全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 4期，第 673-677页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.4, 673-677
研究报告
Research Report
拒盐型盐生植物小花碱茅肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
王生银 1 张永超 1 李莉 2 张金林 1* 王春梅 3 郭强 1 包爱科 1
1兰州大学草地农业科技学院,农业部草地农业生态系统学重点开放实验室,兰州, 730020; 2新疆畜牧科学院草业研究所,乌鲁木齐, 830000; 3
中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,兰州, 730050
*通讯作者, jlzhang@lzu.edu.cn
摘 要 本研究根据其它植物 Actin基因的保守序列设计一对简并性引物，以拒盐型盐生植物小花碱茅根
部总 RNA为模板，采用 RT-PCR的方法扩增出 Actin基因片段并克隆到 PUCm-T载体，阳性克隆经 PCR
检测后进行测序，在 GenBank中注册；序列分析结果表明：该片段长约 600 bp，编码 198个氨基酸；所得序
列与 GenBank中注册的其它植物 Actin基因序列同源性均在 84%以上，与其它肌动蛋白的氨基酸序列同
源性达 94%以上。
关键词 小花碱茅,肌动蛋白基因,克隆,序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Actin Gene Fragment from Salt-Exclusion
Halophyte Puccinellia tenuiflora
Wang Shengyin 1 Zhang Yongchao 1 Li Li 2 Zhang Jinlin 1* Wang Chunmei 3 Guo Qiang 1 Bao Aike 1
1 Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystem, Ministry of Agriculture, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University,
Lanzhou, 730020; 2 Grassland Research Institute, Xinjiang Animal Science Academy, Urumqi, 830000; 3 Cloning and Characterization of a Pericarp-
and Testa-Specific, Developmentally Regulated Genes in Peanut, Lanzhou, 730050
* Corresponding author, jlzhang@lzu.edu.cn
DOI: 10.3969/gab.028.000673
Abstract In this paper degenerate primers were designed based on the conserved sequences of the Actin gene
from other plants. Total RNA was extracted from the roots of Puccinellia tenuiflora. Actin gene fragment was ob-
tained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into PUCm-T vector. The positive
clone identified by PCR was sequenced and registered in GenBank. The sequencing result revealed that the Actin
gene fragment from Puccinellia tenuiflora contains about 600 bp, encoding 198 amino acids. Homology compari-
son with Actin gene sequences of other plants in the GenBank and with other Actins showed that it shared over
84% nucleotide sequence homology and 94% amino acid sequence homology.
Keywords Puccinellia tenuiflora, Actin gene, Cloning, Sequence analysis
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000673
基金项目：本研究由国家科技支撑计划课题(2008BADB3B01)、国家自然科学基金项目(30700562; 30671488)、教育部本科教学
质量工程草业科学特色专业建设项目(TS2410)、高年级本科生创新能力支持项目和创新人才试验区建设项目共同资助
肌动蛋白(actin)是真核生物中普遍存在的一种
重要的蛋白质。植物肌动蛋白是单一多肽链的球状
蛋白，由 375~377个氨基酸组成，分子量为 42 kD (陈
颖等, 2003)。在高等植物的花粉、茎韧皮部、叶表皮
细胞、叶鞘细胞、根毛、卷须、内果皮和茎形成层等组
织中都已鉴定出肌动蛋白。通过利用特异的肌动蛋
白抑制剂及对微丝定位的研究，已经了解植物肌动
蛋白的基本功能：参与细胞分裂、细胞运动、细胞迁
移、细胞形态维持、细胞生长、内吞和外排作用以及
其它重要生理事件(王洪振和程焉平, 2005; Cheung
and Wu, 2004)。以植物肌动蛋白为主形成的动态微
丝骨架系统已成为植物细胞生物学研究领域的热点
之一(Wasteneys and Galway, 2003)。
截止目前，已从许多高等植物，包括水稻(Oryza
Sativa, AY212324 和 CT831215)、大麦(Hordeum vul－
gare, AK251023)、毒麦(Lolium temulentu, EU328529)、
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
玉米(Zea mays, EU967073)、谷子(Setaria italica, AF2-
82625)、刚竹(Phyllostachys bambusoides, EU009452)、
拟南芥(Arabidopsis thaliana, AY096397)、白杨(Populus
tomentosa, EF418792)、玉兰(Magnolia denudate, AF2-
81323)、花生(Arachis hypogaea, DQ873525)、霸王(Zy－
gophyllum xanthoxylum, EU019550)、地黄(Rehmannia
glutinosa, EU526396)、碱蓬(Suaeda glauca, EU429457)和
白沙蒿(Artemisia sphaerocephala, FJ587512 and FJ5-
15905)等中克隆到了 Actin基因。Actin作为真核细胞
中普遍存在的高度保守的古老蛋白之一，各种生物
间肌动蛋白氨基酸序列的同源性可高达70%~100%，
其基因可以作为真核细胞生理过程的管家基因(王
洪振和程焉平, 2005)；管家基因因其在各种组织中
表达恒定，可作为标准参照物用来比较样本来源不
同的目的基因表达量的差异(陈颖等, 2003)。
小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)是禾本科碱茅，
属多年生草本植物，是优良的牧草，耐盐碱、抗寒、耐
旱性极强，广泛分布于我国东北和西北地区的盐碱
地；其根部对 K+/Na+选择性吸收能力很强，约是小麦
的 2倍(Wang et al., 2004; Wang et al., 2009)；小花碱
茅所具有的极强耐盐碱特性已受到人们的广泛关
注。要深入研究小花碱茅的抗逆机制，必须深入分析
其抗逆功能基因。有鉴于此，本研究以小花碱茅幼苗
为材料，用 RT-PCR方法克隆小花碱茅 Actin基因片
段，并进行序列分析，为研究其它重要抗逆功能基因
在小花碱茅中的表达和调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)种子于 2007 年
7月采自河西走廊张掖市临泽县。植物材料为 4周龄
幼苗的鲜根，用于总 RNA的提取。大肠杆菌菌株 E.
coli. DH5α由本实验室保存。
1.2 主要试剂
UNIQ-10柱式 Trizol总 RNA抽提试剂盒(San-
gon, Shanghai)、MMLV第一链 cDNA合成试剂盒(BBI,
Canada)、PCR 扩增试剂盒(Sangon, Shanghai)、DNA
凝胶回收试剂盒(Omega bio-tek)、PCR产物克隆试剂
盒(Sangon, Shanghai)，DNA marker (北京天根)，其它
生化试剂均为进口或国产分析纯产品。
1.3引物设计与合成
Actin引物：通过已经克隆出来的植物 Actin基因
的核苷酸序列进行同源性比较，找出高度保守的区
段，根据同源性高和简并性低的原则，利用 DNAMAN
和 Primer 5.0生物软件设计一对简并引物 P1、P2，用
于扩增小花碱茅 Actin基因片段，推测目的片段的长
度为 598 bp。引物由上海生工合成。
P1：5-GTGGTCGTACAACWGGTATTGTG-3；
P2：5-GCHCCTCCAATCCAGACACTG-3；其中W=
A、T，H=A、C、T。
1.4总 RNA的提取
小花碱茅根总 RNA提取方法按照试剂盒说明
书进行。将提取到的总 RNA在使用和保存之前进行
检测，通过甲醛变性凝胶电泳检测其完整性；使用
NanoDrop 1 000核酸检测仪，根据OD值鉴定所提RNA
的纯度(若 OD260/OD280的比值在 1.8~2.0,则说明 RNA
无杂质污染)及浓度；并依照测定出的 RNA产量来确
定下一步实验中合成 cDNA所需模板的用量。
1.5 RT-PCR扩增
cDNA第一链合成按照试剂盒说明书进行。PCR
反应体系：在 200 μL PCR管中加入下列组分：Steril-
ized ddH2O 30.5 μL、MgCl2 (25 mmol/L) 3 μL、10×PCR
Buffer 5 μL、dNTP(2 mmol/L) 5 μL、P1 (10μmol/L) 1 μL、
P2 (10 μmol/L) 1 μL、cDNA 4 μL和 Taq DNA polym-
erase (5 U/μL) 0.5 μL，总体积为 50 μL。PCR反应：
94℃预变性 2 min；94 ℃变性 30 s、56℃退火 45 s、
72℃延伸 45 s，30个循环；最后 72℃延伸 10 min。
PCR扩增产物用 1.2%琼脂糖凝胶检测，目的片
段回收和纯化按照 UNIQ-10柱式 DNA胶回收试剂
盒操作说明进行。
1.6阳性克隆的筛选与鉴定
将回收的 PCR产物连接到 PUCm-T载体，转化
感受态大肠杆菌，用含有 50 μg/mL氨苄青霉素的
LB固体培养基进行蓝白斑筛选，阳性克隆经质粒
PCR鉴定确认后，送至上海生工进行测序。
1.7序列的生物信息学分析
序列的比较、翻译和作图等在 DNAMAN生物
软件上进行，Blast 搜索在 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST)网站上进行。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增
以小花碱茅根系为材料提取的总 RNA经过甲醛
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DOI: 10.3969/gab.028.000673674
变性凝胶电泳检测结果显示 28S rRNA和 18S rRNA
条带清晰(图 1)，前者亮度约是后者的 2倍，说明所
提取的 RNA完整性较好；经 NanoDrop 1000核酸蛋
白检测仪测得 OD280/OD260平均值为 1.95，表明 RNA
纯度较高，可用于 RT-PCR扩增。以总 RNA反转录所
得到的第一链 cDNA为模板，用 Actin基因的简并性
引物 P1和 P2进行 PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳
后，用大小为 600 bp的Marker凝胶成像分析系统(美
国 Alpha公司)检测发现约在 600 bp处有一条亮带，
且上下无杂带，与推测的目的片段的大小一致(图 2)，
可能是 Actin基因片段，有待进一步鉴定。
2.2 阳性克隆的鉴定
将回收纯化的目的片段连接到 PUCm-T克隆载
体上，转化 E. coli. DH5α。从转化的平板上随机挑取
10个阳性克隆。随后从这些克隆中任选 2个提取质
粒，进行 PCR扩增，同 RT-PCR扩增一样，用大小为
600 bp的Marker通过凝胶成像分析系统(美国 Alpha
图 1小花碱茅根系总 RNA的甲醛变性凝胶电泳
Figure 1 Formaldehyde denaturalization agarose gel electrophore-
sis of total RNA from roots of Puccinellia tenuiflora
图 2 RT-PCR产物凝胶电泳
注: M: 100 bp DNA marker; 1~4: Actin 基因的 PCR产物
Figure 2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of Actin
gene
Note: M: 100 bp DNAmarker; 1~4: PCR products ofActin gene
图 3阳性克隆的 PCR鉴定
注: M: 100 bp DNA marker; 1,2:阳性克隆
Figure 3 PCR analysis of positive clones
Note: M: 100 bp DNA marker; 1,2: Positive clones
图 4小花碱茅 Actin基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
注:加框表示引物 P1、P2序列
Figure 4 The nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of Actin gene fragment from Puccinellia tenuiflora
Note: Boxed means sequences of the degenerate primers Pl and P2
拒盐型盐生植物小花碱茅肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
Cloning and Sequence Analysis of ActinGene Fragment from Salt-Exclusion Halophyte Puccinellia tenuiflora
公司)检测得到的扩增片段大小约为 600 bp (图 3)，
与 RT-PCR结果一致，表明这些克隆为阳性克隆，可
以进行测序。
2.3 序列分析
由图 4可见，阳性克隆测序得到一段 598 bp的
675
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
序列，编码 198个氨基酸。将该片段进行 Blast比对，
结果显示：该片段与其它植物的 Actin基因核苷酸序
列的同源性均在 84%以上，其中同源性最高的是燕
麦，为 91%；而与氨基酸序列的同源性达到 94%以
上，表明所克隆到的片段为 Actin 基因片段。将该基
因命名为 PtACT，并在 GenBank 注册，登录号为
FJ545641。
将推测的小花碱茅的 Actin 基因的氨基酸序列
片段和其它植物 Actin基因的氨基酸序列进行多重
比较(图 5)，结果发现它的保守氨基酸多达 183个，
而非保守氨基酸仅有 15个。这表明我们克隆的片段
为 Actin基因的高度保守区域。另外，由图 6可见，它
图 5 PtACT氨基酸序列片段与其它植物 Actin基因的氨基酸序列多重比较
注: Actin基因的来源和 GenBank登录号: PtACT (小花碱茅, FJ545641); PhbACT (刚竹, EU009452); OsACT (水稻, CT831215);
HvACT (大麦, AK251023); LtACT (毒麦, EU328529); ZmACT (玉米, EU967073)
Figure 5 Multiple comparison of amino acid sequence alignment of PtACT and other plants Actin
Note: The origins and GenBank accession of Actin gene: PtACT (Puccinellia tenuiflora, FJ545641); PhyACT (Phyllostachys bambu－
soides, EU009452); OsACT (Oryza sativa, CT831215); HvACT (Hordeum vulgare, AK251023); LtACT (Lolium temulentu, EU328529);
ZmACT (Zea mays, EU967073)
图 6 PtACT与其它植物 Actin基因的氨基酸序列同源性分析
Figure 6 Amino acid sequence homology analysis of PtACT and
other plants Actin
与水稻 OsACT 的同源性最高为 98.99%，与玉米
ZmACT的为 98.48%，与大麦 HvACT的为 97.98%，
与刚竹 PhbACT的为 96.97%，而和毒麦 LtACT的最
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低为 94.95%。
3讨论
众多研究表明，Actin基因不论在核苷酸还是氨
基酸水平上都具有高度的保守性和同源性。高等植
物 Actin基因 cDNA全长为 1 372 bp，开放阅读框长
1 131 bp (陈颖等, 2003)。本实验克隆到的 Actin基因
的片段为 598 bp。下一步工作可以根据我们克隆到
的小花碱茅 Actin基因片段设计特异性引物，采用
RACE方法克隆其全长。
本研究得到的小花碱茅的 Actin基因片段与其
它植物的 Actin基因核苷酸序列的同源性均在 84%
以上，而与氨基酸序列的同源性则在 94%以上，均高
于张一弓等(2009)从白沙蒿中克隆到的 Actin基因片
段与其它植物的同源性。小花碱茅作为耐盐碱性很
强的优良牧草，其本身蕴藏着丰富的抗逆资源；本研
究首次克隆了小花碱茅 Actin基因片段，不但丰富了
肌动蛋白研究的资料库，而且为进一步以 Actin基因
为内标参照来研究小花碱茅其它抗逆基因的功能打
下了坚实的基础。
致谢
在整个实验过程中得到了席杰军、伍国强、周向睿
和段娇娇等同学的大力支持和协助，在此表示感谢！
参考文献
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Cloning and Sequence Analysis of ActinGene Fragment from Salt-Exclusion Halophyte Puccinellia tenuiflora 677