全 文 ：
第 35卷第 1期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.35 No.1
2009 年 2月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Feb．2009
文章编号：1007-1032(2009)01-0021-03
毒麦属 6 个种的 rDNA ITS 序列测定及分析
张 姮 1，康 林 2*，高必达 1，陈冬美 2
(1.湖南农业大学 生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.深圳出入境检验检疫局 动植物检疫技术中心，
广东 深圳 518010)
摘 要：提取毒麦属 6 个种的样品 DNA，分别采用 PCR 产物直接测序和克隆测序 2 种方法，对毒麦属 6 个种
rDNA的 ITS区（包括 ITS-1，5.8 S rDNA和 ITS-2）进行序列测定．结果表明，毒麦属植物 ITS序列总长度约为
647 bp，其中 ITS-1，5.8 S rDNA和 ITS-2分别有 16、7和 7个变异位点．采用 NJ法建立的系统发育树与形态学
分类基本相符．
关 键 词：毒麦属；ITS序列；rDNA
中图分类号：Q785 文献标识码：A

Sequence determination and analysis of the ITS region of
nuclear ribosomal DNA in six species of Lolium
ZHANG Heng1，KANG Lin2*，GAO Bi-da1，CHEN Dong-mei2
(1.College of Bio-Safety Science and Technology， HNAU，Changsha 410128，China; 2.Shenzhen Entry-Exit Inspection
and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518010，China)
Abstract：DNAs of 6 samples from Lolium were extracted. The sequence of rDNA ITS region (including ITS-1，5.8 S
rDNA and ITS-2) were determined from 6 species of Lolium by the direct or clone sequencing of PCR products. The results
showed that the full length of Lolium ITS was about 647 bp，The numbers of variable sites were 16，7 and 7 in ITS-1，5.8
S and ITS-2，respectively. The phylogenetic tree was based on NJ method corresponds with the morphological
classification，which provided an important molecular basis for the classification and determination of Lolium genus.
Key words：Lolium；sequences of internal transcribed spacers；ribosomal DNA

毒麦属(Lolium)又称黑麦草属，隶属禾本科．其
中原产欧洲的毒麦及其变种田毒麦和长芒毒麦、亚
麻毒麦、多花黑麦草、瑞士黑麦草等都是中国政府
规定禁止入境的危险性有害植物或政府关注的有
害植物．
毒麦及其变种不但能引起人畜中毒，同时还降
低麦类作物的产量和质量．近年来，中国每年进口
小麦约 1.0×107 t，因为毒麦与其近似种难于在种子
级别上用形态学的方法区分，且进口农产品在出口
国进行脱粒干燥、贮运、装卸后，作为鉴定的主要
外观形态特征往往被破坏或不明显．为了能准确区
分和快速鉴定毒麦及其近似种，适应口岸对毒麦的
快速检疫和毒麦疫情普查及防治，笔者对毒麦属中
的 6个近似种的 rDNA ITS区进行了序列测定，分
析了各样品间的差异，以期为毒麦属植物的分子鉴
定提供依据．
1 材料和方法
1.1 材 料
毒麦、田毒麦、长芒毒麦由中国检验检疫科学
研究院动植物检疫所和福建省出入境检验检疫局提
供；亚麻毒麦、多花黑麦草、瑞士黑麦草由中国科
学院植物研究所提供．
1.2 方 法
1.2.1 总 DNA 提取
取各样品种子 10 粒，用 QIA quickR DNA
Extraction Kit 试剂盒抽提植物总 DNA．
收稿日期：2008-04-21
基金项目：国家质量检验检疫总局项目(2007IK234)
作者简介：张 姮(1982-)，女，湖南常德人，硕士研究
生．*通讯作者，kanglsz@yahoo.com.cn．
DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2009.01.008


22 湖南农业大学学报(自然科学版) 2009 年 2 月
1.2.2 PCR 扩增及产物纯化
采用文献 [1]报道的 ITS 通用引物 ITS4、
ITS5(由北京奥科生物技术公司合成)．扩增体系 50
µL(10×PCR Buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 nmol/L
dNTPs，Taq酶 1 U，10 µmol/L引物，模板 DNA为
100 ng)；循环参数为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变
性 1 min，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35个
循环，最后延伸 7 min[2]．PCR产物用 QIAGEN DNA
回收试剂盒回收．
1.2.3 测 序
(1) PCR产物直接测序．纯化后 PCR产物直接
测序，由北京奥科生物技术公司完成，测序引物为
PCR引物，反应体系为 10 µL．
(2) 克隆测序：已回收纯化的核酸送上海基康
生物技术公司进行克隆及测序，载体为 PMD18．
1.2.4 序列分析及系统树构建
以上 2种方法所测得序列经两两比对并根据测
序反应图谱得到较为一致的序列．在 NCBI数据库
中与已报道的序列进行同源性比较，序列比对在
DNAStar 的 MegAlign 软件中进行．比对好的序列
用 ClustalX 1.81 软件构建 NJ 树(Neighbor-joining
tree)．为进一步判断 NJ 树中各个分支的置信度，
采用自展分析进行检验(1 000次运算重复)．
2 结果与分析
2.1 PCR 扩增及序列比对
图 1 所示为通用引物 ITS4、ITS5 扩增的 PCR
产物电泳结果，此扩增包括 5.8S 在内的 ITS 全序
列．可以看出毒麦属的 ITS全序列大致为 700 bp．测
序结果与 GenBank公布的毒麦属序列比对，同源性






1毒麦；2 长芒毒麦；3 田毒麦；4 亚麻毒麦；5 多花黑麦草；6 瑞
士黑麦草；MDNA Marker DL 2000 (Takara)
图 1 引物 ITS4、ITS5 PCR 产物电泳结果
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of primer ITS4/5 PCR products
均高于 95% (表 1)．
表 1 毒麦属各种序列相似性和差异性系数
Table 1 Percent of sequence similarity and divergence from 6 different
Lolium species %
样 品 毒麦 长芒 毒麦 田麦草
亚麻
毒麦
多花
黑麦草
瑞士
黑麦草
毒麦 99 99.4 99.3 97.9 97.5
长芒毒麦 1.0 99.4 99.2 98.3 96.9
田毒麦 0.6 0.6 99.3 98.5 94.9
亚麻毒麦 0.7 0.8 0.7 97.8 97.6
多花黑麦草 2.1 1.7 1.6 2.3 98.5
瑞士黑麦草 2.6 3.1 5.3 2.4 1.6
相似性（上三角）和差异性（下三角）．
2.2 ITS 序列长度及变异
所测毒麦属 6 个种的 ITS 序列约为 647 bp(图
1)．每个种的 ITS及(G＋C)含量见表 2．其中 ITS-1
长度为 235 bp，5.8S约为 267 bp，ITS-2约为 145
bp．ITS-1区(G＋C)含量为 54.64%～55.67%，5.8S
区(G＋C)含量为 62.55%～62.93%，ITS-2区(G＋C)
含量为 55.86%～57.93%．ITS 区变异较大，ITS-1
区变异位点 16个，占 ITS-1区性状位点的 6.81%；
ITS-2 区变异位点 7 个，占 ITS-2 区性状位点的
4.83%；保守的 5.8S区变异位点 7个，占 5.8 S区
性状位点的 2.62%，这一结果与大多数禾本科植物
的 5.8S rDNA基因非常保守的结论[3]相近．变异位
点(表 3)中信息位点 22个，特异性识别位点 8个，
差异显著而稳定，依据这些位点完全可对黑麦草属
6 个近似种加以鉴别．表明 rDNA ITS 区序列特征
能较好地反映黑麦草属种内和种间差别，为黑麦草
属的鉴别提供良好的分子标记．
表 2 ITS-1、5.8S 和 ITS-2 区的序列长度及(G+C)含量
Table 2 Size and (G+C) contents of ITS-1，5.8S rDNA and ITS-2
sequence
ITS-1 5.8S ITS-2
样 品 序列长
/bp
G+C
含量/%
序列长
/bp
G+C
含量/%
序列长
/bp
G+C
含量/%
毒麦 235 54.64 267 62.55 145 57.24
长芒毒麦 235 55.32 267 62.55 145 55.86
田毒麦 235 55.32 267 62.55 145 57.24
亚麻毒麦 235 54.98 267 62.55 145 56.55
多花黑麦草 235 55.67 267 62.55 145 57.93
瑞士黑麦草 235 54.98 267 62.93 145 57.24
M 1 2 3 4 5 6
750 bp
500 bp


第 35卷第 1期 张 姮等 毒麦属 6个种的 rDNA ITS序列测定及分析 23
表 3 毒麦属 6 个种 ITS 区特异性识别位点
Table 3 ITS sequences variation and authenticable sites among 6
species of Lolium
变异位点 毒麦 长芒 毒麦 田毒麦
亚麻
毒麦
多花黑
麦草
瑞士黑
麦草
.31 A G G A G G
.45 C C C C C T
.57 A C C C C C
.64 C C C C C T
.75 C C C C A A
.139 A A A A T A
.188 G G G G A A
.192 T T T T G G
.198 T T T T C C
.210 A A A A C C
.302 A A A A A G
.401 C C C C A A
.412 T T T T G G
.466 G G G G C C
.535 C T C T C C
.555 G T G G G G
.559 T T T T C C
.560 C C C C C G
No.613 G G G G G A

2.3 ITS 序列的系统发育及分析
同源性用 NCBI 服务器上(http://www.ncbi.nih.
gov)的 BLAST检测．所得序列和来自 GenBank的
相应序列，用计算机软件 Clustal X进行多序列对位
分析并采用邻接法构建系统发育树(见图 3)，可以看
出长芒毒麦和田毒麦的亲缘关系较接近；毒麦和亚
麻毒麦的亲缘关系较接近；瑞士黑麦草和多花黑麦
草的亲缘关系较接近．所得结果与 6个种在黑麦草
属中的分类地位比较相符．







1 毒麦；2 长芒毒麦；3 田毒麦；4 亚麻毒麦；5 多花黑麦草；
6 瑞士黑麦草；分支上的数字是 1 000次重复抽样检测的 Bootstrap值
图 3 基于毒麦属 ITS 序列构建的 NJ 系统树
Fig.3 NJ systematic tree based on ITS sequences from 6 species of
Lolium
3 讨 论
本研究采用 2种测序方法所得的结果主要差异
在 ITS序列的两端，中间无变化．从效果上看，PCR
产物直接测序与克隆直接测序的结果一致．克隆测
序耗时长、成本高，但若需要得到更为准确的信息
序列如 SNP，一般采用克隆测序[4-5]。在测定分析较
短的核酸片段时，一般采用 PCR产物直接测序[6]。
相关物种间的系统关系可以通过同源序列的
比对来决定[7]．在被子植物中，rDNA ITS 区既具
有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，
这使得该序列很容易在近缘类群间排序，且丰富的
变异可在较低的分类阶元上解决植物系统发育问
题[8-9]．目前国内尚未有将 rDNA ITS区序列的研究
用于毒麦属种内及种间的分子鉴别．本试验首次测
定了毒麦 2个变种长芒毒麦和田毒麦 rDNA ITS区
的碱基序列，并对它们进行了比较分析．
屈良鹄等[10]通过对不同生物类群的 ITS 序列
(自生物学数据库)的比较得出被子植物大多数科属
的 ITS序列的种间差异值为 1.2 %~10.2 %，属间差
异值为 9.6 %~28.8 %．本试验所测得毒麦、长芒毒
麦、田毒麦和亚麻毒麦之间差异值小于等于 1.0 %，
其中长芒毒麦和田毒麦是毒麦的两个变种，差异值
较小；但亚麻毒麦跟毒麦是近似种关系，所得到的
差异值仅为 0.7%，不符合屈氏等报道的大多数被子
植物种间差异值研究结果，属于被子植物中种间差
异值非常小的种类．多花黑麦草和瑞士黑麦草与其
他 4个种差异值较大，为 1.6%~5.3%，符合屈氏等
的报道．
传统分类将长芒毒麦和田毒麦作为毒麦的变
种处理，而将亚麻毒麦作为另一个种，本研究结果
表明，亚麻毒麦与毒麦之间的差异值仅为 0.7%，建
议将亚麻毒麦作为毒麦的变种处理．当然，这需要
对亚麻毒麦的形态分类、细胞地理学及在自然界中
的遗传分化等方面进行深入系统的研究，综合考虑
其系统地位．
ITS 序列高度进化，近年来已普遍用于属间、
种间、种内甚至种类地理种的分类研究[11]．本法基
于 ITS进行测序基础之上，不仅为毒麦属研究提供
(下转第 42 页)
3
5
1
4
2
6
976
322
554


42 湖南农业大学学报(自然科学版) 2009年 2月
量及土体 NO3-N 累积的长期定位试验[J]. 土壤肥料,
1999(6): 18-21.
[6] 杨学云, 张树兰, 袁新民, 等. 长期施肥对塿土硝态氮
分布、累积和移动的影响[J]. 植物营养与肥料学报,
2001(2): 134-138.
[7] Sneh Goyal K, Chander M C, Mundra, et al. Influence of
inorganic fertilizers and organic amendments on soil
organic matter and soil microbial properties under
tropical conditions[J]. Biology and Fertility of Soils, 1999,
29(2): 196-200.
[8] 范美蓉, 刘 强, 荣湘民, 等. 有机无机复混肥对莴苣
产量和品质的影响[J]. 湖南农业大学学报: 自然科学
版, 2005, 31(3): 331-334.
[9] 曾宪军, 刘登魁. 有机氮肥与无机氮肥配施对蔬菜产
量及品质的影响[J]. 湖南农业大学学报: 自然科学版,
2005, 31(4): 402-403.
[10] 周柳强, 黄美福, 谭宏伟. 有机无机肥料配施应用在
蕹菜上的效果[J]. 土壤肥料, 2004(3): 31-33.
[11] 高新昊, 张志斌, 郭世荣, 等. 氮钾肥配施对番茄幼
苗生长及前期产量构成的影响[J]. 土壤通报, 2005,
36(4): 549-553.
[12] 尹迪信，曹文才, 肖桂兰, 等. 贵州高海拔地区马铃薯
平衡施肥效益研究[J]. 土壤通报, 2004, 35(1): 48-51.
[13] 高新昊, 张志斌, 郭世荣. 氮钾化肥配合追施对日光
温室番茄越冬长季节栽培产量与品质的影响[J]. 植物
营养与肥料学报, 2005, 11(3): 375-378.
[14] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 北京: 中国农业出版社,
2000.
[15] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京:高
等教育出版社，2000.
[16] Buchanan-Wollastonv. The molecular biology of leaf
senescence[J]. J Exo Bot, 1997, 48: 181-199.
[17] 邱永祥, 谢小珍, 蔡南通, 等. 不同氮素及硝化抑制
剂对叶菜用甘薯光合特性、茎叶产量及硝酸盐含量的
影响[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2006,
34(12): 58-63.
[18] 沈明珠, 翟宝杰, 东惠茹, 等. 蔬菜硝酸盐积累的研
究[J]. 园艺学报, 1982, 9(4): 40-48.
[19] QH S A , Park J H, Lee G I, et al.Identification of three
genetic loci controlling leaf senescence in Ababidopsis
thaliana[J]. J Plant, 1997, 12(3): 527-533.

责任编辑：王赛群
英文编辑：罗文翠

（上接第 23 页）
了分子依据，由此而建立的分子标记稳定可靠，不
受地理环境因素影响，可从分子水平鉴别毒麦属内
的近似种．
参考文献：
[1] WANG Jian-Bo ， ZHANG Wei-Jun ， CHEN Jia-
Kuan．Application of ITS sequences of nuclear rDNA in
phylogentice and evolutionary studies of angiosperms
[J]．Acta Phytotaxonomica Sinica，1999，37(4)：
407-416．
[2] 高必达，程 毅，朱水芳．基于 ITS序列的菟丝子 PCR
鉴定[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2006，32(4)：
368-370．
[3] Hsiao C，Chatterton N J，Asay K H．Phylogenetic
relationships of the mongenomic species of the wheat
tribe，Triticeae(Poacrae) inferred from nuclear rDNA(ITS)
sequences[J]．Theor Appl Genet，1995，90：389-398．
[4] 周玉元，周铁军．DNA 序列分类的 Fisher 判别方法
[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2003，29(5)：
437-440．
[5] 郑和斌，王作仁，吕作舟．美味侧耳 ITS 序列直接测
序与克隆测序比较分析[J]．食用菌学报，2005，12(1)：
1-4．
[6] LI Chun-xiang，YANG Qun．Direct sequencing of PCR
products or sequencing by cloning PCR products-method
of determing internal transcribed spacer sequences of
nuclear ribosomal DNA in a throtaxis[J]．Chinese Bulletin
of Botany，2002，19 (6)：698-704．
[7] Kass E，Wink M．Phylogenetic relationships in the
Papilionoideae (family Legum inosae) based on
nucleotide sequences of cpDNA (rbcL) and nrDNA
(ITS1and2)[J]． Mol Phylogeny Evol，1997，8(1)：65-88．
[8] Gilly L，YuanY M，Kpfer P，et al．Phylogenetic use of
noncoding regions in the genus G. entiana L．Cholorop
last tmL(UAA)intron versus nuclear ribosomal internal
transcribed spacer sequences[J]．Mol Phylogeny Evol，
1996(5)：460-466．
[9] Buckler I E S，Holtsford T P． Zea systematics：ribosomal
ITS evidence[J]．Mol Phylogeny Evol，1996，13：
612-622．
[10] Qu L H，Chen Y Q．Key to molecular taxonomy
principles and methods[J]．Acta Sci Nat Univ Sunya-
tseni，1999，38(1)：1-6．
[11] 王淑美，梁生旺，周开亚．牛膝的 rDNA ITS序列分
析[J]．中草药，2004(5)：553-559．

责任编辑：罗慧敏
英文编辑：胡东平