全 文 ：研究报告doi: 10．3969 ／ j．issn．1009－0002．2011．03．005
几种南海芋螺二硫键异构酶的克隆及进化分析
李海鹰 1，2，刘珠果 2，蒋继志 1，戴秋云 2
1． 河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002； 2． 军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071
［摘要］ 目的：从来自中国南海的 4 种芋螺中克隆出包含完整 3＇ 和 5＇ 非翻译区的蛋白质二硫键异构酶（PDI）全基
因序列，并对其进行序列及进化分析。 方法：根据各种生物 PDI 基因的保守区域设计引物，利用 3＇ 和 5＇ cDNA 末端
快速扩增（RACE）方法克隆出 PDI 全基因序列，并通过生物信息学方法对各芋螺 PDI 序列进行分析。结果与结论：从
中国南海玉女芋螺、黑星芋螺、堂皇芋螺、桶形芋螺 cDNA 中克隆出包含有完整 3＇ 和 5＇ 非翻译区的 PDI 全基因序
列；分析结果表明各芋螺之间的同源性大于 90％，而与对虾、人类、酿酒酵母的同源性均小于 60％；各芋螺 PDI 与其
他生物的 2 个活性位点序列高度保守，而底物结合位点具有物种特异性，进化树显示各芋螺 PDI 的特征可能受其捕
食食性影响。
［关键词］ 芋螺；芋螺毒素；蛋白质二硫键异构酶；克隆；进化树
［中图分类号］ Q78 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009－0002(2011)03－0325－05
Cloning and Phylogenetic Analysis of Protein Disulfide Isomerases
from Several Conus Species in the South China Sea
LI Hai－Ying1,2, LIU Zhu－Guo2, JIANG Ji－Zhi1, DAI Qiu－Yun2
1． College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002;
2． Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071; China
［Abstract］ Objective: To clone and analyze entire nucleotide sequences of protein disulfide isomerase （PDI） of
four Conus from South China Sea． Methods: The entire nucleotide sequences of PDI of Conus from the South Chi-
na Sea were cloned by 3＇ and 5＇ rapid amplification of cDNA ends（RACE）, which primers were designed on con-
servative amino acid sequences of other PDI, and the sequences were analyzed by bioinformatics． Results ＆ Con-
clution: The homology of the deduced amino acid sequences among these Conus species was more than 90％, and
higher than that of the Litopenaeus vannamei, Homo sapiens and Saccharomyces cerevisiae． Two active sites of PDI
were highly conservative between Conus and other organisms, but the substrate binding sites were species specific．
Phylogenetic tree analysis showed that the mutants of PDI from Conus might be affected by their predator diet．
［Key words］ Conus; conotoxin; protein disulfide isomerase; cloning; phylogenetic tree
蛋白质二硫键异构酶 （protein disulfide iso-
merase，PDI） 可作为分子伴侣催化蛋白质分子内天
然二硫键的形成，重排错配二硫键 [1－2]。 大多数真核
细胞 PDI 含有 5 个结构域，从 5＇ 到 3＇ 依次为 a（41～
115 氨基酸残基）、b（120～217 残基）、b＇（219～350 残
基）、a＇（352～462残基）和 c（463～508残基）。其中，a、
a＇ 区域与硫氧还蛋白家族同源， 为氧化还原活性位
点（CGHC），C端携带驻留内质网的信号肽[3]。
芋螺毒素由热带海洋软体动物芋螺分泌 ，含
10～40 个氨基酸残基及 1～5 对二硫键 [4－5]，是目前发
现的二硫键最密集的多肽，其二硫键对维持芋螺毒
素的活性及结构稳定性具有重要作用 [6]。 近期从 2
种芋螺中分离得到 PDI 的 cDNA， 并发现其 PDI 可
体外催化芋螺毒素的二硫键形成 [7－9]。 然而，芋螺毒
素种类繁多，高度变异，各芋螺 PDI 特征及其之间
的关系还不清楚。 我们克隆了 4种来自中国南海芋
螺的 PDI 全序列， 包含完整的编码区及 3＇ 和 5＇ 非
翻译区， 分析了目前发现的芋螺 PDI 的序列相似
性、进化关系，以及与人类、酿酒酵母等 PDI 的差
异。该工作为深入研究芋螺二硫键异构酶的特性，探
讨芋螺毒素二硫键连接方式与芋螺 PDI 的关系奠
［收稿日期］ 2011－01－17
［基金项目］ 国家自然科学基金（9071028）；
国家高技术研究发展计划（2006AA09Z404）；
国家重点基础研究发展计划（2010CB529802）
［作者简介］ 李海鹰（1983－ ），女，硕士研究生
［通信作者］ 戴秋云，（E－mail）qy＿dai＠yahoo．com
生 物 技 术 通 讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．3 May, 2011 325
生 物 技 术 通 讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．3 May, 2011
定了基础。
1 材料和方法
1．1 材料
按我们先前报道的方法提取玉女芋螺（Conus
virgo）、黑星芋螺 （C．eburneus）、堂皇芋螺 （C．imperi-
alis）、桶形芋螺（C．betulinus）毒腺管 RNA[10－11]。 大肠
杆菌感受态 DH5α、PCR Mix、MakerⅢ均为天根生
化科技有限公司产品；PCR 扩增酶 La Taq、pMD18－
T 载体、3＇RACE 和 5＇RACE 试剂盒均为 TaKaRa 公
司产品；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均为广
州东盛生物科技有限公司产品。
1．2 引物设计与合成
从本课题组构建的黑星芋螺 cDNA 文库中，发
现了二硫键异构酶部分序列， 根据所测得的序列，
已报道的织锦芋螺（C．textile）、大理石芋螺（C．mar-
moreus）PDI 序列，以及人类等其他生物 PDI 基因序
列，设计了引物 P1、P2、P3和 P4，由北京奥科生物技
术有限公司合成。 巢式 PCR引物序列见表 1。
1．3 二硫键异构酶 3＇端 cDNA扩增
反转录产生 cDNA模板：取玉女、黑星、堂皇、桶
形芋螺总 RNA 各 1 μg， 按 3＇RACE 试剂盒推荐方
法进行。 反转录反应条件 ：42℃，60 min；70℃，15
min。
Outer PCR 反应： 取各芋螺反转录 cDNA 模板
3．5 μL，以 P1、P5为引物，按 3＇RACE 试剂盒推荐方
法进行。 PCR 扩增条件：94℃预变性 4 min，然后以
94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 42 s 进行 30 个循环，
最后 72℃再延伸 10 min。
Inner PCR 反应：取各芋螺第一次 PCR 扩增产
物 1 μL，以 P2、P6 为引物，按 3＇RACE 试剂盒推荐
方法进行。 PCR 扩增条件：94℃预变性 4 min，然后
以 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 42 s 进行 30 个循
环，最后 72℃再延伸 10 min。
反应结束后，取 6 μL PCR 反应液进行琼脂糖
凝胶电泳，确认 PCR 扩增产物，用凝胶回收试剂盒
纯化回收目的片段， 将回收产物与 pMD18－T 载体
连接，采用热激发转化到宿主菌大肠杆菌 DH5α，挑
取转化子进行菌液 PCR 鉴定，选择阳性克隆送华大
基因科技有限公司及天一辉远生物科技有限公司
进行测序。
1．4 二硫键异构酶 5＇端 cDNA扩增
取各芋螺总 RNA 各 2 μg，进行 5＇RACE 反应、
去磷酸化处理、去帽子反应。 5＇RACE Adaptor 的连
接、反转录均按 5＇RACE试剂盒推荐方法进行。反转
录反应条件 ：30℃ ，10 min；42℃ ，60 min；70℃ ，15
min。
Outer PCR 反应： 取各芋螺反转录 cDNA 模板
3．5 μL，以 P3、P7为引物，按 5＇RACE 试剂盒推荐方
法进行。 PCR 扩增条件：94℃预变性 4 min，然后以
94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 105 s 进行 30 个循环，
最后 72℃再延伸 10 min。
Inner PCR 反应：取各芋螺第一次 PCR 扩增产
物 1 μL，以 P4、P8 为引物，按 5＇RACE 试剂盒推荐
方法进行。 PCR 扩增条件：94℃预变性 4 min，然后
以 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 105 s 进行 30 个循
环，最后 72℃再延伸 10 min。
反应结束后，取 6 μL PCR 反应液进行琼脂糖
凝胶电泳，确认 PCR 扩增产物，用凝胶回收试剂盒
纯化回收目的片段， 将回收产物与 pMD18－T 载体
连接，采用热激发转化到宿主菌大肠杆菌 DH5α，挑
取转化子进行菌液 PCR鉴定、测序。
1．5 序列同源对比及进化分析
采用玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺 PDI 的全基因
序列与已公布的织锦芋螺、大理石芋螺、对虾、人类
及酿酒酵母的 PDI 基因序列， 用多序列排序软件
ClustalX1．83 进行排序，用 Jalview 软件分析同源性，
用 MEGA4．0 构建 Bootstrap Neighbor－Joining 进化
树。
2 结果
2．1 二硫键异构酶 3＇端 cDNA扩增及序列分析
表 1 PCR引物及序列
引物 序列
PDI 3＇RACE 上游外侧 P1
PDI 3＇RACE 上游内侧 P2
PDI 5＇RACE 下游外侧 P3
PDI 5＇RACE 下游内侧 P4
3＇RACE Outer Primer P5
3＇RACE Inner Primer P6
5＇RACE Outer Primer P7
5＇RACE Inner Primer P8
5＇－GGATTTCCTGGATGGGAAACTG－3＇
5＇－TGGTGTGGACACTGCAAGCAG－3＇
5＇－GAACACAAGTGCAGTCAGAC－3＇
5＇－GATGCCGATGACAGCTACAGT－3＇
5＇－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3＇
5＇－CGCGGATCCTCCACTAGTATTTCACTATAGG－3＇
5＇－CATGGCTACATGCTGACAGCCTA－3
5＇－CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG－3＇
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采用引物 P1、P2、P5、P6 进行巢式 PCR，扩增出
玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺 PDI 3＇ 端基因序列，电
泳检测扩增片段大小约为 600 bp，与预期片段大小
相符合（图 1）。 测序结果经 NCBI比对，证实各克隆
片段均为各芋螺相对应的 PDI基因的部分序列。 玉
女、黑星、堂皇及桶形芋螺 3＇RACE 片段长度分别为
561、560、568 及 550 bp，均含有 PDI 部分编码区序
列及完整的 3＇非翻译区。
2．2 二硫键异构酶 5＇端 cDNA扩增及序列分析
采用引物 P3、P4、P7、P8 进行巢式 PCR，扩增出
玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺 PDI 5＇ 端基因序列，电
泳检测扩增片段大小约为 1500 bp， 与预期片段大
小相符合（图 2）。 测序结果经 NCBI比对，证实各克
隆片段均为各种芋螺相对应的 PDI 基因的部分序
列。 玉女、黑星、堂皇及桶形芋螺 5＇RACE 片段长度
分别为 1565、1570、1578 及 1571 bp，均涵盖了 PDI
绝大部分编码区及完整的 5＇非翻译区。
2．3 玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺 PDI全序列分析
经过序列拼接， 玉女芋螺 PDI 基因全长 1787
bp，包括 5＇ 非翻译区（UTR）52 bp、3＇UTR 238 bp、
开放读框（ORF）1497 bp，编码含 498 个氨基酸残基
的酶蛋白。 黑星芋螺 PDI 基因全长 1792 bp， 包含
53 bp 的 5＇UTR、236 bp 的 3＇UTR 和 1503 bp 的
ORF，编码含 500个氨基酸残基的酶蛋白。堂皇芋螺
PDI基因全长 1803 bp， 其中含有 53 bp 的 5＇UTR、
241 bp 的 3＇UTR、1509 bp 的 ORF， 编码含 502 个
氨基酸残基的酶蛋白 。 桶形芋螺 PDI 基因全长
1780 bp， 含有 52 bp 的 5＇UTR、229 bp 的 3＇UTR、
1503 bp的 ORF， 编码含 500 个氨基酸残基的酶蛋
白。 4种芋螺 PDI C端都携带驻留内质网的信号肽
RDEL。
2．4 序列同源对比及进化分析
对玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺 PDI 的全基因序
列与已公布 的 织 锦 芋 螺 、 大 理 石 芋 螺 （ABF
48564．1）、 对 虾 （Litopenaeus vannamei） （CAN
89206．1）、人类（Homo sapiens）（NP 000909．2）及酿
酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）（EDV 09672．1）
的 PDI基因序列， 用多序列排序软件 ClustalX进行
排序，见图 3。几种生物 PDI的 2个活性中心高度保
守， 分别为 a 区域的 APWCGHCK 和 a＇ 区域的 AP-
WCGHCK，但活性中心的位置有所不同。 芋螺与对
虾、人较相近，a 区域的活性中心位于 49～57 氨基酸
残基，a＇ 区域的活性中心位于 389～401 氨基酸残
基。 酵母的 PDI 活性中心位置分别位于 57～65 和
402～410 氨基酸残基。 6 种芋螺 PDI C 端都携带驻
留内质网的信号肽 RDEL， 而人类所携带的为
KDEL、对虾为 KDEL、酵母为 HDEL，有 1 个氨基酸
的区别。
用 Jalview 软件分析了各生物编码区序列同源
性。 大理石芋螺 PDI与织锦芋螺－1、织锦芋螺－2、玉
女芋螺、黑星芋螺、堂皇芋螺、桶形芋螺的同源性分
别为 94．4％、94．4％、94．2％、94．4％、86．2％和 95．8％，
与对虾、人类、酿酒酵母 PDI 序列的同源性分别为
58．3％、59．2％和 29．7％。 人 PDI序列与各芋螺、对虾
PDI的同源性均在 55％左右， 而与酵母的同源性为
30．0％。 各芋螺的 3＇和 5＇非翻译区核苷酸同源性高
达 90％以上，而与对虾及人类的同源性不足 60％。
系统进化树（图 4）分析显示，酵母单独处于一
个进化分支，而几种芋螺与对虾及人类聚于另一个
大分支。说明芋螺与哺乳动物亲缘关系较近。织锦、
大理石芋螺 PDI 聚于一个分支，玉女、黑星、桶形芋
螺的 PDI 聚于另一分支，而堂皇芋螺处于以上分支
之外的另一分支。
3 讨论
芋螺毒素种类繁多， 不同芋螺所含的毒素不
同，同种芋螺因海域不同，毒素成分也存在差异。 芋
螺毒素的一级结构多变，富含二硫键，只有正确配
对的芋螺毒素才有生理活性。 PDI 可能有助于二硫
图 1 3＇RACE－PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
M：MarkerⅢ；1～4：分别为玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺第二轮 PCR产物
图 2 5＇RACE－PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
M：MarkerⅢ；1～4：分别为玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺第二轮 PCR产物
李海鹰等：几种南海芋螺二硫键异构酶的克隆及进化分析 327
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LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．3 May, 2011
键的正确形成，并适应芋螺毒素不同二硫键折叠的
特征。 经过多重序列比对， 几种生物 PDI的 a 和 a＇
区域活性中心的氨基酸序列高度保守， 这对保持
PDI的催化活性非常重要。 但不同生物的 PDI 的活
性中心位置有所不同， 如芋螺 PDI 与对虾 PDI、人
PDI活性中心位置相近， 酿酒酵母 PDI 的活性中心
位置稍有后移。 6 种芋螺 PDI 之间的种内同源性大
于 90％，但 111～113 残基存在显著差异，这可能与
各自芋螺体内的毒素构成有关系。
有证据表明，PDI 的 c 结构域结合多肽 [12]，该区
域距离 PDI 的 C 端约 50 个氨基酸。 几种芋螺的 c
区域底物结合部位十分保守，而与其他几种生物的
图 3 芋螺与其他生物的 PDI序列比对
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差别很大（图 4）。 6 种芋螺 C 端都携带驻留内质网
的特异信号肽 RDEL， 其保守性和特异性可能导致
PDI依靠信号肽进入内质网的过程也存在特异性。
玉女、黑星、堂皇、桶形芋螺 PDI 的 3＇ 和 5＇ 非
翻译区核苷酸序列高度保守，而与对虾及人类的同
源性不足 60％，存在物种特异性。 各生物 PDI 非翻
译区具有一些相同序列，这些序列可能保证非翻译
区发挥其基本功能，如维持 mRNA 的稳定、传递翻
译过程中的识别信息等。
织锦、大理石芋螺属于食螺芋螺，玉女、黑星、
堂皇及桶形芋螺属于食虫芋螺[13]。 进化分析表明芋
螺 PDI 的亲缘关系可能与其食性有关，同种食性的
芋螺 PDI 亲缘关系较近。 堂皇芋螺虽为食虫芋螺，
但它单独成一分支，其原因有待于进一步研究。
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图 4 芋螺与其他生物的 PDI进化树
李海鹰等：几种南海芋螺二硫键异构酶的克隆及进化分析 329