全 文 ：988 － 993
06 /2015
草 业 科 学
PＲATACULTUＲAL SCIENCE
32 卷 06 期
Vol． 32，No． 06
DOI:10． 11829 \ j． issn． 1001-0629． 2014-0447
陈艳，高利媛，马腾，高文娜，贺佳，刘兴亮，郭巍，边勇．高羊茅根际一种短体线虫的分离与鉴定［J］．草业科学，2015，32(6):988-993．
CHEN Yan，GAO Li-yuan，MA Teng，GAO Wen-na，HE Jia，LIU Xing-liang，GUO Wei，BIAN Yong． Identification and separation of
Pratylenchus from root of Festuca elata［J］． Pratacultural Science，2015，32(6) :
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毥
988-993．
动物
生产层
高羊茅根际一种短体线虫的
分离与鉴定
陈 艳1，高利媛1，马 腾2，高文娜2，贺 佳1，刘兴亮2，郭 巍1，边 勇2
(1．北京农学院，北京 102206;2．北京出入境检验检疫局，北京 100026)
摘要:高羊茅(Festuca elata)是草坪草中绿期最长的一个草种，在草坪建植中具有重要作用。一些病害随着高羊
茅种植范围的不断扩大而逐渐频发，对草坪造成极大经济损失。本研究通过调查北京市高丽营镇高羊茅斑块状
枯死的原因发现，导致高羊茅枯死的是高羊茅根际优势植物寄生线虫。采用贝尔曼漏斗法分离了侵染北京地区
高羊茅上的线虫，结合唇环、受精囊、食道、V值等形态学鉴定方法，证明高羊茅草根际优势植物的寄生线虫均为
一种短体线虫，确定为斯克里步纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)。线虫 ITS和 28S序列的 PCＲ扩增及 GenBank
序列比对后发现，其与国外发现的 P． agilis及 P． scribneri序列相似度为 93%，亦确证该线虫为斯克里步纳短体线
虫。
关键词:高羊茅;斯克里步纳短体线虫;分离鉴定
中图分类号:S435． 4 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2015)06-0988-06*
Identification and separation of Pratylenchus from root of Festuca elata
CHEN Yan1，GAO Li-yuan1，MA Teng2，GAO Wen-na2，HE Jia1，
LIU Xing-liang2，GUO Wei1，BIAN Yong2
(1． Beijing university of Agriculture，Beijing 102206，China;
2． Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China)
Abstract:Festuca elata is one of turfgrass species with longer green period and is very important in the construction
of ecological environment． However，some diseases frequently occur and bring heavy economical loss to the lawn
with the extended of tall fescue growing regions． In the present paper，an investigation about the reasons of dead
patches in tall fescue lawn in Beijing＇s Gaoliying Town suggested that the predominant parasitic nematodes of tall
fescue＇s rhizosphere were the primary cause of mortality． The parasitic nematodes isolated from tall fescue using the
Behrman funnel method were short body nematodes with over 100 per 100 mL soil samples of population density．
The parasitic nematodes were further identified as Pratylenchus scribneri based on morphology characteristics inclu-
ding esophagus，lip annulus，spermatheca，stylet length and V value． The internal transcribed spacer (ITS)region
of rDNA was amplified from genomic DNA and sequenced． The sequence had 93% similarity with the species of P．
agilis and P． scribneri in Genebank which confirmed the nematode was P． scribneri． To best of our knowledge，this
* 收稿日期:2014-10-08 接受日期:2015-01-12
基金项目:国家质检总局科技计划项目“进境牧草种子真菌筛查技术研究初探”(2015IK021) ;北京出入境检验检疫局科技计划项目“北
京地区进境植物繁殖材料隔离检疫模式适用与推行初探”(2013BK008) ;北京市农业技术试验示范项目(20140128)
第一作者:陈艳(1972-) ，女，陕西西安人，讲师，博士，主要从事植物保护研究。E-mail:cheny@ bua． edu． cn
共同第一作者:高利媛(1993-) ，女，北京人，在读本科生，主要从事植物保护研究。E-mail:708859234@ qq． com
通信作者:郭巍(1971-) ，女，黑龙江绥化人，教授，博导，博士，主要从事植物保护研究。E-mail:guowei@ hebau． edu． cn
边勇(1981-)男，陕西延安人，农艺师，硕士，主要从事植物线虫检疫工作。E-mail:biany@ bjciq． gov． cn
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is the first report that P． scribneri cause tall fescue patchy disease in China．
Key words:Festuca elata;Pratylenchus scribneri;separation;identification
Corresponding author:GUO Wei E-mail:guowei@ hebau． edu． cn BIAN Yong E-mail:biany@ bjciq． gov． cn
目前草坪在城市的绿化事业进程中发挥着净化
空气、优化环境和提供优质运动场所等重要作用，因
此，草坪渐渐成为现代生活中不可或缺的部分［1］。
我国的草坪业亦呈现出迅速发展的趋势，对草坪草
的需求量越来越大。高羊茅(Festuca elata)作为常
见的草坪草中绿色周期最长的一个冷季型草种，目
前已成为我国首选草坪草植物。然而，随着高羊茅
草坪草种植规模的不断扩大，各种病虫害逐渐突出，
导致高羊茅草坪外观质量下降，成为制约这一产业
发展的限制因素之一［2］。
在我国，关于草坪草病害的报道主要集中在褐
斑病、锈病等真菌病害，而关于植物寄生线虫危害草
坪草的研究相对较少。在美国等一些草业较为发达
的国家，植物寄生线虫一直都是十分重要的草坪草
病害之一，美国草坪草的常见致病线虫主要有拟毛
刺线虫属(Paratrichodorus)、剑线虫属(Xiphinema)、
长针线虫属(Longidorus)、胞囊线虫属(Heterodera)、
根结线虫属(Meloidegyne)、假根结线虫属(Hypaso-
perine)、环纹线虫属(Macropasthonia)、针线虫属
(Paratylenchus)、根腐线虫属(Proatylenchus)、刺线
虫属(Belonolaimus)、锥线虫属(Dolichorus)、矮化线
虫属(Tylenchorhynochus)、螺旋属(Helicotylenchus)
和枪线虫属(Hoploaimus)等［3］。目前，国内已报道
的危害草坪草根际的短体线虫主要包括矮化线虫
属、小环线虫属(Criconemella)、短体属(Pratylen-
chus)、螺旋属和毛刺属(Trichodorus)内的线虫［4］
等。国内危害草坪草的线虫研究工作仍不深入，但
植物根际线虫的危害不可小觑，其主要是在植物根
部取食，给植物造成伤口从而引起细菌、真菌病害的
传播，引起植物的枯黄、腐烂等症状［5-6］。
为了鉴定引起高羊茅斑块状枯死的原因，本
研究调查北京市高丽营镇种植高羊茅的土壤，对
高羊茅根际优势植物寄生线虫进行分离;并进一
步通过形态学结合分子生物学方法对该线虫进行
鉴定，以期明确该线虫的种类，为进一步防治该病
害提供基础。
1 材料与方法
1． 1 样品的采集
样品土壤采集于北京市顺义市高丽营镇草地，
时间为 2014 年 6 月;采集选取长势较弱，出现斑点
枯萎的高羊茅草坪草，收集其根际土及草根;采样点
面积约 1 万 m2，采取“Z”字形多点取样法，收集距地
表 15 cm左右深度的土样;每个样品(土壤 +草根)
鲜重袋为 1 kg，含有 20 个采样点混合均匀的土样，
每个采样点 50 g土样。
1． 2 线虫的分离
土壤线虫的分离采用贝尔曼漏斗法分离［7］，即
取直径约 20 cm 的连接一段乳胶管的漏斗，用止水
夹控制胶管关闭;漏斗内先注入 2 /3 的清水后，取高
羊茅根际土样 200 g，用两层纱布包住土样并轻放于
漏斗中，使水漫过，浸透;待 24 h 后，取洁净的玻璃
器皿收集 10 mL分离获得的线虫悬浮液。
1． 3 线虫形态学鉴定
在显微镜下挑出形态大小一致的线虫置于滴有
少许蒸馏水的载玻片上，用酒精灯加热 2 ～ 3 s 杀死
线虫;然后将线虫依次用挑针排列整齐，盖上盖玻
片，用指甲油封片［8］。于光学显微镜下对线虫形态
及其内部特征观察、测量和拍照。最后，从中随机选
取 10 条成虫，用 Deman 公式［8］对挑取的被测成虫
进行形态测计。
1． 4 线虫的分子鉴定
1． 4． 1 单条线虫 DNA 的提取 根据王江岭等［9］
的方法，取 200 μL的 PCＲ管，内置 5 μL 10 × PCＲ
buffer与 10 μL 超纯水，并将经过 dd H2O 反复漂
洗的线虫挑入 PCＲ 管中。先将 PCＲ 管置于离心
机中离心 120 s，然后液氮冷冻 PCＲ 管底 2 ～ 3
min、85 ℃加热 2． 5 min后，向管中加入 1 μL 的蛋
白酶 K，将 PCＲ管置入 PCＲ仪中 56 ℃、30 min，95
℃、10 min;最后将 PCＲ 管置于离心机 12 000
r·min － 1离心 120 s，离心过后取上清液直接用于
PCＲ扩增。
1． 4． 2 PCＲ 扩增 线虫 DNA 的 PCＲ 扩增方法见
De Luca 和 Ｒeyes［10］的报道。反应在 mastercycler
(Eppendorf)上进行，ITS 区序列扩增反应体系(50
μL) :10 × PCＲ buffer 5 μL，10 mmol·L －1 dNTP 1
μL，10 μmol · L －1 的上 /下游引物各 3 μL，5
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U· μL －1 Taq DNA 聚合酶 0． 6 μL，线虫粗提液 5
μL ，加纯净水定容至 50 μL。
ITS 区 序 列 上 游 引 物 为 ITS1:5’-TTGAT-
TACGTCCCTGCCCTTT-3’，下游引物为 ITS2:5’-
GCTGCGTTCTTCATCGAT-3’［11-12］;反应条件为:94
℃ 4 min;94 ℃ 40 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1． 5 min，36
个循环;72 ℃，8 min。
28S rDNA D2D3 区序列上游引物为 D2A:5’-
ACAAGTACCGTCAGGGAAAGTGG-3’，下游引物为
D3B:5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’［13］;反应条
件为:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1
min，37 个循环;72 ℃，8 min。
PCＲ结束后，取 5 μL产物于 1． 2%的琼脂糖凝
胶电泳 25 min，采用凝胶成像系统成像，观察电泳结
果，拍照并记录。挑取阳性条带的产物于北京六合
通公司测序。将测序的结果在 GenBank 中进行同
源性比对，并从比对的结果中分别选取同源性较高
的 18 种短体属线虫的 rDNA ITS 区和 15 种短体属
线虫的 D2D3 区序列进行系统发育分析，选取 Bur-
saphelenchus xylophilus 序列作为外群(Outgroup)对
照，并通过软件 MEGA4． 1，选用临接法(Neighbor-
Joining)距离模型进行系统发育树分析，并应用自展
法(Bootstrap)检验系统树的可靠性，自展数据集为
800 次［14］。
2 结果与分析
2． 1 形态学鉴定
2． 1． 1 形态学描述 通过在显微镜下观察高羊茅
草坪草根际分离的线虫形态发现(图 1) ，雌虫温热
杀死后体略向腹面弯曲;侧区 4 条侧线，中间宽，两
边窄，从口针基球延伸到尾端;唇区较低，唇环两条，
基环高于顶环，唇区缢缩明显;头架发达，深度骨化;
口针发达，口针基部球圆形，长15 ～ 16μm;中食道
图 1 草坪草根际短体线虫形态图
Fig． 1 Morphological photographs of Pratylenchus from turfgrass
注:A，阴门;B，头部;C，尾部;D，雌虫成虫;E，食道。
Note:A，vulva;B，stylet;C，tail;D，femail adult;E，oesophagus．
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球卵圆形，宽约占该处体宽的 2 /3;食道腺从腹面和
侧面覆盖肠的前端;阴门偏前，V 值为 77% ～ 79%;
排泄孔在食道一肠瓣门的前方;后尾端光滑无纹，尾
环数为 18 ～ 19。未发现雄虫。
2． 1． 2 形态测计值 从北京市顺义区高羊茅草坪
草根际分离的短体线虫，形态特征和测计值与
Loof［15］和 Hashim［16］等的描述最为接近(表 1)。故初
步将其鉴定为斯克里步纳短体线虫 Pratylenchus scrib-
neri。
2． 2 分子生物学特征
2． 2． 1 rDNA ITS区序列特征 分别将 3 条线虫的
PCＲ产物进行测序［17］。除去两端 18S 和 28S 序列
后，得到片段大小约为 750 bp的 3 条序列［17］。将 3
条序列与 NCBI 数据库中的序列比对后发现，这 3
条线虫的 ITS 区序列与 Pratylenchus agilis(编号为
JQ039330)及 P． scribneri(编号为 JX04693)序列相
似度为 93% (目前业内已经认同 P． agilis 与
P． scribneri为同一种类的同物异名［18］) ，本研究将
这两种按同一种类处理)。系统发育分析也可以看
出(图 2) ，本研究发现的短体线虫种类与 P． scribne-
ri聚为一组。
2． 2． 2 D2D3区序列特征 分别将 4 条线虫的 PCＲ
产物进行测序，得到 D2D3 区序列片段长度约为 760
bp的4条序列，通过NCBI比对，与编号为JX047002、
表 1 Pratylenchus北京群体与已报道种群测计值比较
Table 1 Comparative measurements of females Pratylenchus
between Beijing and reported population from turfgrass
测计值
Measurement
北京种群
Beijing
population
参考文献 Ｒeference
Loof［15］ Hashim［16］
n 10 7 11
L 0． 44 ～ 0． 55 0． 42 ～ 0． 52 0． 41 ～ 0． 54
a 23． 30 ～ 25． 9 22． 00 ～ 30． 0021． 80 ～ 25． 20
b 5． 10 ～ 6． 2 4． 60 ～ 6． 30 4． 70 ～ 7． 30
b’ 3． 90 ～ 4． 6 3． 20 ～ 4． 60 4． 10 ～ 5． 60
c 14． 00 ～ 18． 0 14． 00 ～ 22． 0017． 20 ～ 21． 50
c’ 2． 30 ～ 3． 30 2． 10 ～ 2． 70 2． 10 ～ 3． 00
V 77． 00 ～ 79． 0 72． 00 ～ 79． 0075． 00 ～ 79． 00
St 14． 00 ～ 16． 0 15． 00 ～ 16． 0014． 50 ～ 15． 00
注:n为数量;L为体长(mm) ;a为体长 /最大体宽;b 为体长 /体前端
至食道与肠连接处的距离;b’为体前端至食道腺末端的距离;c为体
长 /尾长;c’为体长 /肛门处体宽;V 为体前端至阴门的距离 × 100 /
体长;St为口针(μm)。
Note:n，number;L，body length(mm) ;a，body length /maximum body
width;b，body length / the distance from body front to esophagus and in-
testines junction;b’，the distance of body front to the end of the esopha-
gus gland;c，body length / tail length;c’，body length / anus body
width;V，the distance of body front to vulva × 100 /body length;St，sty-
let (μm)．
图 2 基于 rDNA ITS 区序列的临接法(NJ)构建系统发育树
Fig． 2 Phylogenetic relationships tree by Neighbor-Joining (NJ)using ITS rDNA sequences
注:图中 1，2，3 为本研究基于 rDNA ITS 区序列所获得的线虫序列编号。
Note:The 1，2，3 sequence number of nematode were obtained by using ITS rDNA sequences in the research．
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Eu130865、AF170444、DQ498832的 P． scribneri序列相
似度为 97% ～99%;系统发育分析与 ITS 区分析结果
基本一致，4 条序列都聚在 P． scribneri 组群中，与其
他种短体线虫差异明显(图 3)。
图 3 基于 rDNA D2D3 区序列的临接法(NJ)构建系统发育树
Fig． 3 Phylogenetic relationships tree by Neighbor-Joining (NJ)using D2D3 rDNA sequences
注:图中 1，2，3，4 为本研究基于 rDNA D2D3 区序列所获得的线虫序列编号。
Note:The 1，2，3，4 sequence number of nematode were obtained by using D2D3 rDNA in the research．
通过 Blast和系统进化分析，进一步验证了形态
学鉴定的结果，该线虫为斯克里步纳短体线虫
P． scribneri。
3 讨论与结论
近几年来，全国对生态保护、环境建设和城市绿
化美化的关注持续增加。而作为重要物质基础的牧
草和草坪草种子，其需求量逐年增加。植物寄生线
虫作为植物主要病原物之一，其对植物的危害程度
超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。据统计，植物线
虫病每年约造成 1 000 亿美元的损失，损失率高达
12． 3%［19］。植物寄生线虫不仅对寄生植物造成直
接危害，而且也可直接传播细菌和病毒，对农林业的
生产造成巨大危害，成为制约农林业发展的主要因
素。我国目前对于草坪草的植物线虫病害的研究仍
不够深入，包括对草坪中的植物线虫的种类鉴定，而
植物病原线虫的准确鉴定是植物病害高效治理的前
提。相比之下，国外针对植物线虫的病害研究相对
深入，早在 19 世纪初就将植物线虫病害作为主要的
植物病害之一［8］，并通过对草坪线虫的种类鉴定来
达到草坪病害的预防和防治的目的。本研究在北京
市顺义区高羊茅首次发现了斯克里步纳短体线虫
P． scribneri，可以为今后的线虫防治工作提供可靠
的理论依据。
斯克里步纳短体线虫 P． scribneri 属短体线虫
属中分布相对广泛的种类之一。该属线虫主要危害
植物根系部位，在植物根系部位取食，并通过伤口引
起其他真菌、细菌病害的复合侵染，严重时会引起根
系的腐烂，导致植物死亡。该属线虫寄主范围广，而
且世代短、繁殖快，不易被识别，该线虫造成的危害
不可小觑。Loof［15］、Thorne 和 Malek［20］、Loof［21-22］、
高学彪等［23-24］、段玉玺等［25］先后对其进行过描述。
已有的报道表明，该线虫在我国的寄主主要为大豆
(Glycine max)、马铃薯(Solanum tuberosum)、高粱
(Sorghum vulgare)、小米(Panicum miliaceum)、小麦
(Triticum aestivum)、番茄(Solanum lycopersicum)和
油菜(Brassica campestris)等［11］，但寄生在草坪草根
部的斯克里步纳短体线虫目前尚无报道。
本研究从高羊茅草坪草根际分离得到的短体线
虫种群，其形态及测计值与斯克里步纳短体线虫最
为接近，其 D2D3 区序列比对显示与 GenBank 中已
登记的多条 Pratylenchus scribneri 序列相似度为
97% ～99%，系统进化距离较近，显示其为斯克里步
纳短体线虫，但与此同时，ITS 区序列比对结果显示
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其与已登记的 P． scribneri 种类也存在一定的差异，
这可能属于地理种群或不同寄主生境下的种群变
异，笔者将针对此做后续研究。
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(责任编辑 武艳培)
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