全 文 ：#综述与专论#
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
芋螺毒素基因资源研究进展
李宝珠 郑晓冬 高炳淼 陈琴 陈心 长孙东亭
胡碧煌 温珍昌 张英霞 李军 罗素兰
(海南大学热带生物资源教育部重点实验室,海口 570228 )
摘 要: 芋螺毒素和微生物的次生代谢产物与植物的生物碱一样, 具有生物多样性的特点。芋螺毒素特有的二硫键骨
架和化学修饰后特异的空间结构,使其具有特异的稳定性和药理学活性。对芋螺毒素基因的分析和新型基因的克隆筛选,是
深入研究各种受体、离子通道及其亚型, 进而在克隆表达的靶受体上设计和筛选高效新药的前提。芋螺毒素基因资源的研究
在芋螺毒素新基因及其编码产物毒素肽的发现与利用方面发挥了重要作用。现对该领域的新进展进行论述。
关键词: 芋螺毒素 基因资源 研究进展
Research Progress of Conopeptide Gene Resources
L iBaozhu Zheng X iaodong Gao B ingm iao Chen Q in Chen X in Zhangsun Dongting
H u B ihuang W en Zhenchang Zhang Y ingx ia L i Jun Luo Sulan
(Key Laboratory of T rop ical BiologicalR esources of M inistry of Education, H ainan University, H aikou 570228)
Abstrac:t Cono tox ins have the character istics o f h igh d iversity, like the secondary m etabo lites o f the m icroo rganism s and the alka-
lo ids o f the p lants. Because of the spec ific disulfide bonds and the spa tia l structure after chem ica lm odification, conopeptides have spe-
cific stab ility and pharm aco log ical activ ity. Conopeptide genespd iscove ry and ana ly sis a re the precond ition of no t on ly the intensive study
o f var ious recepto rs, ion channe ls and the ir subtypes, but also the design and screen ing o f the effec tive new drugs based on the expressed
receptors. The research o f the conopeptide gene resources p lays an im po rtant ro le in the d iscovery and utilization of nove l genes and co-
ded peptides o f the conotox ins. The resea rch prog ress o f the conopeptide gene resources w as d iscussed.
Key words: Conotox in Gene resources Research prog ress
收稿日期: 2010-07-12
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30860368 ), 国家 / 8630计划项目 ( 2007AA02Z114) , 重大新药创制国家科技重大专项课题 ( 2009ZX09103-
644 ) ,海南大学创新团队项目 ( hd09xm02) ,重点科研项目 ( hd09xm 15)
作者简介:李宝珠,女,硕士研究生,研究方向:海洋药物与生物技术; E-m ai:l baozhu613@ hotm ai.l com
通讯作者:罗素兰,女,教授,博士生导师; E-m ai:l luosu lan2003@ 163. com
芋螺毒素 ( conotox in, conopeptide, CTX )主要来
自分布于太平洋和印度洋热带海域中的腹足纲软体
动物芋螺的毒液中。每种芋螺含有约 1 000种毒素
肽,其中大多数都富含二硫键。每种芋螺毒液都含
有其独特的多肽,而不同种芋螺的毒液之间可能存
在少量的分子重叠。在全球 500- 700种芋螺中含
有约 50万 - 140万种芋螺毒素肽 [ 1, 2] , 但到目前为
止,研究者只发现了还不到这个数字的 0. 1%。基
于芋螺壳颜色样式的传统鉴别方法, 在许多情况下
不能清楚地在基因水平上区分不同种类的芋螺。因
此,最近研究数据显示,芋螺的种类可能被很大程度
地低估了 [ 3, 4]。所以芋螺毒素肽的种类可能应该比
预期的多得多。由此,芋螺毒液可以说是一个庞大
的天然活性多肽宝库 [ 5]。
芋螺毒素是一族种类丰富、大多由 7- 40个氨基
酸残基组成的神经肽,富含半胱氨酸, 具有高度保守
的二硫键骨架结构 [ 6]。芋螺毒素主要作用于细胞膜
上的各种离子通道和神经递质及激肽的受体,具有高
度的选择性和亲和力,可以作为神经科学中离子通道
和膜受体研究的配体工具,同时还可以被直接开发成
诊断和治疗的药物或作为新药先导化合物 [ 7 ]。目前,
芋螺毒素已被公认为是研究各种离子通道和神经递
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
质受体的最佳分子探针。虽然芋螺毒素的研究历史
只有 20余年,但由于其高丰度、分子量小、结构多样
性、作用靶点广泛以及强特异性作用等特点,已经逐
渐成为倍受国内外学者关注的新兴研究热点 [ 8]。
自 1978年 Cruz等 [ 5]从地纹芋螺 (Conus geogra-
phus)毒液中分离纯化出第一种芋螺毒素,至今已有
百余种芋螺毒素被分离鉴定, 但是, 芋螺的采集、毒
素的提取和分离纯化等步骤费时、费力, 产率较低,
受资源的影响较大, 有些标本很难获取 [ 9]。随着现
代生物技术的快速发展, 用基因工程的手段大量发
现和获取各式各样的芋螺毒素是今后研究的重要方
向,现就芋螺毒素基因资源研究新进展进行综述。
1 芋螺毒素的分类
芋螺毒素的种类繁多,生物活性多样,一级结构
多变。对它们的分类,目前主要采用以下原则:根据
其高度保守的前体信号肽序列和二硫键骨架, 将芋
螺毒素分为若干个超家族 (如 A、O、T、M、P和 I等
超家族 ) (表 1) [ 10- 12] ;按其药理学活性,分为若干个
家族 (如 A、X、L、D、W和 J-等家族 ); 根据其作用的
不同种类的受体,分为若干个亚家族。
根据芋螺毒素作用于生物体内的不同靶位可分
为 3类: ( 1)作用于电压门控离子通道的 CTX,电压
门控离子通道又称电压敏感性通道, 常以通透离子
如 Na+、K +和 Ca2+等命名。 ( 2)作用于配体门控离
子通道的 CTX, 包括烟碱受体、5-HT3受体和 NMDA
受体等。配体门控通道又称化学门控通道或递质依
赖性通道,后者按相应的受体命名。 ( 3)作用于其
他受体的 CTX, CTX除了作用于离子通道以外, 还
有以 G-蛋白为靶标的, 如芋螺加压素和芋螺惰性
素, 以及两种磷脂 ( conod ip ineM 和 PLA2) , 它们基
本不含有二硫键 [ 13]。
表 1 芋螺毒素超家族类型
超家族 Cys残基排列方式 ( No. )
以药理活性
分类的家族
类型
靶标
A CC-C-C ( I / II) A N icotin ic recep tors
Q
A-Adren erg ic
receptors
A CC-C-C-C-C( IV ) AA N icotin ic recep tors
JA K+ channels?
M CC-C-C-CC ( III) L Na+ ch ann els
JM K+ channels
W N icotin ic recep tors
O C-C-CC-C-C (VI/V II) X C a2+ channels
J K+ channels
R Na+ ch ann els
LO Na+ ch annels
超家族 Cys残基排列方式 ( No. )
以药理活性
分类的家族
类型
靶标
T CC-CC ( V) Non e defined Unknown
T CC-C-C V
Catecho lam ine
tran sporter
S
C-C-C-C-C-C-
C) C-C-C ( VIII)
R
AS
S eroton in( 5-HT
3
)
recep tor
N icot in icreceptors
P
C-C-C-
C-C-C( IX)
Non e defined Unknown
I1 / I2
C-C-CC-
CC-C-C ( XI)
Non e defined K+ chann els
J C-C-C-C ( XIV ) Non e defined K+ chann els
2 芋螺毒素各家族及其药理学活性
芋螺毒素, 能特异性作用于乙酰胆碱受体 (如
A-芋螺毒素 )、钙离子通道受体 (如 X-芋螺毒素 )和
钠通道受体 (如 L-、D-芋螺毒素 )等, 它不仅可以直
接作为药物使用,还可以作为新药设计的模板,已成
为神经生物学、生物化学、药理学、药物化学家甚至
军事部门的研究热点 [ 14]。
2. 1 A-芋螺毒素家族
A-芋螺毒素结构特征: 肽链 ( Cys残基排列方
式-CC-C-C-)短小, 半胱氨酸含量高, 多数有两对二
30
2011年第 1期 李宝珠等: 芋螺毒素基因资源研究进展
硫键, 少数有 3对二硫键,除 SÒ型 A-芋螺毒素外, C
端均是酰胺化的。二硫键的正确形成对A-芋螺毒素
的毒性至关重要。
A-芋螺毒素的作用靶点是神经肌肉接头的乙酰
胆碱受体 ( nAChRs) ,表现出对动物的麻痹和致死作
用。乙酰胆碱受体 ( AChR s)属于配体门控通道,对
诸如学习和记忆等神经生理过程起着至关重要的作
用,而对于阿耳茨海默病、帕金森症以及精神分裂、
癫痫、肌无力等病症的病理生理学研究和治疗,
AChRs的意义则显得更为重要 [ 15]。
不同的 A-芋螺毒素亚型作用于不同的乙酰胆
碱受体亚型。通过对与 nAChR s不同亚型专一性结
合的配体的研究,将为新药的研发提供十分有意义
的线索。另外, A-芋螺毒素能结合并阻断小细胞肺
癌细胞表面的 nAChR, 在小细胞肺癌的诊断和治疗
中也有潜在应用价值。
2. 2 X-芋螺毒素家族
X-芋螺毒素的结构特征: 肽链 ( Cys残基排列方
式-C-C-CC-C-C-)由 24- 31个氨基酸组成, 分别含
有 3对二硫键成 4-Loop框架。由于分子中 4个
Loop区核苷酸序列的高变性, 芋螺毒素具有多样
性、与受体结合的高特异性以及对钙离子通道亚型
的高选择性。虽然各种 X-CTX的同源性都比较低,
但通常第 13位是保守的 Tyr残基,在第 5位是保守
的 G ly残基, 并且通常含有 4- 6个碱性氨基酸。
X-芋螺毒素 M × A是来源于芋螺的一种多肽类
神经毒素,含 25个氨基酸残基,分子内 6个 Cys的
巯基参与 3对二硫键的形成。这种毒素能专一性阻
断神经末梢的 N-型电压敏感钙离子通道,影响神经
末梢递质释放 [ 16]。目前,毒素肽 M × A (即 Ziconot-i
de)已经被化学合成并命名为 Prial,t其具有较高的
镇痛活性,且不成瘾, 并且已经作为一种治疗顽固性
疼痛的商业化药物上市 [ 17]。
2. 3 L-芋螺毒素家族
L-芋螺毒素家族 ( Cys残基排列方式为-CC-C-C-
CC-)的作用位点是电压门控钠离子通道, 为肌肉型
钠离子通道拮抗剂,作用高度专一,甚至可以区分不
同组织中的 VGSC亚型 [ 18]。
L-芋螺毒素虽然与经典的钠通道拮抗剂河豚
毒素 ( TTX)和石房蛤毒素 ( STX )都作用于钠通道受
体位点 I,但它只选择性地阻断肌肉型钠通道而不
阻断神经型钠通道,而 TTX和 STX对上述两种类型
的钠通道都有阻断作用, L-芋螺毒素通过选择性地
阻断钠传导,可用作探查生物化学机制的专一性配
基, 是研究钠离子通道的优良工具药 [ 19]。
2. 4 其他芋螺毒素
芋螺毒素 SO3含有 25个氨基酸残基, 3对二硫
键,属于 O超家族芋螺毒素。通过电生理方法, 确定
SO3属于 N型钙离子通道抑制剂。研究表明, SO3对
小鼠的镇痛活性很高,比吗啡高千倍以上,并且无致
瘾性,具有极广阔的药物开发前景。但是到目前为
止,芋螺毒素只有在中枢神经系统中才能发挥其高效
镇痛作用,因此存在着跨血脑屏障转运的障碍。
Contryphan含有一对二硫键, 序列短, 仅有 7 -
11个氨基酸组成,是 CTX中序列最短的一个家族。
但它翻译后加工方式却很多, 是目前翻译后加工最
复杂、密度最高的一类多肽。在已鉴定氨基酸序列
的所有 contryphan中, 全部都包含 1个 D型色氨酸
或赖氨酸,所以, 也有科学家称之为含 1个 D型氨
基酸的芋螺多肽 [ 6]。到目前为止,对 contryphan作
用靶位的研究比较少。已阐明功能的 4种 contry-
phans中, contryphanVn是一种钾通道调节剂, g la-
contryphan-M、contryphan-Lo、contryphan-P /Am 作用
于钙通道。
不同家族的芋螺毒素其药理学活性不同, 不同
亚家族的芋螺毒素其作用受体亚型也不同, 芋螺毒
素多样性使通过专一性配基来鉴定不同受体亚型成
为可能,即为药理学活性的研究奠定了基础。
3 芋螺毒素基因的筛选方法
自从 Mullis等 [ 20]在 1983年发明 PCR技术、
H illyard等 [ 21]在 1992年获得第一个芋螺毒素基因
以来,利用芋螺毒素基因超家族中保守序列设计引
物并通过 PCR技术来发现新型芋螺毒素基因成为
一种重要的筛选方法。毒管 DNA /cDNA的 PCR克
隆和毒液分离鉴定是目前筛选新芋螺毒素基因的两
大手段。有些芋螺毒素基因最初通过 PCR克隆方
法获得,有些则通过毒液分离鉴定方式获取,二者在
筛选新基因方面具有互补作用。
3. 1 从芋螺基因组 DNA中筛选
从芋螺毒管或其它组织中提取基因组 DNA, 根
31
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
据芋螺毒素各超家族信号肽或内含子及 3c端非翻
译区序列, 设计各个超家族基因的特异 PCR引物,
通过 PCR扩增和序列分析方法, 使从基因组 DNA
中克隆新型毒素基因成为可能,且是目前分离芋螺
毒素基因的有效方法之一。
M cIn tosh等 [ 22]从地纹芋螺 (C. geographus)基因
组 DNA中用 PCR法克隆到新型 A-CTX GIC, 以及
从其他芋螺基因组中发现了较多的 A-芋螺毒素基
因, 但获得的这些绝大多数芋螺毒素前体基因的功
能尚未深入研究。本课题组已从菖蒲芋螺基因组中
克隆到两个新芋螺毒素基因 ( GenBank登录号:
AY316159, AY316160)。部分芋螺毒素基因组基因
编码产生的毒素肽及其特征,如表 2所示。
表 2 从基因组 DNA中筛选到的芋螺毒素基因
GenBank登录号 基因名称 菌株 超家族 S-S模序 肽链序列 参考文献
AF526267 GIC C. g eog raphus A CC-C-C GCCSH PACAGNNQH IC [ 22]
DQ008450 PeIA C. pergrand is A CC-C-C GCCSH PACSVNH PELC [ 23]
AY580321 Lp1. 1 C. leopardu s A CC-C-C GCCARAACAG IHQELC [ 24]
DQ359140 M r1. 2 C. m arm oreu s A CC-C-C GCCSNPPCYANNQAYCN [ 24]
DQ311078 Pu1. 2 C. pulicariu s A CC-C-C GGCCSYPPC IANNPLC [ 24]
DQ311058 QcaL-1 C. querc inus A C-C-C FCSDPPCRISNPESCGWEP [ 24]
DQ311060 Qc1. 1a C. querc inus A CC-C-C DECCPDPPCKASNPDLCDWRS [ 24]
DQ311072 Ac11. a C. a cha tinus A CC-C-C NGRCCHPACGKHFNC [ 24]
DQ311075 Ac4. 3b C. a cha tinus A CC-C-C-C QKELVPSKITTCCGYSPGTACPSCM CTNTCKKKNKKP [ 24]
FJ834437 E1 C. ebraeus O1 C-C-CC-C-C ECTDSGGACNSHDQCCNEFCSTATRTC I [ 25]
3. 2 从芋螺 cDNA文库中筛选
芋螺毒素和微生物的次生代谢产物与植物的生
物碱一样,具有高度的遗传多样性特征。真核生物
的基因组 DNA十分庞大, 约是 mRNA和蛋白质的
100倍, 因而从 DNA筛选目的基因片段较费时费
力,而通过构建 cDNA文库筛选则较简便快捷。
根据已知芋螺某超家族信号肽的保守序列,推
断出其对应基因碱基序列,设计并合成出特定引物,
从而通过 PCR等试验技术从 cDNA文库中筛选新
毒素基因。新基因序列确定后,就可以根据基因序
列推断相应的芋螺毒素氨基酸序列, 通过人工合成
或重组表达,便可获得相应的芋螺毒素用于进一步
的生物活性测试。
构建芋螺毒素 cDNA文库,从中筛选新型芋螺
毒素基因已成为研究新芋螺毒素及其分子特征的重
要途径之一。如 M × C、M × D、SÖ A、SÖ B和 SO3
是根据已知 X-毒素毒素肽氨基酸保守序列, 合成特
定的探针,从中筛选出来的。迄今为止,国外已构建
了地纹芋螺 (C. geographus )、幻芋螺 ( C. magus)、金
翎芋螺 (C. p enaceus)及织锦芋螺 ( C. tex tile )等几种
芋螺的 cDNA文库。本课题组也已构建了织锦芋螺
(C. tex tile)、独特芋螺 (Conus caracteristicus F ischer)、
桶形芋螺 (Conus betulinus Linnaeus)、勇士芋螺 (Conus
m iles Linnaeus)和疣缟芋螺 (Conus lividusHwass)等几
种芋螺毒管 cDNA文库,并且已从其 cDNA文库中筛
选到上百种新芋螺毒素基因。根据信号肽及 3c端非
翻译序列,设计芋螺毒素各个超家族基因的特异 PCR
引物,可从 cDNA文库中克隆新型毒素基因, 这是目
前分离芋螺毒素基因的主要方法。设计 O-超家族
PCR引物,有望克隆到 D-、LO-、X-和 J-芋螺毒素 [ 26 ]。
S ilvestro等从 5种芋螺 ( C. arena tus、C. p enna-
ceus、C. tessulatus、C. ventricosus和 C. tex tile )中获得了
170个芋螺毒素的 cDNA序列, 他们都在 GenBank
中申请了序列号。我国科学家卢柏松等从中国海南
线纹芋螺 ( C. striatus)和织锦芋螺 ( C. tex tile )中分别
发现了 6种新 O-超家族毒素的 cDNA序列和两种
A-CTX
[ 13]。部分芋螺毒素基因 cDNA对应产生的毒
素肽及其特征,如表 3所示。
32
2011年第 1期 李宝珠等: 芋螺毒素基因资源研究进展
表 3 从 cDNA文库中筛选到的芋螺毒素基因
GenBank登录号 基因名称 菌株 超家族 S-S模序 肽链序列 参考文献
DQ345364 It1 a C. littera tu s A CC-C-C GCCARAACAGIHQELCGGGR [ 30]
DQ345367 It14a C. littera tu s L C-C-C MRPPLCKPSCTNC [ 30]
ABC 74995 L t9a C. littera tu s P C-C-C-C-C-C VS IWFCASRTCSAPADCNPCTCESGVCVDWL [ 30]
DQ345376 L t15a C. littera tu s O2 C-C-CC-C-C-C-C
ECTTKHRRCEKDEECCPNLECKCL-
TSPDCQSGYKCKP
[ 30]
ABC 74983 L t0. 2 C. littera tu s O1 ) GLTGEAGMLEGLSS [ 30]
EF467316 Leo-O1 C. leopardu s O1 C-C-CC-C-C DCVKAGTACGFPKPEPACCSSWC IFVCT [ 31]
EF467314 Leo-T1 C. leopardu s T CC-CC CCPNLFYCCPD [ 31]
AF214956 TxXIIIA C. tex tile T CC-CCC TSDCCFYHNCCC [ 30]
AF215080 VnM SGL-0111 C. ven tricosus O3 C-C-CC-C-C S ITRTEACYEYCKEQNKTCCG ISNGRPICVGGC I [ 32]
AAG60514 PnMM SK-04 C. penna ceu s M CC-C-C-C-C CCKYGWTCWLGCSPCGC [ 32]
在芋螺体内,除了毒腺以外的其他分泌器官,如唾
液腺,可能分泌毒素到毒管或毒囊中 [ 27]。这些腺体也
可能贡献特异毒素到毒液中。虽然以往的研究没有涉
及到哪些基因产物由芋螺唾液腺产生,但有研究表明,
在食虫性芝麻芋螺 (C. pulicarius)的唾液腺 cDNA文库
中发现了两种特异的 A-芋螺毒素,而且这两种毒素不
能在毒管 cDNA文库中找到。因此,这两种毒素由唾
液腺特异分泌 [ 28]。由唾液腺产生的类似的生物活
性物质可能具有增加毒素效力的作用 [ 29]。由此推
断,芋螺中除了毒腺以外, 还存在其他分泌器官分泌
生物活性物质为芋螺毒素多样性作出贡献。
通过构建 cDNA文库发现新芋螺毒素基因的方
法,在一定程度上解决了芋螺材料来源问题,并且可
以加深对芋螺毒素多肽基因水平特征、多样性遗传
机制及形成特定构象的折叠机制地了解和认识。
3. 3 cDNA基因克隆方法
提取芋螺毒管或其他组织中的总 RNA,以其中
的 mRNA作为模板, 采用 O ligo( dT)或随机引物利
用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA为模板,通
过 RT-PCR、3cRACE等方法筛选新型芋螺毒素基因
(表 4)。RT-PCR即逆转录聚合酶链式反应,具有放
大作用和很高的灵敏性,使一些极微量 RNA样品分
析成为可能。因此,可用于获取微量表达的芋螺毒
素基因。RACE ( rapid-amplif ication of cDNA ends)是
通过 PCR进行 cDNA末端快速克隆的技术。RACE
是一种基于 PCR从低丰度的转录本中快速扩增 cD-
NA的 5c和 3c-末端的有效方法,具有简单、快速及廉
价等优点。
表 4 cDNA克隆方法筛选到的芋螺毒素基因
GenBank登录号基因名称 菌株 超家族 S-S模序 肽链序列 参考文献
DQ345365 It1b C. littera tu s A CC-C-C GCCARAACAGIHQELCGGRR [ 36]
DQ141133 L iC22P C. lividu s A CC-C-C NECCDNPPCKSSNPDLCDWRS [ 37]
DQ141135 TeA21P C. text ile A CC-C-C PECCSDPRCNSSHPELCG [ 37]
DQ141160 TeA61P C. text ile O1 C-C-CC-C-C CLDAGEVCDIFFPTCCGYC ILLFCA [ 38]
DQ141151 M qJ42P C. m agu s O1 C-C-CC-C-C CNNRGGGCSQH PHCCSGTCNKTFGVCL [ 39]
DQ141170 M iE r92 C. m i le s O1 C-C-CC-C-C DCKHQNDSCAEEGEECC SDLRCMTSGAGAICVT [ 39]
DQ141179 V iK r35P C. v irgo O1 C-C-CC-C-C ECRRRGQGCTQSTPCCDGLRCDGQRQGGMCVDS [ 39]
DQ141147 L iC42P C. lividu s O1 C-C-CC-C-C SCGHSGAGCYTRPCCPGLHCSGGHAGGLCV [ 40)
DQ141177 M alr137P C. m arm oreu s O1 C-C-CC-C-C DDECEPPGDFCGFFK IGPPCCSGWCFLWCA [ 38)
DQ141159 M al51P C. m arm oreu s O2 C-C-CC-C-C QCEDVWM PCTSNWECCSLDCEMYCTQ I [ 38]
DQ141154 B eB 54P C. betulinus O2 C-C-CC-C-C
KSTAESWWEGECKGWSVYCSWD-
WECCSGECTRYYCELW
[ 40]
FJ240165 Bu IIIA C. bullatus M CC-C-C-CC CCKGKRECGRWCRDHSRCC [ 41]
EU048276 conom arph in C. m arm oreu s ? ) DWEYHAHPKPNSFWT [ 42]
GQ180867 Eb11. 3 C. ebu rneus I2 C-C-CC-CC-C-C
FIPCTGSEGYCH SHMWCCNSFDVCCE-
LPGPATCTREEACETLRIA
[ 43]
33
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
利用 cDNA基因克隆方法, Duda等 [ 33, 34]从 3种
芋螺 (C. abbrevia tus、C. ebraeus和 C. lividus)中,测出
了 280余个四环芋螺毒素前体蛋白基因序列。本课
题组利用上述方法, 从海南产的大理石芋螺 (Conus
marmoreus Linnaeus)、幻芋螺 (Conusmagus Linnaeus)、
信号芋螺 (Conus litteratus Linnaeus)、勇士芋螺 (Conus
m iles Linnaeus)、独特芋螺 (Conus caracteristicus Fisch-
er)、织锦芋螺 (Conus tex tile L innaeus)、桶形芋螺 (Conus
betulinus Linnaeus)和疣缟芋螺 (Conus lividusHwass)等
共 12个种中分别发现了 35种 O-超家族芋螺毒素基
因 [ 13]和若干种 A-芋螺毒素基因的 cDNA,目前正在进
行毒素肽的合成及其具体功能的鉴定。
RT-PCR虽然操作简单, 但是首先必须已知待
扩增序列或其同源序列以便设计引物,而且由于各
种原因所获得的往往是部分序列; 而 RACE可以弥
补 RT-PCR技术的不足, 根据已获得的 cDNA部分
序列能够有效扩增其上下游序列, 经过拼接可以获
得 cDNA全长基因序列 [ 35]。
3. 4 毒液分离鉴定方法
通过高效液相色谱 (HPLC )等分离技术对芋螺
粗毒进行分离纯化,然后对得到的单一多肽组分进
行 Edman降解法或质谱测序, 由氨基酸序列推测其
基因碱基序列,通过与已知序列基因进行比对,从而
鉴定其是否为新的芋螺毒素基因 (表 5)。
表 5 毒液分离鉴定方法筛选到的芋螺毒素基因
GenBank登录号 基因名称 菌株 超家族 S-S模序 肽链序列 参考文献
AAF23167 BeTX C. be tulinu s I2 C-C-CC-CC-C-C CRAEGTYCENDSQCCLNECCWGGCGHPCRHP [46]
AJ560778 viTx C. virgo I2 C-C-CC-CC-C-C SRCFPPGIYCTPYLPCCWGICCGTCRNVCHLRI [47]
EU169206 Vt15. 1 C. virgo V C-C-CC-C-C-C-C DCTTCAGEECCGRCTCPWGDNCSC IEW [48]
FJ531694 Ca11A C. caracteristicus I3 C-C-CC-CC-C
AWPCGGVRASCSRHDDCCGSLCC-
FGTSTGCRVAVRPCW
[49]
EU675847 ca16a C. caracteristicus Y C-C-CC-C-CC-C
CGGTGDSCNEPAGELCCRRLKCVNS-
RCCPTTDGC
[50]
EU516351 Ca8c C. caracteristicus S
C-C-C-C-C-
C-C-C-C-C
GCSGTCRRHRDGKCRGTCECSGY-
SYCRCGDAHHFYRGCTCTC
[51]
EU496106 Tx8. 1 C. tex tile S
C-C-C-C-C-
C-C-C-C-C
GCT ISCGYEDNRCQGECHCPGKTNCYCTS-
GHHNKGCGCAC
[51]
AF193510 tx9a C. tex tile P C-C-C-C-C-C GCNNSCQEHSDCESHC ICTFRGCGAVN [52]
DQ447644 fe14. 1 C. ferrug ineu s J C-C-C-C SPGST ICKMACRTGNGHKYPFCNCR [53]
FJ896006 Cp 20. 3 C. capitaneus D
C-CC-C-CC-
C-C-C-C
EVQECQVDTPGSSWGKCCMTRMCGTMCCSRS-
VCTCVYHWRRGHGCSCPG
[54]
最短的毒素肽是只有 8个氨基酸的 V超家族 [ 44] ,
最长的是具有 86个氨基酸的毒素 con- iko-t ikot[ 45] ,这
两种毒素都在蛋白水平上得到了分离。
天然毒素分离方法与 cDNA克隆法二者有相互补
充的效果。有的毒素虽然通过 cDNA克隆得到了 cD-
NA序列,但因为毒素的含量很低,很难通过毒素分离
方法分离得到;在毒液分离纯化中得到的毒素可能筛
选不到其 cDNA序列。从芋螺毒液中获取的毒素肽的
显著特征是成熟肽基因产物具有高频率的翻译后修
饰 [ 17]。因此,毒液分离方法对获得翻译后修饰的毒素
发现尤其重要。
4 结语
芋螺毒素具有海洋生物活性物质的原始性和多
样性等特点,结构新颖,功能独特, 既可作为设计药物
的先导化合物,又可直接开发为天然药物。由于芋螺
毒素具有分子小、结构稳定等特点,所以其在新药研
制方面受到格外重视 [ 55]。芋螺毒素及其衍生物在治
疗神经系统疾病的药用研究方面已有重大进展,研究
中的疾病治疗范围包括慢性疼痛、癫痫、心血管疾病、
精神障碍、运动障碍、癌症以及中风等 [ 18]。
与传统的毒液分离鉴定新型基因方法相比, 分
子生物学方法的优势不仅在于节省所需的组织量,
34
2011年第 1期 李宝珠等: 芋螺毒素基因资源研究进展
而且可以发现低表达量的芋螺多肽 [ 56]。芋螺毒素
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基
因功能的研究至关重要,而完整的 cDNA序列可以
通过文库筛选和末端克隆技术获得。
对芋螺毒素新基因的筛选, 不仅可以加深对
芋螺毒素多肽基因水平特征、多样性遗传机制及
形成特定构象的折叠机制的了解和认识, 而且有
助于深入研究各种离子通道及其亚型, 又可对特
定芋螺毒素与受体的特异结合及作用机制进行研
究, 从而使在克隆表达的靶受体上设计和筛选高
效新药成为可能。对芋螺毒素的深入研究, 对于
推动蛋白质科学的发展、多肽药物开发等都具有
重要的意义。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红 )
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