全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2013)04 － 1327 － 05
收稿日期:2012 － 07 － 05
基金项目:云南省应用基础研究计划青年项目(2012FD071) ;
国家现代农业产业技术体系“甘蔗产业技术体系”开远综合试
验站(CARS-20-6-13) ;国家人事部留学人员科技活动优秀项目
和云南省科技厅高层次科技人才培引工程云南省高端科技人才
引进计划“甘蔗抗旱育种技术研究与种质改良”(2012HA001)
作者简介:林秀琴(1983 －) ，女，福建华安人，硕士，主要从事甘
蔗分子细胞遗传学研究，* 为通讯作者。
甘蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂交 F1 代 GISH分析
林秀琴1，陆 鑫1，毛 钧1，刘新龙1，苏火生1，蔡 青1，2，3*
(1．云南省农业科学院甘蔗研究所 /云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南 开远 661699;2．云南省农业科学院生物技术与种质资
源保存研究所，云南 昆明 650223;3．云南大学生命科学院，云南 昆明 650091)
摘 要:滇蔗茅是甘蔗野生近缘属植物资源，通过光周期诱导甘蔗属热带种与野生滇蔗茅花期相遇进行远缘杂交利用，获得了远
缘杂交 F1 代创新种质材料。本研究首先采用常规压片法对远缘杂交 F1 代材料云南 03-316 染色体数目进行鉴定，结果 2n = 54
条;进一步的双色基因组荧光原位杂交(genomic in situ hybridization，GISH)分析结果表明，杂交 F1 代细胞中含有 15 条来自父本云
南 95-20 的染色体及 39 条来自母本越南牛蔗的染色体，远缘杂交过程双亲本染色体以 n + n 的遗传配对方式进行传递。从 F1 代
间期核荧光原位杂交结果可以看出，来自双亲本的染色质以分散的方式单独分布。研究结果可为 F1 代创新材料的后续利用提供
细胞学参考价值。
关键词:甘蔗;滇蔗茅;F1 代;基因组荧光原位杂交
中图分类号:S566． 1 文献标识码:A
GISH Analysis of Intergeneric F1 Hybrids between
Saccharum officinarum and Erianthus rockii
LIN Xiu-qin1，LU Xin1，MAO Jun1，LIU Xin-long1，SU Huo-sheng1，CAI Qing1，2，3*
(1． Sugarcane Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement for
Sugarcane，Yunnan Kaiyuan 661699，China;2． Biotechnology and Germplasm Resources Institute Yunnan，Academy of Agricultural Sci-
ences，Yunnan Kunming 650223，China;3． School of Life Sciences，Yunnan University，Yunnan Kunming 650091，China)
Abstract:The Erianthus rochii Keng is the wild relatives of sugarcane，distant hybridization was took between Saccharum officinarum L． and
E． rochii Keng while it’s flowering meet by the photoperiodic induction，and F1 generation was obtained． The chromosome number in F1 was
identified with 2n = 54 by conventional pressure plate method． And the result of the genomic in situ hybridization (GISH)showed that there
were 15 E． rockii chromosomes and 39 S． officinarum chromosomes in F1 progeny (Yunnan03-316)． Chromosomal constitution of F1 hybrids
derived from sexual cross between S． officinarum L． and E． rockii was n + n． The GISH result on nuclear of F1 progeny showed the chroma-
tins came from male and female was not intermixed and stayed at different regions． The results could provide a cytology reference for the fol-
low-up use of the F1 generation materials．
Key words:Saccharum officinarum;Erianthus rockii;F1 hybrids;GISH
滇蔗茅(Erianthus rockii)是珍贵的甘蔗近缘属-
蔗茅属(Erianthus)植物资源，产于四川、云南、西藏;
多生长在海拔 500 ～ 2700 m 的干燥山坡草地［1］，具
有耐旱、耐寒、抗锈病等优良特性［2］，可作为品种改
良中抗逆性和抗锈病基因的重要供体野生亲
本［3 ～ 4］。通过甘蔗属热带种与滇蔗茅进行属间远缘
杂交，所获得的 F1 代作为供体亲本与甘蔗品种多次
杂交，选育出抗逆性表现优良的含滇蔗茅血缘的品
种，这对甘蔗产业的持续、健康、稳定发展具有重要
的意义［5 ～ 6］。
蔗茅属滇蔗茅与甘蔗属的亲缘关系较近［7 ～ 8］，
通过光周期诱导甘蔗属热带种开花与滇蔗茅进行远
缘杂交利用，创制出含野生滇蔗茅血缘杂交后代材
料［9 ～ 10］。但双亲特别是滇蔗茅的遗传物质在后代
材料中的渗入情况及遗传方式仍不清楚，因此，有必
要对其进行分子细胞遗传学研究。本研究首先采用
7231
2013 年 26 卷 4 期
Vol. 26 No. 4
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
常规压片法对远缘杂交 F1 代材料云南 03-316 体细
胞染色体数目进行了鉴定，并进一步应用双色 GISH
技术检测 F1 代中双亲本染色体，旨在了解甘蔗属热
带种与近缘野生种滇蔗茅远缘杂交过程的染色体遗
传行为，以期减少育种工作的盲目性，为今后在甘蔗
育种中有效利用滇蔗茅资源提供细胞学依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
通过光周期诱导甘蔗属热带种越南牛蔗(Sac-
charum officinarum)开花为母本，与野生近缘属植物
云南 95-20(Erianthus rockii)为父本进行远缘杂交利
用，获得 F1 代创新种质材料云南 03-316。材料栽种
在 10 L塑料桶中，底部放适量的珍珠岩，上面盖一
层土，以便重复采集根尖材料。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 根尖的采集、预处理、固定及保存 将幼嫩
的根尖掐断，放入对二氯苯水饱和溶液与 0． 002
mol /L 8-羟基喹啉等体积混合液中，室温预处理 4
h，用 0． 075 mol /L KCl低渗 1 h(室温) ，卡诺氏固定
液 I(无水乙醇︰乙酸 = 3 ︰ 1，现配现用)于 4 ℃冰
箱固定 24 h，双蒸水洗 2 遍 10 min，用 70 %乙醇溶
液浸泡，4 ℃冰箱保存备用。
1． 2． 2 染色体玻片标本的制备 F1 代体细胞染色
体数目鉴定采用常规压片法进行制片、观察和统计。
原位杂交用染色体玻片标本采用酶解去壁低渗
法［11］进行制备，略有修改。从冰箱中取出备用的根
尖材料，切下分生区组织对剖，用 0． 25 N HCl 于室
温下解离 5 ～ 6 min，双蒸水洗 2 遍 10 min，转入 PCR
管中，加入适量的酶液(2 %纤维素酶 + 0． 5 %离析
酶) ，于 37 ℃恒温水浴锅中酶解约 45 min(期间轻
轻摇几次)。用双蒸水进行后低渗，室温 1 ～ 2 h。
吸掉双蒸水，加适量现配的卡诺氏固定液Ⅰ捣碎，制
成细胞悬浮液，静置 20 min，轻轻吸掉上层 1 /3 溶
液，保留下层 2 /3 溶液进行制片。将溶液滴在防脱
载玻片上，酒精灯火焰微烤，自然晾干，放入 － 20 ℃
冰箱保存备用，或在显微镜下观察中期染色体。
1． 2． 3 探针制备与荧光信号检测 采用 CTAB 方
法提取双亲本叶片基因组总 DNA，分别用 Biotin-
High-prime (Roche，Cat． No． 11585606910)标记母
本越南牛蔗和 DIG-High-prime (Roche，Cat． No．
11585649910)标记父本云南 95-20 的 DNA 模板制
备杂交探针(按标记物产品说明书提供的方法进行
标记)。用德国蔡司公司荧光显微镜观察检测荧光
信号，用 ISIS 系统对细胞荧光图像进行拍照和处
理。
1． 2． 4 双色基因组荧光原位杂交过程 配制 40 μl
杂交混合液(含 50 %去离子甲酰胺、10 % DS、0． 5
% SDS、母本 DNA 探针 15 μg /mL，父本 DNA 探针
10 μg /mL，封阻用玉米基因组总 DNA 5 μg /mL) ，在
涡流混合器上混匀，在 PCR仪上 97 ℃变性 10 min，
迅速转入冰水中至少 10 min。杂交前，把玻片先放
入 60 ℃烘箱 5 h，每个玻片加 70 %去离子甲酰胺
100 μl，加封口膜盖片后于 77 ℃水浴锅变性 7 min，
揭去膜。70 %、95 %、100 %酒精于 － 20 ℃下脱
水，每级 5 min。杂交混合液和染色体标本分别变性
后，将杂交液滴在染色体玻片标本上，盖膜，放在一
保湿盒中，于 37 ℃水浴锅杂交过夜。第 2 天，分别
用 0． 1 % SDS(2 × SSC)和 0． 1 % SDS(0． 2 × SSC)
溶液进行漂洗，于 37 ℃水浴锅各漂洗 3 次 5 min，然
后用 5 % BSA ，于 37 ℃水浴锅处理 30 min(封阻内
源性生物素蛋白产生的干扰) ，加荧光分子藕联抗
体工作液(25 μg /mL Bio-Avidin-FITC 与 15 μg /mL
Anti-DIG-Rhodamin均等混合液，避光) ，37 ℃水浴
锅温育 1 h，用 1 × PBS /Teween20 漂洗，37 ℃，3 次 5
min，用 DAPI衬染 7 min(避光) ，1 × PBS室温漂洗 3
次 3 min。用抗荧光衰减剂(Vectashied)封片后进行
荧光信号检测、观察和拍照。
2 结果与分析
2． 1 云南 03-316 体细胞染色体数目鉴定结果
采用常规压片法进行制片，选择染色体形态好、
分散的中期细胞进行观察，结果见表 1。在所观察
的 82 个中期分裂相细胞中，2n存在变数，具有 52 ～
60 条不等的染色体数目，变幅为 8 条。其中 2n = 54
条所占的比例最高，为 45． 12 %，根据以众数计算染
表 1 云南 03-316 体细胞染色体数目
Table 1 Chromosome numbers in Yunnan03-316
观察细胞总数(82 个)
Total cells
染色体数目类型及细胞数
Chromosome number types and cells
52 53 54 55 56 58 59 60
7 3 37 6 16 6 2 5
所占比例(%)Ratio 8． 54 3． 66 45． 12 7． 32 19． 51 7． 32 2． 44 6． 09
8231 西 南 农 业 学 报 26 卷
表 2 云南 03-316 染色体组成 GISH分析
Table 2 Analysis of chromosome constitution in Yunnan03-316 by GISH
观察的中期细胞
Metaphase
cells observed
染色体数目(条)Chromosome numbers
体细胞染色体数
No． of somatic Chr．
甘蔗属热带种染色体
S． officinarum Chr．
滇蔗茅染色体
E． rockii Chr．
1 55 40 15
2 54 37 17
3 55 40 15
4 54 39 15
5 54 40 14
6 56 39 17
7 55 40 15
8 54 39 15
9 54 39 15
10 56 41 15
11 54 39 15
众数 54 39 15
色体数目的原则，可确定云南 03-316 的体细胞染色
体数目 2n为 54 条。
2． 2 双色基因组荧光原位杂交结果与分析
以标记的双亲本 DNA为杂交探针，与其远缘杂
交 F1 代创新种质材料染色体玻片标本进行双色基
因组荧光原位杂交，结果表明(表 2) :F1 代创新种
质材料云南 03-316 体细胞中含来自母本越南牛蔗
的染色体数目为 37 ～ 41 条;含来自野生父本云南
95-20 的染色体数目为 14 ～ 17 条。而在 2n = 54 的
细胞中，含来自父母本的染色体数目以 15 条和 39
条居多，说明 F1 代创新种质材料云南 03-316 体细
胞含 15 条野生滇蔗茅染色体及 39 条热带种染色
体。由于双亲本染色体数目分别为 2n = 30 和 80
条，所以推测甘蔗属热带种与蔗茅属滇蔗茅远缘杂
交过程染色体以 n + n(整倍或非整倍的 n)方式进
行传递，存在染色体丢失的现象，丢失的 1 条染色体
为母本越南牛蔗的染色体。
图 1-A 和图 1-B 分别为 F1 代中期细胞和间期
核细胞荧光原位杂交图片，黄绿色荧光信号表示母
本越南牛蔗的染色体(质) ，橙红色荧光信号表示父
本云南 95-20 的染色体(质)。从图 1 可以看出，无
论中期或间期黄色和橙色荧光信号居多，说明了双
亲本的 DNA同源性广泛。父本端部染色体具较强
的红色荧光信号，推测父本滇蔗茅不同于母本的独
特基因较多地分布在这些端部。应用 GISH 技术没
有检测到明显的染色体断裂或重组现象。间期核细
A:有丝分裂中期细胞 GISH;B:间期细胞核 GISH
A:GISH in mitosismetaphase;B:GISH in interphasic nucleus
图 1 基因组荧光原位杂交
Fig． 1 The GISH
92314 期 林秀琴等:甘蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂交 F1 代 GISH分析
胞的 GISH分析结果显示双亲本的染色质绝大多数
各自存在于细胞核的不同空间而不相混合，但未形
成微核，仅少数染色质因父、母本探针的交叉杂交有
互相混合的现象。
3 讨 论
在甘蔗杂交育种中，杂交后代的真实性鉴定是
非常重要的，因为只有知道杂交后代是否真正含有
亲本血缘，才能确定杂交利用的效果如何、杂交方法
是否可行。远缘杂种的真实性鉴定常用的方法有形
态解剖分析［12］、染色体数目分析［13］、同工酶分
析［14 ～ 15］和分子标记［16］等。利用 GISH 技术不仅能
鉴定远缘杂种中的亲本染色体，而且能检测其基因
组组成及染色体行为［17 ～ 18］。本研究应用双色 GISH
技术，准确地鉴别了甘蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂
交 F1 代含双亲本的染色体，验证了 GISH 技术是检
测、跟踪甘蔗外源染色质渗入情况的有效工具，是鉴
定甘蔗远缘杂交成败的极其有效的方法。
本研究结果表明，云南 03-316 体细胞染色体数
目存在不同情况，这与前人报道的对斑茅与甘蔗杂
交后代染色体分析的结果相似［19 ～ 20］。云南 03-316
体细胞含 15 条野生滇蔗茅染色体及 39 条热带种染
色体，甘蔗属热带种与蔗茅属-滇蔗茅远缘杂交过程
染色体以 n + n(整倍或非整倍的 n)方式进行传递，
导致甘蔗远缘杂交过程减半的配子与理论值 n存在
变数原因可能有 2 个:①甘蔗远缘杂交双亲的两套
染色体组存在异质性，传递给子代的染色体在数目
及 DNA含量存在差异，这可能导致受精后细胞在有
丝分裂时 DNA 复制、染色体配对、分离等过程中存
在不同步，使得部分染色体在分裂后期、子细胞核膜
形成之前没有进入细胞核而被降解丢失，或因为染
色体之间的碰撞和挤压等导致部分染色体不均衡地
进入到 2 个子细胞中［21］;②尽管在制片过程及染色
体计数方面已经非常小心谨慎，并选择较完整的细
胞进行观察和分析，但仍然不能完全排除人为造成
的染色体丢失、重叠、断裂或邻近细胞染色体混入产
生的误差。
细胞核的三维结构不仅直接反映染色体的分布
及配对等活动机制，而且它与基因的位置及表达情
况都有直接的关系。对杂种的细胞核进行研究可了
解双亲的染色质在杂种后代中的分布及其基本的活
动信息。染色体原位杂交等分子细胞遗传学方法的
应用对研究间期核和有丝分裂细胞中亲本染色体 /
染色质的行为和分布非常有效。Leitch 等［22］和 Li-
ma-Brito等［23］的研究表明杂种细胞核中双亲的染色
质并不相混合或仅极有限的混合。本研究结果表
明，远缘杂交 F1 代间期细胞核中双亲染色质绝大多
数各自存在于细胞核的不同空间而不相混合，但未
形成微核，仅少数染色质因父、母本探针的交叉杂交
有互相混合的现象，与王先宏等［24］的研究结果基本
一致。
作物远缘杂交种在有丝分裂和减数分裂过程
中，双亲本染色体在细胞内可能完全分开排列，以致
在分裂结束后双亲染色体分别被包含在不同的细胞
中，形成具有双亲染色体组的子细胞［25］。所以，进
一步对远缘杂交后代材料的有丝分裂和减数分裂染
色体行为进行研究，对甘蔗育种具有重要的科学意
义。
致 谢:本实验在中国科学院昆明植物研究所完成，
顾志建研究员在实验设计方面给予宝贵意见，杨静
博士在开展实验过程中给予极大的帮助和指导，在
此表示感谢。
参考文献:
［1］郑成木． 甘蔗核型及其染色体数目变化的研究［J］． 热带作物学
报，1993，14(2) :47 － 51．
［2］李文凤，蔡 青，黄应昆． 甘蔗野生资源对蔗茅柄锈菌的抗性
鉴定［J］． 植物保护，2005，31(2) :51 － 53．
［3］刘新龙，蔡 青，毕 艳，等． 中国滇蔗茅种质资源遗传多样性
的 AFLP分析［J］． 作物学报，2009，35(2) :262 － 269．
［4］李文凤，蔡 青，黄应昆，等． 甘蔗优良亲本及创新种质对蔗茅
柄锈菌的抗性鉴定［J］． 中国糖料，2007(4) :10 － 12．
［5］王丽萍，蔡 青，陆 鑫，等． 甘蔗近缘属野生种滇蔗茅(Erian-
thus rockii)的种质创新利用［J］． 中国糖料，2008(2) :8 － 11．
［6］何 红． 广西甘蔗种属间杂交现状及问题［J］． 广西甘蔗，1994
(1) :13 － 15．
［7］蔡 青，范源洪，Aitken K，等． 利用 AFLP 进行“甘蔗属复合
体”系统演化和亲缘关系研究［J］． 作物学报，2005，31(5) :
551 － 559．
［8］Cai Q，Aitken K，Fan Y H，et al． A preliminary assessment of the
genetic relationship between Erianthus rockii and‘Saccharum com-
plex’using microsatellite(SSR)and AFLP markers［J］． Plant Sci．，
2005，169:976 － 984．
［9］陆 鑫，毛 钧，刘洪博，等． 甘蔗野生种滇蔗茅种质创新利用
研究Ⅱ．甘蔗与滇蔗茅远缘杂交 F1 群体构建与 SSR分子标记鉴
定［J］． 植物遗传资源学报，2012，13(2) :321 － 324．
［10］陆 鑫，苏火生，林秀琴，等． 甘蔗野生种滇蔗茅种质创新利
用研究．Ⅱ．滇蔗茅 F1群体重要农艺性状的遗传分析［J］． 湖南
农业大学学报(自然科学版) ，2012，38(2) :121 － 124．
［11］李懋学，张学方． 植物染色体研究技术［M］． 哈尔滨:东北林
业大学出版社，1991．
［12］王丽萍，范源洪，蔡 青，等． 甘蔗种质资源杂交利用研究进
展［J］． 甘蔗，2003，10(3) :17 － 23．
［13］刘文荣，邓祖湖，张木清，等． 甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种
后代鉴定系列研究Ⅲ． 甘蔗斑茅远缘杂交后代细胞遗传分析
［J］． 作物学报，2004，30(11) :1093 － 1096．
［14］黄家雍，廖江雄，诸葛莹． 甘蔗与河八王、五节芒、滇蔗茅属间
交配性及杂种 F1 无性系的形态学和同工酶分析［J］． 西南农业
0331 西 南 农 业 学 报 26 卷
学报，1997，10(3) :92 － 98．
［15］经艳芬，桃联安，杨李和，等． 甘蔗杂交后代亲子关系真实性
同工酶鉴定研究初报［J］． 甘蔗糖业，2001(6) :1 － 4．
［16］郑学芳，张木清，李奇伟，等． 甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种
后代鉴定系列研究(二) :甘蔗斑茅远缘真实性杂种的分子鉴定
［J］． 分子植物育种，2004，2(1) :35 － 42．
［17］D’Hont A，Rao P S，Feldmann P． Identification and characteriza-
tion of sugarcane intergenetic hybrids Saccharum officinarum × Erian-
thus arundinaceus with molecular markers and DNA in situ hybridiza-
tion［J］． Theor Appl Genet，1995，91:320 － 326．
［18］Deng Z H，ZhangM Q，Lin W L，et al． Analysis of disequilibrium
hybridization in hybrid and backcross progenies of Saccharum offici-
narum × Erianthus arundinaceus［J］． Agriculture sciences in china，
2010，9(9) :1271 － 1277．
［19］Piperidis G，Christopher M J，Carroll B J，et al． Molecular contri-
bution to selection of intergeneric hybrids between sugarcane and the
wild species Erianthus arundinaceus［J］． Genome，2000，43:1033
－ 1037．
［20］Piperidis N，Chen J W，Deng H H，et al． GISH characterization of
Erianthus arundinaceus chromosomes in three generations of sugar-
cane intergeneric hybrids［J］． Genome，2010，53:331 － 336．
［21］刘传虎，张秋平，姚家玲，等． 龙须草核型分析和花粉母细胞
减数分裂的细胞学研究［J］． 中国农业科学，2007，40(1) :27 －
33．
［22］Leitch A R，Mosgoller W，Schwarzacher T，et al． Genomic in situ
hybridization to sectioned nuclei shows chromosome domains in grass
hybrids［J］． Journal of Cell Science，1990，95:335 － 341．
［23］Lima-Brito J，Guedes-Pinto H，Harrison G E，et al． Molecular cy-
togenetic analysis of durum wheat × tritordeum hybrids［J］． Genome，
1997，40:362 － 369．
［24］Wang X H，Yang Q H，Li F S，et al． Characterization of the chro-
mosomal transmission of intergeneric hybrids of Saccharum spp． and
Erianthus fulvus by Genomic in situ Hybridization［J］． Crop Sci．，
2010，50:1642 － 1648．
［25］李再云，华玉伟，葛贤宏，等． 植物远缘杂交中的染色体行为
及其遗传与进化意义［J］． 遗传，2005，27(2) :315 － 324．
(责任编辑 王家银)
13314 期 林秀琴等:甘蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂交 F1 代 GISH分析