全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 4期，第 631-639页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.4, 631-639
研究报告
Research Report
朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶的基因克隆和表达
管清杰 1 李琳 1 高野哲夫 2 柳参奎 1*
1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心, 哈尔滨, 150040; 2东京大学亚洲生物资源环境研究中心,东京, 1880002,日本
*通讯作者, shenkuiliu@nefu.edu.cn
摘 要 本研究从朝鲜碱茅叶 cDNA文库分离得到序列长 1 125 bp，开放读码框 ORF区 876 bp，编码 291
个氨基酸的抗坏血酸过氧化物酶基因(PutAPx)全长 cDNA。推测的编码蛋白质的相对分子质量和等电点分
别为 32 kD和 7.71。同源性比较发现，PutAPx基因与禾本科 5个物种(水稻、大麦、小麦、黑麦草和玉米)在
氨基酸水平上具有高度(89.7%, 94.3%, 94.2%, 50.7%和 79.6%)的同源性。系统发育树显示朝鲜碱茅与大
麦、小麦遗传距离最近，跨膜结构与亚细胞定位表明为过氧化物体 APX。将该基因构建到酵母表达载体
pYES2-PutAPx，并导入酵母 IVSC1菌株后在半乳糖的诱导下分析具有抗氧化性。本研究成功克隆了抗坏
血酸过氧化物酶基因(PutAPx)编码区，并做了初步分析，为进一步研究逆境诱导的氧化胁迫的作用机理研
究奠定了基础。
关键词 朝鲜碱茅,抗坏血酸过氧化物酶,基因克隆
Cloning of an Ascorbate Peroxidase Gene from Puccinellia tenuiflora and its
Expression Analysis
Guan Qingjie 1 Li Lin 1 Tetsuo Takano 2 Liu Shenkui 1*
1 Alkali Soil Natural Environmental Science Center (ASNESC), Northeast Forestry University, Harbin, 150040; 2 Asian Natural Environment Science
Center (ANESC), The University of Tokyo, Tokyo, 1880002, Japan
* Corresponding author, shenkuiliu@nefu.edu.cn
DOI: 10.3969/gab.028.000631
Abstract The full-length gene of an ascorbate peroxidase (PutAPx) was isolated from Puccinellia tenuiflora Ohwi
cDNA library. The gene is 1 125 bp in length and it has an ORF of 876 bp, which encoded a protein of 291
amino-acid with an estimated molecular weight 32 kD and an isoelectric point of 7.71. Blasting at NCBI, we found
that PutAPx showed high similarity (89.7%, 94.3%, 94.2%, 50.7% and 79.6%) to 5 different gramineae species (O－
ryza sativa L., Hordeum vulgare L., Triticum aestivum, Lolium perenne L., and Zea mays). The result of phylogenetic
tree showed that PutAPx has the closdest genetic distance with Hordeum vulgare L. and Triticum aestivum. Trans-
genic yeast (InVSC1), expressing PutAPx gene, under the inducement with β-galactose showed higher stress resis-
tance in oxidation stress than control. In this study, we succeeded cloned an ascorbate peroxidase (PutAPx) and
studied in primary levle, which established the foundation for the future study in the mechanism of oxidative stress
mechanism of the role of the foundation establish.
Keywords Puccinellia tenuiflora. Chinampoensis Ohwi, Ascorbate peroxidase, Gene cloning
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000631
基金项目：本研究由东北林业大学青年科研基金(07049)和哈尔滨市青年科技创新资金项目(RC2007QN002079)共同资助
朝鲜碱茅 (Puccinellia tenuiflora. Chinampoensis
Ohwi)分布于我国北方地区，是丛生在草甸草原、盐
渍化土壤中的多年生禾本科牧草，对盐碱有极强抗
性的先锋盐生植物，生长五叶的碱茅幼苗，在土壤碱
度 pH 10以上、表土含盐量 5%以上的碱斑，仍能生
长良好，这是长期进化选择的结果(李建东和杨允菲,
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
2004)。因此，它不仅是一种优良的牧草，还是一种宝
贵的盐生种质资源、耐盐碱的基因资源。
目前，植物的抗盐碱机理、分子强化选育抗盐植
物品种的关键，就是从盐生植物里分离抗盐功能基
因。碱茅已被从事抗盐胁迫研究者广泛关注，其基因
也陆续被研究者克隆登录，NCBI GenBank登录的碱
茅基因有：甜菜碱醛脱氢酶(EF095710)；H+-ATPase
(DQ090006)、NADH-谷氨酰胺合成蛋白(DQ093360)、
热激蛋白(DQ093361)、谷胱酐肽转移酶(DQ093362)、
Na+/H+泵(EF440291)、H+泵 PutCAX1 (AB472071)、铁
蛋白(DQ090999)、PutPMP3-1(AB363567)、PutPMP3-2
(AB363568)、Actin (FJ545641)、Put-R40g3(AB465547)、
dehydroascorbate reductase protein (DQ090998)和 Put-
Cu/Zn-SOD基因等。盐胁迫下，细胞内会产生氧自由
基 O2-、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(OH-)等活性氧
(ROS)，导致氧化胁迫的产生(单雷等, 2006)。抗坏血
酸过氧化物酶 APX (ascorbate peroxidase.APX, EC1.
11.1.11)是清除 H2O2的主要酶类，以还原型抗坏血
酸为反应底物，它催化 H2O2还原为 H2O的反应，对
抗坏血酸具有很高的特异性和亲和性，消耗 H2O2产
生单脱氢抗坏血酸，单脱氢抗坏血酸可通过不同的
途径被还原成抗坏血酸(Asada, 1992; Shigeoka et al.,
1980a; 1980b)。近十年来，已有多种植物的 APX基因
被克隆出来，并对其特性进行了研究，菠菜(Ishikawa
et al., 1995)和拟南芥(Kubo et al., 1992)的胞质型 APX
与强光及 MV逆相关；水稻(Lu et al., 2007)、白桦苗
木(王超等, 2009)和盐地碱蓬(马长乐等, 2002)胞质型
APX受盐胁迫诱导表达增加。核酸数据库搜索结果
表明，多数 APX基因，如葡萄(Lin et al., 2006)、辣椒
(Yoo et al., 2002)、豌豆(Mittler and Zilinskas, 1991)等
对其结构、酶动力学特性进行相关的比较研究结果
表明，具有一致的酶学特性，与反应底物抗坏血酸具
有更高的特异性，但在缺乏底物时更易于失活
(Yoshimura et al., 1998; Nishikawa et al., 2003)。作为
抗氧化系统中清除盐碱胁迫产生的 H2O2的主要酶
类——抗坏血酸过氧化物酶基因还未见从朝鲜碱茅
克隆登录。
本研究克隆朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶基因
编码区，并通过生物学软件初步分析序列，RT-PCR
分析组织特异表达性，酵母过量表达分析抗氧化功
能，为进一步研究其在该抗氧化性的作用机理奠定
了基础。如用于培育具有抗盐碱性的牧草饲料植物
新品系育种，在开发盐碱地上得以应用，这将具有重
大的经济效益、社会效益、生态效益。
1材料与方法
1.1植物材料
以朝鲜碱茅成株为实验材料，采自东北林业大
学盐碱地生物资源环境研究中心安达实习基地，由
金洙哲教授鉴定。
1.2试剂
朝鲜碱茅的cDNA文库(用 150 mmol/L NaHCO3
处理)由本实验室构建完成；大肠杆菌(Escherichia
coli)菌株 JM109 和酵母菌株(IVSc1)由本实验室保
存。DNA回收纯化试剂盒、pMD18-T载体、Taq聚合
酶、T4 DNA连接酶和限制性内切酶，购自大连宝生
物公司。DNA测序与引物合成由 Invitrogen上海生
物公司完成。其它试剂为国产分析纯。
1.3目的基因 DNA片段的获得
应用生物学软件(Primer5.0)设计载体 PSK通用
引物(F1: 5-GGATCCGGGCCCTTTATTCTA-3, R1:
5-GAGCTCGGGCCCTTACTTGCT-3)，以朝鲜碱茅
的 cDNA文库的质粒(PSK-46)为模板 PCR扩增，从
cDNA文库中调取朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶基因
(Ascorbate peroxidase of Puccinellia tenuiflora. Chi－
nampoensisOhwi: PutAPx)全长基因片段。
PCR反应体系 20 μL (ddH2O 12.0 μL; Pn 1.0 μL;
Pm 1.0 μL; 10×Buffer 2.0 μL; dNTP 2.0 μL; cDNA
1.0 μL; Taq酶 1.0 μL)。PCR扩增程序：94℃，2 min；
94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃，10min；
4℃结束。
1.4重组质粒 DNA的提取与酶切鉴定
采用煮沸法提取质粒 DNA，详见分子克隆实验
指南(萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)。
质粒 DNA的酶切鉴定：用 HindⅢ/EcoRⅠ限制
性内切酶对提取质粒 DNA进行酶切鉴定，产物进行
琼脂糖凝胶电泳，检测切片段的大小；鉴定为阳性克
隆的菌株，送往公司进行测序，所得克隆命名为
pT-PutAPx，保存于-70℃冰箱。
1.5 PutAPx基因的序列分析
利用 BLAST 与网上 NCBI GenBank 核酸数据
库进行同源比较，通过网络(http://www.ncbi.Nlm.Nih.
gov/gorf/gorf.html)分析起始位点以及终止子功能区
ORF；应用 DNAStar分析软件比较朝鲜碱茅 PutAPx
基因与拟南芥 NP195226、水稻 AK070842、大麦
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.028.000631632
BAB6253、小麦 EF555121、黑麦草 EF495352、玉米
BT016732的 APX在氨基酸水平上的相似性；使用在
线服务器(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph)上的工具
软件 ProtParam对 PutAPx进行蛋白质跨膜结构分析；
用 PSORT 对该氨基酸序列进行亚细胞定位分析，
ProtCompVersion 611软件(http://www.softberry. comp
berry.phtml)对 PutAPx基因进行亚细胞定位预测。
1.6 酵母表达载体 pYES2-PutAPx 的构建及其转化
酵母的抗氧化性分析
利用 pT-PutAPx重组质粒进行 PCR，使其质粒
DNA的 ORF两端添加 BamHⅠ和 XbaⅠ酶切位点，
再用 BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切，1% Agarose电泳分离
回收双酶切产物(pYES2载体 /目的基因片段)，将其
用 T4 DNA连接酶连接，转化至大肠杆菌 JM109中，
经 BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切检测构建的重组质粒命
名为 pYES2-PutAPx。
将构建好的质粒 pYES2-PutAPx通过醋酸锂转
化法(Goetz et al., 1995)，导入到酵母菌株 INVScI并
PCR检测(F2: 5-ggATCCATggCggCCCCggT-3; R2:
5-TCTAgATTACTTgCTCCTCTTg-3)，阳性克隆在
SD固体培养基培养，把 pYES2-PutAPx和 pYES2转
化酵母菌株稀释成不同浓度，在分别添加 0、2mmol/L、
4 mmol/L、8 mmol/L 和 16 mmol/L H2O2 逆境的 SD
固体培养基上培养处理，原始浓度为 OD600为 2，酵
母菌液分别稀释成 100倍、10-1倍、10-2倍、10-3倍和
10-4倍，然后后在 30℃培养，直接观察生长状态，由
此比较重组转化体酵母对氧化逆境的适应状况。
1.7朝鲜碱茅 PutAPx基因组织表达特异性分析
取朝鲜碱茅开花期的叶、根、茎、叶鞘、花药、雌
花、花茎以及受粉后的穗为组织特异表达的实验材
料，利用 Trlzol一步法提取各组织总 RNA，应用试剂
盒反转录为 cDNA，特异引物(F3: 5-CGATGGCGGC
CCCGGTGGTG-3; R3: 5-CCTTACTTGCTCCTCT
TGGA-3) PCR扩增 30个循环(退火温度为 56℃)，产
物 0.8%琼脂糖凝胶电泳分析 PutAPx基因在其各组
织中的特异表达特性。
2结果与分析
2.1 PutAPx基因序列的获得
以载体通用引物(F1和 R1)PCR扩增 cDNA文
库中质粒(PSK-46)，产物经琼脂糖凝胶电泳，显示有
1 000 bp左右基因条带(图 1)。用 DNA回收胶试剂盒
回收目的 DNA，与 T载体 16℃下连接反应 16 h后，
热激转化到大肠杆菌(JM109)氨苄氰霉素 50 mg/L的
阳性克隆 T#1、T#2、T#3 和 T#4，煮沸法提取质粒
DNA酶切鉴定，结果显示酶切(HindⅢ/ ECoRⅠ)为 3
条带，PMD18-T约 2.7 kb；T#1、T#2和 T#4为 700 bp
加上 400 bp左右的插入片段，与插入目基因大小相
符；T#3插入片段略小(图 2)。取 T#2号菌株送样测
序，质粒命名为 pT-PutAPx。
图 1 PutAPx基因的 PCR扩增
注: M: Marker-λ/HindⅢ; 1~3: PCR产物
Figure 1 PCR product of PutAPx gene
Note: M: Marker-λ/HindⅢ; 1~3: PCR products
图 2 pMD18-T-PutApx酶切鉴定
注: M: Marker-λ/HindⅢ; 1~4:分别为 PMD18-T 插入目的基
因阳性克隆质粒 T#1, T#2, T#3和 T#4
Figure 2 Identification of pMD18-T-PutApx confirmed by en-
zyme digestion
Note: M: Marker-λ/HindⅢ ; 1~4: pMD18-T-PutApx positive
clones (T#1, T#2, T#3 and T#4) confirmed by enzyme digestion
2.2 抗坏血酸过氧化物酶基因(PutAPx)序列分析
2.2.1抗坏血酸过氧化物酶基因(PutAPx)起始与终止
分析及氨基酸的推定
通过对测序的报告分析整理，将获得目的基因的
1 204 bp核苷酸序列利用 BLAST工具与网上 NCBI
GenBank中核酸数据库进行同源比对。比对分析结果
表明，目的基因序列与抗坏血酸过氧化物酶基因
(PutAPx)高度同源(86%以上)，且得分较高(最高可达
到 1 285)，推测其编码的蛋白质极有可能是抗坏血酸
朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶的基因克隆和表达
Cloning of an Ascorbate Peroxidase Gene from Puccinellia tenuiflora and its Expression Analysis 633
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
基因分别与拟南芥 NP195226、水稻 AK070842、大麦
BAB6253、小麦 EF555121、黑麦草 EF495352和玉米
BT016732的 APX进行比较，结果在氨基酸水平上
具有高度(70.7%, 89.7%, 94.3%, 94.2%, 73.7%以及
79.6%)的相似性(图 4)；它们的系统发育树(图 5)同样
显示了与同是禾本科植物大麦、小麦和水稻的氨基
酸具有更高度的同源性，PutAPx基因与 5个物种的
高度相似性说明禾本科物种 APX进化非常保守。这
些揭示 PutAPx基因翻译的蛋白质应具有抗坏血酸
过氧化物酶的活性。
过氧化物酶(表 1)。通过网络将其 1 204 bp的核苷酸
进行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行
分析，结果显示了起始位点自第 74个核苷酸开始，
终止于第 949个核苷酸，功能区 ORF为 876 bp，推
定其由 291aa构成，可以判断为朝鲜碱茅抗坏血酸
过氧化物酶基因(PutAPx) (图 3)。
2.2.2 PutAPx基因推定氨基酸的同源性比较及进化
树分析
应用DNAStar分析软件对获得的朝鲜碱茅 PutAPx
表 1 NCBI BLAST核苷酸同源性比对
Table 1 Sequences homology alignments of nucleotide sequence by NCBI BLAST
登录号
Accession
AK251405.1
AB063117.1
EF555121.1
NM_001068974.1
CT841589.1
CT832438.1
CT832436.1
AK104490.1
AK070842.1
CU405801.1
EU976229.1
种类
Species
野生大麦 cDNA克隆: FLbaf108f14, mRNA序列
Hordeum vulgare subsp. vulgare cDNA clone: FLbaf108f14, mRNA se-
quence
野生大麦过氧物酶体型抗坏血酸过氧化物酶(HvAPX1) mRNA全长
Hordeum vulgare HvAPX1 mRNA for peroxisome type ascorbate perox-
idase, complete cds
小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX) mRNA全长
Triticum aestivum peroxisomal ascorbate peroxidase (APX) mRNA,
complete cds
水稻(日本晴) Os08g0549100 mRNA全长
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os08g0549100 (Os08g0549100)
mRNA, complete cds
普通野生稻(W1943) cDNA克隆: ORW1943C103I13,全长插入序列
Oryza rufipogon (W1943) cDNA clone: ORW1943C103I13, full insert
sequence
水稻(印度稻) cDNA克隆: OSIGCSN015H07,全长插入序列
Oryza sativa (indica cultivar-group) cDNA clone: OSIGCSN015H07, full
insert sequence
水稻(印度稻) cDNA克隆: OSIGCRA102O15,全长插入序列
Oryza sativa (indica cultivar-group) cDNA clone: OSIGCRA102O15,
full insert sequence
水稻(日本晴) cDNA克隆: 006-302-B09,全长插入序列
Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA clone: 006-302-B09, full
insert sequence
水稻(日本晴) cDNA克隆: J023074O14,全长插入序列
Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA clone: J023074O14, full in-
sert sequence
普通野生稻(W1943) cDNA克隆: ORW1943C004J17,全长插入序列
Oryza rufipogon (W1943) cDNA clone: ORW1943C004J17, full insert
sequence
玉米克隆 688596APx4-抗坏血酸过氧化物酶mRNA全长序列
Zea mays clone 688596 APx4-Peroxisomal Ascorbate Peroxidase mR-
NA, complete cds
最高得分
Max score
1 285
1 285
1 279
1 137
1 131
1 131
1 131
1 131
1 131
1 126
957
总得分
Total score
1 285
1 285
1 279
1 137
1 131
1 131
1 131
1 131
1 131
1 126
957
相似性(%)
Similarity (%)
86
89
86
91
91
91
91
91
91
91
88
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.028.000631634
2.2.3抗坏血酸过氧化物酶基因(PutAPx)亚细胞定位
预测及跨膜结构分析
亚细胞定位预测：用 PSORT对该氨基酸序列进
行亚细胞定位预测分析，将 PutAPx基因推定的编码
氨基酸输入分析系统，结果显示 PutAPx定位于细胞
质(0.700)和过氧化物体(0.671)的可能性非常大(表 2)。
跨膜结构分析：使用在线服务器(http://www.
cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph)上的工具软件 ProtParam 对
PutAPx基因编码的蛋白质进行跨膜结构分析。结果
显示，该蛋白含有 1个跨膜结构域。与前面蛋白同源
性比对、功能、结构域分析高度同源的大麦 HvAPx基
因为过氧化物体酶相一致，PutAPx基因编码的蛋白
是细胞质过氧化物体基因编码的分泌蛋白，在细胞质
中合成，最后通过蛋白转运系统定位于过氧化物体上
的过氧化物体抗坏血酸过氧化物酶基因(图 6)。
2.3 PutAPx 基因在酵母中氧化胁迫(H2O2)下的表达
分析
本部分研究试图通过在酵母中过量表达朝鲜碱
茅 PutAPx基因，检测转化酵母在 H2O2氧化胁迫条
件下的生长状况，来验证朝鲜碱茅 PutAPx基因的抗
氧化性功能。
酵母表达载体的构建：双酶切增加 BamHⅠ和
XbaⅠ位点的 pT-PutAPx 质粒和 pYES2 载体 DNA
后连接转化至大肠杆菌 JM109中阳性克隆，煮沸法
提取质粒 DNA后 BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切检测(图
7A)有 882 bp目的条带插入，表明酵母表达载体构建
完成，命名为 pYES2-PutAPx；将构建好的质粒
pYES2-PutAPx质粒 DNA通过醋酸锂转化法，导入
到酵母菌株(INYSc1)并 PCR检测(F3和 R4) 4个阳
性克隆均有 882 bp的主带(图 7B)，证明均导入了目
的基因。
转化后的酵母菌株 (INYSc1)，在不同浓度的
H2O2＋SD 培养基上进行抗氧化胁迫的实验检测表
明：在 0、2 mmol/L和 4 mmol/L H2O2＋SD培养基上
生长表现差异不明显(图 8)；过量表达 PutAPx 基因
图 3目的基因核苷酸序列的 ORF分析
Figure 3 Open reading frame and amino acid sequence
表 2亚细胞定位分析
Table 2 Analysis of subcellular location
位置
Location
细胞核
Nucleus
质膜
Plasma membrane
内质网
Endoplasmic reticulum
评分
Score
0
0
0
位置
Location
线粒体
Mitochondrion
过氧化物体
Peroxisome
叶绿体类囊
Chloroplast thylakoid
评分
Score
0.218
0.700
0.432
朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶的基因克隆和表达
Cloning of an Ascorbate Peroxidase Gene from Puccinellia tenuiflora and its Expression Analysis 635
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 4朝鲜碱茅 PutAPx基因推定氨基酸与水稻、大麦、小麦、黑麦草、玉米及拟南芥 APX氨基酸同源性比较
Figure 4 Homologous analysis of amino acid sequence of PutAPx gene with amino acid sequence of Oryza sativa L., Hordeum vulgare
L., Triticum aestivum, Lolium perenne L., Zea mays and Puccinellia tenuiflora
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.028.000631
的酵母菌落在 8 mmol/L H2O2胁迫下生长(图 8)表现
出抗氧化逆境生长差异。随着稀释倍数的增加表现
出过量 PutAPx基因的酵母菌生长势明显好于导入
载体的对照，稀释 10-4时对照几乎不能生长，而过
量 PutAPx酵母菌克隆生长良好，这个结果表明了导
入的 PutAPx基因在酵母体内过量表达后，能够提高
酵母在氧化胁迫状态下的生长状况，对组织和细胞
起到了保护作用，从而提高酵母的抗氧化逆境，也
暗示克隆的朝鲜碱茅 PutAPx基因具有良好的抗氧
化能力。
636
2.4 PutAPx 基因在朝鲜碱茅各组织的 mRNA 表达
RT-PCR分析
对生长期间组织特异表达 RT-PCR 分析表明：
PutAPx基因在朝鲜碱茅各组织中的表达特异性明显，
PutAPx mRNA在各组织中表达的相对量依次为受
粉后的穗、穗茎、花药、叶鞘、茎、叶、根和雌花(图 9)。由
此可见，PutAPx基因在各组织中普遍有表达，在穗表
图 5 PutAPx基因核苷酸系统发育树
Figure 5 Evolutionary tress analysis of PutAPx
图 6坏血酸过氧化物酶基因(PutAPx)跨膜结构分析
Figure 6 Prediction of PutAPx transmembrane domain
图 7酵母表达载体 pYES2-PutAPx构建及导入酵母菌株(IN-
YSc1)的 PCR检测
注:M:Marker-λ/HindⅢ; A: 1,2为酵母表达载体 pYES2-PutAPx
质粒 DNA双酶切(BamHⅠ/XbaⅠ)的 PCR鉴定; B: 1~4为表
达载体 pYES2-PutAPx质粒 DNA导入酵母菌 4个阳性克隆
菌株特异引物 PCR鉴定
Figure 7 pYES2-PutAPx confirmed by enzyme digestion and
PCR detection of transformant of yeast
Note:M:Marker-λ/HindⅢ; A: 1,2: pYES2-PutAPx fusion plasmid
confirmed byenzyme (BamHⅠ/XbaⅠ);B: 1~4: PCR detection of
transformant of yeast with pYES2-PutAPx
图 8过量表达朝鲜碱茅 PutAPx基因酵母抗 H2O2胁迫分析
注: SD为尿嘧啶缺失酵母培养基;A:转化 PutAPx和 pYES2的酵
母菌株在SD培养基上的生长情况(二次重复);B:转化 PutAPx和
pYES2的酵母菌株在 SD 培养基上添加 8 mmol/L H2O2胁迫
下的生长特性(二次重复)
Figure 8 Hyper-resistance of PutAPx overexpression cells to H2O2
stresses
Note: SD is Ura supplement media; A: PutAPx over expressing
cells pYES2-PutAPx and the pYES2 cells were grown on SD me-
dia (two repeat); B: PutAPx over expressing cells pYES2-PutAPx
and the pYES2 cells were grown on SD media with 8 mmol/L
H2O2 (two repeat)
图 9 PutAPx基因在碱茅各组织的 mRNA表达
注: 1~8分别为 PutAPx和 Actin在叶,根,茎,穗, 穗茎, 叶鞘,
花药和花中的表达; Actin:组成型基因(control)
Figure 9 PutAPx gene expression in different organ
Note: 1~8: PutAPx gene and Actin gene expression in leaf, roots,
stem, ear, ear stem, sheath, anther and flower; Actin: Constitutive
gene (control)
朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶的基因克隆和表达
Cloning of an Ascorbate Peroxidase Gene from Puccinellia tenuiflora and its Expression Analysis 637
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
达量最强，穗茎、花药和叶鞘表达量较强，在雌花中
表达量最弱。
3讨论
干旱、盐碱、低温以及高温等多种逆境将破坏植
物活性氧解毒系统，使活性氧累积损伤细胞膜，防止
过氧化损的活性氧清除酶类-抗坏血酸过氧化物酶
(APX, EC1.11.1.11)它催化 H2O2还原为 H2O的反应，
对抗坏血酸具有很高的特异亲和性，消耗 H2O2产生
单脱氢抗坏血酸，单脱氢抗坏血酸可通过不同的途径
被还原成抗坏血酸(鲁松清等, 1998)。Northern杂交
分析结果表明盐地碱蓬 APX基因在盐(400 mmol/L
NaCl)胁迫下表达量增加，而且酶的活性也显著地增
加，说明该基因受盐诱导，推测 APX可能在保护盐
地碱蓬免受氧化损伤的过程中起到一定作用(马长乐
等, 2002)。
朝鲜碱茅是一种重要的抗盐牧草，是我国北方
盐渍化草地的主要建群种及重要的先锋植物(李建
东和杨允菲, 2004)，也是植物抗逆领域研究的珍贵材
料，并具有极强的抗寒、耐旱、抗盐碱特性。本研究由
朝鲜碱茅叶 cDNA文库克隆了 PutAPx 基因(图 1)，
应用生物分析软件检测编码蛋白的相对分子质量和
等电点分别为 32 kD和 7.71，与水稻 OsAPx3及 Os-
APx4核苷酸数和蛋白的相对分子质量相同(Teixeira
et al., 2004; Miyazaki et al., 2003)，氨基酸同源性表明
与禾本科水稻(89.7%)、大麦(94.3%)、小麦(94.2%)、黑
麦草(73.7%)、玉米(79.6%)都具有高度的相似性，对
PutAPx基因编码蛋白质跨膜结构分析表明含有 1个
跨膜结构域，亚细胞定位分析预测表明最可能定于过
氧化物体与报道的大麦 HvAPX1 (Shi et al., 2001)相一
致，PutAPx基因在朝鲜碱茅各组织普遍有表达，在穗、
穗茎、花药及叶鞘表达量最强，在雌花中表达量最弱，
植物体普遍存在过氧化物体。在半乳糖的诱导下转化
后的酵母菌株(INYSc1)抗氧化胁迫的实验结果(图 8)
表明，过量表达 PutAPx基因的酵母落在 8 mmol/L
H2O2胁迫下明显表现出抗氧化逆境能力好于对照，说
明其表达的酶催化 H2O2还原为 H2O的反应，从而使
转基因酵母在含 H2O2的 SD培养基生长良好，对组织
和细胞起到了保护作用，体现了在氧化胁迫状态下抗
坏血酸过氧化物酶作用。
本研究成功克隆了抗坏血酸过氧化物酶基因
(PutAPx)，并做了初步分析，为进一步研究逆境诱导
下氧化胁迫的作用机理研究奠定了基础。
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