全 文 ：收稿日期:2009-02-18
基金项目:辽宁省农业生物技术重点实验室专项基金 ,沈阳市农业生物技术实验室专项基金(1041003-1-03)
作者简介:钟　鸣(1971-),女 ,辽宁大连人 ,副教授 ,博士 ,主要从事植物生物技术的研究。
朝鲜碱茅 BADH 基因 3′端及 5′端部分序列的扩增
钟　鸣 ,张　佳 ,郭志富 ,张　丽 ,王　磊
(沈阳农业大学 ,辽宁省农业生物技术重点实验室 ,辽宁沈阳　110161)
　　摘要:为探索朝鲜碱茅的耐盐 , 耐寒和耐旱的抗性机理 ,从已知禾本科植物朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的
一段保守区序列 ,以此序列为研究基础 ,结合其他禾本科植物的 BADH 基因保守区序列设计引物 ,扩增出朝鲜碱茅
BADH基因 3′端序列及 5′端部分序列共 1 502 bp。经 BLAST比对 , 结果表明 ,获得到的朝鲜碱茅 BADH 基因序列与羊草
和大麦的 BADH 基因的同源性达到 89%, 含有保守的十肽序列和其后 29位与酶功能有关的 Cys。
关键词:朝鲜碱茅;甜菜碱醛脱氢酶;聚合酶链式反应;RACE
中图分类号:Q78　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2009)03-0046-05
The Amplification of BADH Gene 3′and 5′End from Puccinellia chinampoensis
ZHONG Ming ,ZHANG Jia ,GUO Zhi-fu , ZHANG Li ,WANG Lei
(Shenyang Agricultural University ,Shenyang　110161 ,China)
Abstract:Part of conservative sequence of BADH from Puccinellia chinampoensis has been already known and was
used as the basis of the research when specific primer was designed.The BADH gene of Puccinellia chinampoensis was
cloned by SMART RACE.These two fragments were assembled and the result showed that we obtained the 3′end and part
of 5′end.The sequence was 1 502 bp in length , its nucleotide sequence share 89%with the cDNA of BADH from Ley-
mus chinensis and Hordeum brevisubulatum.Its deduced amino acid sequence contains the conserved domain sequence
VTLELGGKSP of BADH and the Cys associated with aldehyde dehydrogenase function.
Key words:Puccinellia chinampoensis;BADH;PCR;RACE
　　朝鲜碱茅为禾本科碱茅属牧草 ,是我国东北 、华
北和西北地区改良盐渍土地的优良先锋植物[ 1] 。与
其他盐生植物一样 ,朝鲜碱茅在体内可大量积累甜
菜碱进行渗透调节以适应不良环境 ,具有较强的耐
盐 、耐旱和耐寒性。在植物中 ,甜菜碱的合成经 2步
催化而成 ,其第二步是由甜菜碱醛脱氢酶(Betaine
aldehyde dehydrogenase ,BADH)催化 。目前 ,人们已先
后从禾本科植物大麦(Hordeum vulgare)、高粱
(Sorghum bicolor)、水稻(Oryzsativ)、小麦(Triticum
aestivum)中分离得到 BADH 基因[ 2-11] ,并成功地获
得了表达 BADH 基因活性的转基因植株[ 12-14] 。本
试验从朝鲜碱茅中分离了 BADH 基因 3序列和 5的
部分序列 ,并对其进行了序列分析 。
1　材料和方法
1.1　材料
本试验所用的朝鲜碱茅种子为吉林省农科院草
地所提供 。朝鲜碱茅播种于沙土中 ,在五叶一心时 ,
用 1/2 Hoagland营养液培养 ,缓苗 7 d后进行 NaCl
胁迫处理 ,以无 NaCl胁迫的样品为对照 ,共 9个处
理 ,NaCl胁迫浓度分别为 50 , 100 , 150 , 200 ,250 ,300 ,
350 , 400 mmol/L。为了避免盐激 ,浓度每隔 3 d递增
50 mmol/L 直至终浓度 ,每个浓度处理 3 d后分别取
样置于超低温冰箱保存待测 。
1.2　方法
1.2.1　甜菜碱醛脱氢酶提取与活性测定　甜菜碱
醛脱氢酶提取与活性测定参考刘凤华等和《现代植
物生理学试验指南》的方法 ,略有改动。在 28℃条
件下用日立 U-3010 型紫外分光光度计测定 340 nm
处 30 min内吸光值的变化。酶活性按每分钟转化
生成 1 nmol NADH 所需的酶量为 1 个活性单位计
算。依据 NADH的摩尔消光系数计算酶的比活力。
酶的比活力(nmol/(min·mg))=ΔOD×10-3/
(εmax×C)×109 。
华北农学报·2009 , 24(3):46-50
式中 , ΔOD 为每分钟增加的平均吸光值;εmax
为NADH 摩尔消光系数 ,等于 6.22×103;C 为测定
所加入酶蛋白的量 ,单位为mg 。
1.2.2　朝鲜碱茅总 RNA 的提取和 cDNA 的合成　
取300 mmol/L盐浓度处理的朝鲜碱茅[ 1] ,用 TrizolA
+试剂提取朝鲜碱茅叶片总 RNA , RT-PCR合成第
一链 cDNA。
1.2.3　BADH 基因 5端部分序列的扩增和 BADH基
因3全序列的扩增　设计一对基因特异引物P1 、P2 ,
PCR扩增 BADH 基因 5′端序列 。在 15 μL 体系中分
别加入下列成分:cDNA模板 2μL ,缓冲液(10×)1.5
μL ,dNTP(2.5 mmol/L)1.2μL ,Mg2+0.9μL ,引物P1 、
P2(10μmol/L)各 1μL , Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)
0.4 μL ,H2O 7μL;扩增条件为:94℃30 s ,55℃30 s ,
72℃1.5 min , 35个循环 , 72℃延伸 10 min 。设计 P3
和P4引物用 SMART RACE方法扩增 BADH 基因 3′
端片段 。15 μL 体系同上 ,扩增条件为:94℃30 s ,
57℃30 s , 72℃ 1.5 min , 32 个循环 , 72℃延伸 10
min。
引物 P1 为:5-CGATCGCCGC(T/C)AAGATT
AAAG-3;引物 P2 为:5-CTTCCTCTCTCC AAATTTG-
CATT-3;引物 P3 为 5-GGTTAAG CCTGTTTCATTA-
GAGCT-3;引 物 P4 为:5-A AGCAGTGGTAA-
CAACGCAGAGT-3。
1.2.4　BADH 基因的回收及测序　将上述 PCR产
物在 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,回收纯化目的片段 ,
测序(天根生物公司)。
1.2.5　序列分析　采用 DNAman软件拼接获得的
BADH 基因片段 , 并与 GenBank(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST)中的数据进行同源性比较 。
1.2.6　甜菜碱的提取与含量测定　甜菜碱的提取
与含量测定参照《现代植物生理学试验指南》的方
法 ,略有改动。按标准曲线方法分别测出四价铵化
合物与胆碱的量 ,求出甜菜碱的含量。
甜菜碱含量=四价铵化合物的量-胆碱的量 。
2　结果与分析
2.1　甜菜碱醛脱氢酶活性测定
BADH是植物体内合成甜菜碱的关键酶 ,它可
以将由胆碱单加氧酶氧化而生成的产物甜菜碱醛转
化成甜菜碱。随着盐浓度的增加朝鲜碱茅体内
BADH活性表现如图 1所示 ,未加 NaCl胁迫处理中
为每毫克蛋白中有 0.24 nmol/(min·mg);盐浓度 0 ～
250 mmol/L之间 BADH 活性表现为平稳的上升;当
NaCl浓度达到 300 mmol/L时 ,酶活性达到最大值 ,
是未加 NaCl处理酶活性的 3倍 ,当盐浓度超过 300
mmol/L 时酶活性开始下降 , 但直至 400 mmol/L
BADH酶活性仍高于对照处理。
图 1　NaCl胁迫下甜菜碱醛脱氢酶的变化
Fig.1　Change in activity of BADH under salt stress
2.2　朝鲜碱茅总 RNA的提取
以 300 mmol/L NaCl诱导的朝鲜碱茅叶片为材
料 ,TrizolA+试剂提取总 RNA , 1%的琼脂糖检测 ,结
果显示 28 ,18 ,5 S条带清晰 ,明亮 ,且 28 S 约为 18 S
亮度的 2倍 ,紫外分光光度计测定 A260/A280≥1.8 ,
可用于反转录 cDNA。
2.3　BADH基因保守区 5端及3端基因片段的扩增
以 cDNA为模板 ,用引物p1/p2 ,p3/p4分别扩增
BADH 基因 5及 3末端 ,琼脂糖检测结果显示 , 5端扩
增出940 bp(图2)的片段 ,3端扩增出1 100 bp(图 3)
的片段。
1.Marker:200 bp DNA ladder;
2.BADH 基因 5′末端 PCR 产物。
1.Marker:200 bp DNA ladder;2.PCR amplification of BADH 5.
图 2　BADH 基因 5′端扩增
Fig.2　PCR amplification of BADH 5′
sequence from P.chinampoensis
2.4　BADH核苷酸和氨基酸序列分析
将得到的 5,3两个片段用 DNAman软件进行拼
接 ,结果表明 ,获得片段长为 1 502 bp , 3末端具有
AATAAA加尾信号和多聚腺甘酸尾巴 Poly(A)。其
中编码区 1 248 bp ,共编码 416个氨基酸 ,含有醛脱
3期 钟　鸣等:朝鲜碱茅 BADH 基因 3′端及 5′端部分序列的扩增 47　
氢酶特有的十肽保守序列(VSLELGGKSP),以及其后
29位点上与酶功能有关的半胱氨酸残基 , C-端具有
SKL 信号肽序列(图 4)。在 GenBank 中与大麦
(Hordeum brevisubulatum 、Hordeum vulgare subs.vul-
gare 、Hordeum vulgare)、羊草(Leymus chinensis)、细叶
结缕草(Zoysia tenuifolia)、高粱(Sorghum bicolor)的
BADH基因推测的氨基酸比对 ,发现与其他禾本科
植物的 BADH基因都具有很高的同源性 ,其中与大
麦(H.brevisubulatum)和羊草(L .chinensis)的同源性
高达 89%。
2.5　BADH同源系统树分析
利用 DNAman序列分析软件对羊草(L .chinen-
sis ,GenBank ACCESSION:AB183715)、大麦的基因家
族成员(H.brevisubulatum , AY188952 、H.vulgare
subs.vulgare AB063179 、H .vulgare D26448)、高粱(S .
bicolor U12196)和 细 叶 结 缕 草 (Z .tenuifolia
AB161712)等6种 BADH 氨基酸序列进行比对并构
建系统发育树状图(图 5)。结果表明 ,朝鲜碱茅与
细叶结缕草和高粱的同源关系较近。
1.BADH 基因 3′末端PCR 产物;
2.200 bp DNA Ladder。
1.PCR amplification of BADH 3′;2.200 bp DNA ladder.
图 3　BADH 基因 3′端扩增
Fig.3　PCR amplification of BADH 3′
sequence from P.chinampoensis
图 4　氨基酸序列等对
Fig.4　Amino and sequence aligment
图 5　系统发育树状图
Fig.5　Phylogenetic tree
2.6　盐梯度胁迫下甜菜碱含量的变化
如图 6所示 ,NaCl胁迫下朝鲜碱茅体内甜菜碱
含量的变化趋势 , 出现了双峰曲线 。在 0 ～ 200
mmol/L 盐浓度之间 ,甜菜碱含量呈直线上升 ,当浓
度处于 250 ～ 400 mmol/L 时其含量表现为先下降后
上升 。NaCl浓度为 200 mmol/L时甜菜碱含量最高 ,
为对照的 2.5倍。
图 6　NaCl胁迫下甜菜碱含量的变化
Fig.6　Change in activity of glybetaine under salt stress
3　讨论
本研究从朝鲜碱茅叶片中获得的 BADH 基因部
分序列 ,在推测的 169 ～ 179氨基酸序列中含有醛脱
氢酶高度保守的十肽序列VSLELGGKSP , 与多数植
48　 华　北　农　学　报 24卷
物中 BADH 的十肽保守序列VTLELGGKSP 存在细微
的差别 ,如在本试验材料和水稻中 ,第二位的T 被 S
取代;在播娘嵩植物中 ,不但第二位的 T 被 S取代 ,
连第三位的L 也被M取代[ 15] ,但是 BADH 基因在进
化中还是相当保守的 ,不同物种的 BADH 基因在进
化过程中受到很强的选择压力 ,其编码区结构相对
保守 ,这说明 ,该序列在植物对环境中干旱 、盐碱等
逆境胁迫的适应性方面可能承担了很重要的作
用[ 16] 。另外 ,其后 29 位点上含有与酶功能有关的
半胱氨酸残基 ,可能包含 NAD+结合位点及酶催化
位点[ 2 ,3 ,17] 。
在多数情况下 ,一个新基因的全长 cDNA序列
的获得一般通过筛选 cDNA文库或 RACE法 。本研
究利用SMARTRACE方法克隆出 BADH基因 cDNA 3
末端序列。但是 ,由于 BADH 基因 5端保守性差且
GC含量较高 ,常规 PCR方法无法得到 BADH 基因
保守区 5端全序列 ,希望后续试验可以通过反向嵌
套PCR获得 5端全序列 。
在典型的不积累甜菜碱的植物-水稻中 ,发现了
BADH基因的低水平表达之后 ,引起了人们研究该
酶在植物系统进化中所扮演角色的兴趣 。目前的研
究表明:植物中 BADH 基因可能是以小的多基因家
族的形式存在 ,不同类型的 BADH 在细胞中的定位
具有多样性 ,可能分别位于叶绿体 、过氧化物酶体或
细胞质等部位 。在已报道的 BADH 氨基酸序列中 ,
存在两种有关该酶蛋白定位的信号肽。一种是N-端
信号肽 ,其氨基酸序列为 QLFIDGE ,它被认为是定位
于叶绿体的信号 ,但该信号肽缺乏典型性 。另一种
是C-端信号肽 ,氨基酸序列为SKL ,是定位于过氧化
物酶体中的信号[ 18] 。从目前的研究结果看 ,对具有
不典型 N-端信号肽的 BADH 定位问题尚有争论 ,但
具有C-端信号肽 SKL 的 BADH 定位于过氧化物酶
体已达成共识。不同类型的 BADH在细胞中的不同
定位 ,可能以有利于其酶活性的发挥为依据 。在单
子叶植物中 , BADH 蛋白(具有 C 末端信号肽的类
型)在过氧化物酶体中比在叶绿体中可能具有更高
的活性。因此 Nakamura 等认为 ,在进化过程中 ,单
子叶植物 BADH蛋白(具有C末端信号肽的类型)的
定位发生了由叶绿体到过氧化物酶体的变化 ,以便
更有效地发挥其催化活性 。本试验获得的朝鲜碱茅
BADH的氨基酸序列 C-端含有 SKL 信号肽序列 ,且
为禾本科植物[ 19] ,故初步将其定位于过氧化物酶体
中 ,但有待于进一步研究 。
甜菜碱是大多数藜科 、苋科 、禾本科植物体内重
要的渗透调节物质 ,甜菜碱在体内积累 ,可以稳定细
胞膜结构 、调节渗透平衡 、保护大分子蛋白的稳定
性 ,甚至可以降低盐胁迫条件下 DNA 的解链温度。
它的积累与盐胁迫浓度有关 。植物体内甜菜碱的合
成由胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶经两步氧化生
成 ,反应底物为胆碱。甜菜碱的合成在叶绿体中完
成 ,而大多数禾本科植物体内甜菜碱醛脱氢酶定位
于过氧化物酶体中[ 19] 。本试验中甜菜碱合成总体
水平上升 ,但也表现出了复杂性 ,在 0 ～ 200 mmol/L
范围内 ,BADH活性变化不显著 ,但活性可以达到一
定水平 ,有可能是 CMO的活性不断升高使得甜菜碱
的含量直线上升。在 200 mmol/L 到 300 mmol/L 之
间 ,中度盐胁迫可能抑制了 CMO的活性或底物胆碱
的供应受到了阻碍 ,使得甜菜碱醛不再增加。另外
甜菜碱的合成在叶绿体中完成 ,而 BADH存在于过
氧化物酶体中 ,BADH的运输需要一个过程 ,所以此
时虽然 BADH 的活性有了大幅度的上升 ,却不能提
高甜菜碱的合成量 , 当 NaCl 浓度大于 300 mmol/L
时 ,BADH酶活性达到最大值 ,植物体内的 BADH 积
累到一定程度可以将叶绿体内剩余的底物氧化 ,因
此甜菜碱又一次出现直线上升趋势。在朝鲜碱茅甜
菜碱的合成途径中 ,BADH 的转运机制及 CMO的耐
盐生理特性还有待于继续深入研究。
参考文献:
[ 1] 　杨　铮 ,钟　鸣 ,郭志富 , 等.盐胁迫下朝鲜碱茅的甜菜
碱醛脱氢酶活性变化及其基因保守区的克隆[ J] .植物
生理学通讯 , 2007 , 43(3):430-434.
[ 2] 　McCue K F ,Hanson A D.Salt-inducible betaine aldehyde de-
hydrogenase from sugar beet:cDNA cloning and expression
[ J] .Plant Mol Biol , 1992 , 18:1-11.
[ 3] 　Li Q L , Gao X R, Yu X H , et al.Molecular cloning and char-
acterization of betaine aldehyde dehydrogenase gene from
Suaeda liaotungens and its use in improved tolerance to salini-
ty in transgenic tobacco[ J] .Biotechnol Lett , 2003 , 25(17):
1431-1436.
[ 4] 　Yin X J , Zhao Y X , Luo D , et al.Expression of the betaine
aldehyde dehydrogenase(AcBADH)gene and isolation ofits
promoter from the halophyte Ataplex centralasiatica[ J] .Jour-
nal of Plant Physiology and Molecular Biology , 2002 , 28(6):
479-484.
[ 5] 　Legaria J , Rajsbaum R ,Mufioz-Clares R A , et al.Molecular
characterization of two genes encoding betaine aldehyde dehy-
drogenase from amaranth expression in leaves under short-
term exposure to osmotic stress or abscisic acid[ J] .Gene ,
1998 , 218:69-76.
[ 6] 　Hibino T ,Meng Y L, Kawamitsu Y , et al.Molecular cloning
and function characterization of two kinds of betaine aldehyde
3期 钟　鸣等:朝鲜碱茅 BADH 基因 3′端及 5′端部分序列的扩增 49　
dehydrogenase in betaine-accumulating man grove Avicennia
marina(Forsk.)Vierh[ J] .Plant Mol Biol , 2001 , 45:353 -
363.
[ 7] 　Ishitani M , Nakamum T ,Han S Y , et al.Expression of the be-
taine aldehyde dehydrogenase gene in barley in response to
osmotic stress and abscisic acid[ J] .Plant Mol Biol , l995 , 27:
307-315.
[ 8] 　Nakamura T , Nomura M ,M ori H , et al.An isozyme of be-
taine aldehyde dehydrogenase in barley[ J] .Plant Cell Physi-
ol , 2001 , 42(10):1088-1092.
[ 9] 　Wood A J , San eoka H , Rhodes D.et al.Betaine aldehyde
dehydrogenase in sorghum molecular cloning and expression
of two related genes[ J] .Plant Physiol , 1996 , 110:1301 -
1308.
[ 10] 　Nakamura T , Yokota S ,M uramoto Y, et al.Expression of a
betaine Mdehyde dehydrogenase gene in rice , a glycinebe-
taine Nonaccumulator , and possible localization of its protein
in peroxisomes[ J] .Plant J , 1997 , 11(5):1115-1120.
[ 11] 　Li Y H , Zou Q.The sequence of Triticum oestivum betaine
aldehyde dehydrogenase gene WBADH[ J] .Journal of Plant
Phy siology andMolecular Biology , 2002 , 28(6):495-496.
[ 12] 　Rathinasabathi B ,McCue K F , Gago D A , et al.Metabolic
engineering of glycine betaine synthesis:plant betaine alde-
hyde dehydrogenase lacking typical transit peptides are tar-
geted to tobacco chloroplasts where they confer betaine alde-
hyde resistance[ J] .Planta , 1994 , 193:155-162.
[ 13] 　梁　峥 , 马德钦 , 汤　岚 , 等.菠菜甜菜碱醛脱氢酶基
因在烟草中的表达[ J] .生物工程学报 , 1997 , 3(3):236
-240.
[ 14] 　刘凤华 ,郭　岩 , 谷冬梅 , 等.转甜菜碱醛脱氢酶基因
植物的耐盐性研究[ J] .遗传学报 , 1997 , 24(1):54-
58.
[ 17] 　肖　岗 ,张耕耘 , 刘风华 , 等.山菠菜甜菜碱醛脱氢酶
基因研究[ J] .科学通报 , 1995 , 40(8):741-745.
[ 16] 　董海滨 ,管荣展 , 张红生 , 等.播娘嵩甜菜碱醛脱氢酶
基因的克隆和表达分析[ J] .分子植物育种 , 2006 , 4
(2):209-215.
[ 17] 　曾幼玲 ,幸　婷 , 蔡忠贞 , 等.盐生植物盐爪爪甜菜碱
醛脱氢酶基因的克隆及在盐胁迫下的 BADH 基因的
表达[ J] .云南植物研究 , 2007 , 29(1):79-84.
[ 18] 　刘振林 ,戴思兰.植物甜菜碱醛脱氢酶基因研究进展
[ J] .西北农林科技大学学报:自然科学版 , 2004 , 32
(3):104-112.
[ 19] 　崔　杰 ,李滨胜 , 史淑芝 , 等.植物甜菜碱醛脱氢酶基
因工程研究进展[ J] .中国甜菜糖业 , 2006(1):40-44.
50　 华　北　农　学　报 24卷