含量 ,而且粗纤维
对反刍动物非常有利。由此可见 ,暗黑鳃金龟成虫可以作为
良好的食用昆虫和饲用昆虫 ,具有极大的开发潜力。
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