全 文 ：分子植物育种，2009年，第 7卷，第 2期，第 251-256页
Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.2, 251-256
研究论文
Research Article
碱茅(Puccinellia tenuiflora) Put-R40g3基因的分离及其与逆境的应答
于雪飞 1 杨传平 1,2*
1东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室,哈尔滨, 150040; 2东北林业大学林木遗传育种黑龙江省重点实验室, 哈尔滨, 150040
*通讯作者, chunpingyang@163.com
摘 要 从碱茅(Puccinellia tenuiflora) cDNA文库中分离得到 Put-R40g3基因(登录号: AB465547)。克隆的
cDNA全长为 588 bp，其编码的蛋白质共 195个氨基酸，与水稻，小麦和拟南芥的 R40g3蛋白的氨基酸序列
有较高的同源性。对经逆境处理的碱茅幼苗根、叶中该基因的表达分析结果表明，碱茅中 Put-R40g3基因的
表达有被 ABA、盐和干旱诱导的趋势。Put-R40g3蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合在酵母细胞表达的蛋白质定
位研究结果显示了 Put-R40g3蛋白存在于细胞质中。同时 Put-R40g3基因在酵母中表达，酵母在盐、干旱及氧
化逆境条件下提高了对逆境的适应能力。这些结果暗示了 Put-R40g3基因是一个与逆境相关的基因。
关键词 碱茅, ABA,逆境, GFP,酵母
Isolation and Characterization of Put-R40g3 Gene in Puccinellia tenuiflora
Which Expressed in Response to Abiotic Treatments
Yu Xuefei 1 Yang Chuanping 1,2*
1 Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, 150040; 2 Hei-
longjiang Key Laboratory of Forest Tree Genetics and Breeding, Northeast ForestryUniversity, Harbin, 150040
* Corresponding author, chunpingyang@163.com
Abstract Put-R40g3 gene (accession number: AB465547) was isolated from Puccinellia tenuiflora. The ORF of
Put -R40g3 gene is 588 bp which encoded 195 amino acids and showed high similarity to R40g3 protein in
Triticum aestivum, Oryza sativa and Arabidopsis thaliana. RT-PCR analyses showed that the expression of Put-
R40g3 gene in root and leaf of P. tenuiflora was induced by several abiotic stresses from salts, drought and ABA
treatment. The Put-R40g3 protein was localized in cytoplasm by using the green fluorescent protein (GFP) marker.
Transgenic yeast expressing Put-R40g3 gene increased the resistance to salt, drought, oxidative stresses and ABA
treatment, which indicate Put-R40g3 gene is related to abiotic stresses.
Keywords Puccinellia tenuiflora, ABA, Stress, GFP, Yeast
基金项目：本研究由国家 973计划(2009CB119102)资助
植物的抗逆机制是一个复杂的过程，高盐、干
旱、氧化和低温往往导致脱落酸(abscisic acid, ABA)
在植物体内的积累，整个反应过程涉及植物的物理
和生物机制以及众多的基因。ABA能引起气孔的关
闭，维持植物体内水分平衡，保护质膜结构和功能，
提高植物的抗旱能力，这是一种重要的抗逆机制并
在众多的抗逆应答中都起到重要作用。同时，脱水处
理下产生的 ABA会诱导其它基因的表达(Narusaka
et al., 2003)。在启动子区域包含脱水应答元件
(drought responsive element, DRE)和 ABA应答元件
(ABA responsive element, ABRE)这两种顺势调控元件
的基因可以受到 ABA的诱导。磷酸化的 ABRE在高
盐、干旱和 ABA处理下可诱导基因的表达(Shinozaki
and Shiozaki, 2005; Furihata et al., 2006)。3种编码碱性
亮氨酸拉链结构的 ABRE结合蛋白由酵母单杂交系
统分离出来并被指定为 ABRE1、ABRE2 和 ABRE3
(ABA-responsive element binding factors) (Uno et al., 2000)。
在植物抗旱、耐盐及其它逆境的的研究中，克隆
得到的与逆境相关的基因中有一类基因，能同时被
ABA、高盐和干旱诱导。例如 PcSrp 基因在转基因
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小麦中提高小麦的抗盐性(Mahalakshmi et al., 2006)，
PDH45 基因能显著提高转基因烟草的抗盐性
(Sanan-Mishra et al., 2005)。在水稻中克隆出的 OS－
ISAP1基因在转基因烟草中可以提高烟草抗低温、
干旱和高盐逆境的能力(Mukhopadhyay et al., 2004)。
在西红柿中发现的 ABA和逆境诱导基因家族 ASR
(abscisic acid, stress and ripening inducible)是其中的典
型代表(Iusem et al., 1993; Amitai-Zeigerson et al., 1994;
Rossi and Iusem, 1994; Frankel et al., 2006)。这个基
因家族广泛分部于除拟南芥外的各种植物中(Car-
rari et al., 2004)。ASR1和 ASR2在高盐、高渗透压和
ABA处理下，mRNA水平和蛋白质水平的表达量都
有所提高，但是 ASR3却未被明显地诱导，此外，在
西红柿的根部 ASR2 是唯一能被诱导的基因(Ami-
tai-Zeigerson et al., 1995)。过表达 ASR1基因的烟草
对干旱和高盐的抗性都得到了提高 (Kalifa et al.,
2004)。与本研究中克隆的碱茅 Put-R40g3基因(登
录号: AB465547) 同源的水稻 OsR40g3基因特异性
的在根部表达并被 ABA 和高盐诱导(Moons et al.,
1997)。上述的这类基因与 ABA在植物体内的积累
或 ABA 处理有关，即随着 ABA 在植物体内的积
累，该基因的表达有明显的被诱导趋势，同时这类基
因与某些非生物逆境条件下基因的表达有着明显的
应答关系，通过遗传转化会赋予转化子对逆境的抵
抗性。因此，这类基因是在植物抗逆机理研究中较重
要的功能蛋白，特别是对进一步揭示 ABA信号途径
有重要的作用，然而还有很多的这一类别的蛋白其
生物学功能还不甚清楚。
本研究的试验材料碱茅属于单子叶盐土植物并
有很强的抗盐性(Peng et al., 2004)，从中克隆得到的
cDNA与 OsR40g3基因有很高的同源性并认为其是
碱茅中的 OsR40g3基因，因此被命名为 Put-R40g3
基因。碱茅中 Put-R40g3基因的表达特性和其中转
基因酵母中的抗性将在本文中进行分析。
1材料与方法
1.1材料
碱茅种子经消毒、灭菌后，放于 25℃恒温培养 2
周，湿度 80%，光照 12 h/d。培养 2周后分别对其进行
150 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaHCO3，75 mmol/L
Na2CO3，50 μmol/L ABA 和 10% (w/v) PEG6000 处
理。根和叶分别在 0 h、6 h、12 h、24 h和 48 h后取样，
液氮速冻，保存于-80℃冰箱中。
1.2表达载体构建和酵母转化
Put-R40g3基因用上游引物 5-GGATCCATG
GACTACTACCG-3 (BamHⅠ位点) 和下游引物
5-TCTAGACTAGTATGGCTGGA-3 (XbaⅠ位点)
进行扩增得到的片段连接到 T载体，再用 BamHⅠ、
XbaⅠ酶切质粒与载体，片段回收后连接到 pYES2载
体上，形成 pYES2-Put-R40g3。GFP基因通过 SmaⅠ
和 EcoRⅠ位点连接到 pYES2载体上，形成 pYES2-
GFP。构建质粒 pYES2-Put-R40g3-GFP，Put-R40g3
基因用上游引物 5-AAGCTTCATGGACTACTAC-
CGTGAG-3 (HindⅢ位点 ) 和下游引物 5-CC-
CGGGAGTATGGCTGGATC-3 (SmaⅠ位点 )进行
扩增所得到的片段连接到 pYES2-GFP上，构建成
pYES2-Put-R40g3-GFP。构建质粒 pYES2-GFP-Put-
R40g3时，利用 GFP基因上游引物5-AAGCTTATG-
GTGAGCAAGGGC-3 (HindⅢ位点)和其下游引物
5-GAATTCCTTGTACAGCTCGTC-3 (EcoRⅠ位点)进
行扩增得到的片段连接到 pYES2载体上；Put-R40g3
基因用上游引物 5-GAATTCATGGACTACTAC-
CG-3 (EcoRⅠ位点)和下游引物 5-TCTAGACTAG-
TATGGCTGGA-3 (XbaⅠ位点)进行扩增获得的片
段进行连接构建成质粒 pYES2-GFP-Put-R40g3。用
AcLi 转 化 法 把 质 粒 pYES2-GFP-Put-R40g3、
pYES2-Put-R40g3-GFP 和 pYES2-GFP 转化到酵母
(InVSc1)中。
1.3半定量 PCR分析
用 1.1 所述的各种经处理的材料提取植物总
RNA，提取方法采用 Trizol试剂盒提取。1 μg RNA
反转录成 cDNA。把 Actin基因的表达作为对照，其
上游引物为 GTGTCAGCCATACTGTGCCAATC，下
游引物为 TTGCTCATGCGGTCAGCAATACC。Put-
R40g3 基因的特异上游引物为 GGATCCATGGAC-
TACTACCG，下游引物为 GAGCTCCTAGTATG-
GCTGGA。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中检测，并使
用 ImageMaster TotalLab V2.01软件进行分析。
1.4酵母的培养及抗逆性分析
含有 pYES2-Put-R40g3 和 pYES2 载体的酵母
细胞在 5 mLYPD培养基中 30℃过夜培养。收集培养
物并加入 10 mL SC-U诱导培养基(2% (w/v)半乳糖,
1% (w/v)棉籽糖)，调 OD600至 0.5。在培养基中加入
800 mmol/L NaCl 和 10 mmol/L NaHCO3逆境，30℃
培养并分别在 0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和 20 h后收集
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菌液，记录 OD600的值和干物重的值。无逆境条件下培
养的菌液作为对照，整个试验重复 3次取平均值。
2结果与分析
2.1 Put-R40g3基因的克隆及其蛋白在酵母细胞中的
定位
构建碱茅 cDNA文库，经过规模化序列分析，分
离得到 Put-R40g3基因(登录号: AB465547)，其基因
全长为 869 bp，开放阅读框是 588 bp，编码了 195个
氨基酸，预测的分子量大小为 22.127 kD，理论等电点
是 7.62。通过 BLAST比对得知 Put-R40g3基因与分
别来自于小麦(登录号: DQ022951; 91%相似性)，水稻
(登录号: Os07g684000; 87%相似性)和拟南芥(登录号:
At2g39050; 62%相似性)的 R40g3基因等有较高相似
性(图 1)。从图 1可以看出 Put-R40g3的氨基酸序列
与水稻、小麦、同源性较强，Put-R40g3氨基酸序列与
拟南芥该蛋白氨基酸序列的长度要短，拟南芥的该蛋
白的 N端比 Put-R40g3长 100 个氨基酸以上，Put-
R40g3的氨基酸序列总体上虽然与拟南芥的同源虽
然只有 62%，但与拟南芥该蛋白从 N端起 100个氨
基酸以后的序列却有着很高的同源性，目前对该蛋白
功能的报道较少，只有在水稻中通过蛋白质组研究发
现了 OsR40g3蛋白特异性的在根部表达并被 ABA
和高盐诱导(Moons et al., 1997)。Put-R40g3蛋白是否
与水稻 OsR40g3一样也是与 ABA和高盐诱导有关，
在逆境中究竟发挥什么样的功能是值得研究的课题。
为了确定 Put-R40g3蛋白在细胞中的位置，在蛋
白的 C端和 N端分别与 GFP蛋白融合，构建完成的
质粒转化至酵母菌株 InVSc1，在含有半乳糖的诱导
培养基中培养。通过共聚焦显微镜观察，用 GFP载体
作为对照，其在酵母细胞中没有特定的位置 (图 2A;
2B; 2C)，融合蛋白 Put-R40g3-GFP和 GFP-Put-R40g3
图 1与碱茅 Put-R40g3同源的基因推测的氨基酸序列进行的比较
注:小麦:登录号 DQ022951;水稻:登录号 Os07g684000;拟南芥:登录号 At2g39050
Figure 1 Alignment of deduced amino acid sequences of Put-R40g3 in Puccinellia tenuiflora with that of other plant
Note: Triticum aestivum: Accession number DQ022951; Oryza sativa: Accession number Os07g684000; Arabidopsis thaliana: Acces-
sion number At2g39050
碱茅(Puccinellia tenuiflora) Put-R40g3基因的分离及其与逆境的应答
Isolation and Characterization of Put-R40g3 Gene in Puccinellia tenuiflora
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与对照相似，根据观察结果可判断为该蛋白在酵母中
表达主要分布在细胞质中(图 2D~2I)。
2.2 Put-R40g3基因在植物中的表达及其与环境逆境
的应答关系
为了了解碱茅 Put-R40g3基因的表达与逆境的
关系，本研究对碱茅的幼苗分别进行了 ABA、NaCl、
NaHCO3、Na2CO3和 PEG处理，通过半定量 RT-PCR
方法对根、叶中的 Put-R40g3基因进行解析。碱茅
Put-R40g3基因在不同逆境下的表达特性如图 3所
示，在 10% (w/v) PEG处理下，叶中 Put-R40g3基因
的表达量在处理后 12 h内逐渐上升，24 h后下降，在
根中，48 h 后才能检测到。对于 150 mmol/L NaCl、
150mmol/LNaHCO3和 75mmol/LNa2CO3的盐胁迫，
Put-R40g3基因在叶中的表达模式类似，即 24 h达到
最大值；在根中，NaCl处理没有明显提高 Put-R40g3
基因的表达量，而 NaHCO3和 Na2CO3处理 24 h后，
Put-R40g3基因的表达量明显增加。50 μmol/L ABA
处理下，Put-R40g3基因被诱导，叶中 12 h达到最大
值，根中 48 h后表达量最大。以上结果显示 Put-
R40g3在根、叶中有不同程度的被 ABA、盐(NaCl、
NaHCO3、Na2CO3)和干旱诱导的趋势，这个结果也暗
示了 Put-R40g3基因是一个与逆境密切相关的基因。
2.3 Put-R40g3基因在酵母中的表达及抗逆性分析
由于酵母是单细胞真核生物并与植物有着类似
的代谢途径，而且实验操作简单易行，本研究利用酵
母表达体系开展了转化酵母对逆境的耐性实验。为
了进一步了解 Put-R40g3基因在生物体内表达对逆
境的反应，把 Put-R40g3基因构建到酵母表达载体
上(YES2)并转化到酵母菌株中，同时把载体 YES2
转化至酵母中作为对照，然后检测转化酵母的抗逆
性。两种酵母菌株分别培养在 800 mmol/L NaCl和
10 mmol/L NaHCO3中。在无逆境条件下 Put-R40g3
基因的转化菌株和对照在 4~20 h的 OD值和干物重
平均值没有明显区别(数据未显示)。如图 4所示，在
800 mmol/L NaCl 和 10 mmol/L NaHCO3的逆境下，
对照被抑制，而 Put-R40g3基因的转化菌株的 OD值
图 2 Put-R40g3与 GFP融合蛋白在酵母细胞定位实验
注: A~C: GFP蛋白在酵母细胞中的表达 GFP荧光检测结果; D~F: Put-R40g3-GFP融合蛋白在酵母细胞中表达 GFP荧光检测
结果; G-I:融合蛋白在酵母细胞中表达 GFP荧光检测结果
Figure 2 Put-R40g3-GFP fusion protein is located at cytoplasm in yeast cell
Note: A~C: Expression of the GFP protein in yeast cell; D~F: Expression of the Put-R40g3-GFP fusion protein in yeast cell; G~I: Ex-
pression of the GFP-Put-R40g3 fusion protein in yeast cell
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图 3 RT-PCR对 Put-R40g3基因表达特性的分析
Figure 3 Analysis of the expression characteristics of Put-R40g3 by RT-PCR
图 4 Put-R40g3基因在不同盐胁迫下的表达特性
注: A: 800 mmol/L NaCl胁迫下的 OD600值; B: 10 mol/L NaHCO3胁迫下的 OD600值; C: 800 mmol/L NaCl胁迫下的干物重平均
值; D: 10 mol/L NaHCO3胁迫下的干物重平均值
Figure 4 Expression characteristics of Put-R40g3 gene under different salt stresses
Note: A: The OD600 values of 800 mmol/L NaCl stress; B: The OD600 values of 10 mol/L NaHCO3 stress; C: The average dry weights
of 800 mmol/L NaCl stress; D: The average dry weights of 10 mol/L NaHCO3 stress
碱茅(Puccinellia tenuiflora) Put-R40g3基因的分离及其与逆境的应答
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和干物重平均值都较对照高。这些结果暗示了 Put-
R40g3基因在酵母中表达能够明显提高酵母的抗盐
能力。
综上所述，本研究分离得到的 Put-R40g3基因与
水稻 Os-R40g3同源并有较高的同源性，通过 GFP标
记技术进行了蛋白定位研究，其结果显示了在酵母细
胞内 Put-R40g3基因编码的蛋白存在于细胞质中(图
2)，因此 Put-R40g3蛋白是存在于细胞质中的一种功
能蛋白质。Put-R40g3基因的表达与水稻 Os-R40g3
基因相似，有被 ABA、盐、干旱诱导的趋势，但水稻
Os-R40g3基因特异性的在根部表达并被 ABA和高
盐诱导(Moons et al., 1997)，而 Put-R40g3基因不仅在
根中，而且在叶中对各种逆境处理都有被诱导的趋
势，并且 Put-R40g3基因在酵母中的表达提高了其在
盐，干旱及氧化逆境条件下对逆境的适应能力。这些
结果都暗示了 Put-R40g3基因是一个与逆境相关的
基因。然而 Put-R40g3蛋白究竟是一个什么性质的蛋
白和其在细胞内的生化功能还不清楚，因此
Put-R40g3蛋白在抗逆机理中所扮演的角色还有待于
深入研究。
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