全 文 ：华北农学报 · 2010, 25(2):30-34
收稿日期:2010-01-05
基金项目:辽宁省农业生物技术重点实验室专项基金
作者简介:王　磊(1983-),男 ,河北石家庄人 ,硕士 ,主要从事细胞分子生物学方面的研究。
通讯作者:钟　鸣(1971-),女 ,辽宁大连人 ,副教授 ,博士 ,主要从事植物生物技术的研究。
朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶 cDNA5′末端序列
的克隆及植物表达载体的构建
王　磊 ,钟　鸣 ,郭志富 ,张　丽 ,张　佳 ,赵　莉 ,李浩戈
(沈阳农业大学 辽宁省农业生物技术重点实验室 ,辽宁 沈阳　110161)
　　摘要:采用改良的 RT-PCR及 5′RACE法 , 成功地克隆了朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因 cDNA5′端序
列 , 与已知序列拼接 ,获得了 BADHcDNA全长 1 781 bp, 包含一个完整的开放阅读框(ORF), 编码 506个氨基酸。其
含有醛脱氢酶高度保守序列 VT/SLELGGKSP, 及其后 29位与酶功能有关的 Cys。多序列比对和系统进化分析表明 ,
朝鲜碱茅 BADH与大麦 BBD1同源性最高 ,并构建了 PBI121-BADH植物表达载体。
关键词:朝鲜碱茅;甜菜碱醛脱氢酶;5′RACE;高 GC;表达载体
中图分类号:Q785　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2010)02-0030-05
Cloningof5′cDNAEndsofBetaineAldehydeDehydrogenasefrom
PuccineliachinampoensisandConstructionofPlantExpressionVector
WANGLei, ZHONGMing, GUOZhi-fu, ZHANGLi, ZHANGJia, ZHAOLi, LIHao-ge
(ShenyangAgriculturalUniversity, KeyLaboratoryofAgricultureBiotechnology
ofLiaoningProvince, Shenyang　110161, China)
Abstract:Thesequenceof5′cDNAendsofBetaine-aldehydeDehydrogenase(BADH)wasclonedfromPuccinel-
liachinampoensisbyimprovedRT-PCRand5′RACEmethods.ThefullengthofcDNAwas1 781bpbyoverlapping
sequenceandcontainedanintactopenreadingframe(ORF)encodingaputativeproteinof506 aminoacids.Thede-
ducedaminoacidsequencecontainedtheconservedmotifofaldehydedehydrogenasewhichwasVT/SLELGGKSPand
afterittherewastheCysatthe29thsite, asociatedwithaldehydedehydrogenasefunction.Multiplesequencealign-
mentandphylogeneticanalysisshowedthatthepolypeptidesharedhighhomologywithHordeumbrevisubulatum
BBD1.ThenitsplantexpressionvectornamedPBI121-BADHwasconstructed.
Keywords:Puccineliachinampoensis;BADH;5′RACE;GC-rich;Expressionvector
　　多数抗盐植物在胁迫条件下 ,体内会生成大量
的渗透调节剂 ,起着调节胞内渗透压 ,保护胞内酶活
性的作用。甜菜碱是目前所研究过最好的一种渗透
调节物 ,它的结构 、合成途径相对简单 ,遗传操作方
便 [ 1] 。甜菜碱醛脱氢酶 (Betainealdehydedehydro-
genase, BADH)是高等植物体内合成甜菜碱的关键
酶 [ 2] ,自 Weretilnyk等 [ 3]克隆菠菜全长 BADH基因
至今 ,人们已相继在甜菜 、辽宁碱蓬 、大麦 、玉米等多
种藜科 、禾本科植物中分离鉴定了这一基因[ 4-8] 。
朝鲜碱茅(Puccineliachinampoensis)为禾本科
碱茅属多年生草本植物 ,广泛分布于我国东北 、华北
和西北地区的草原 、辽河平原及碱湖周围 ,具有较强
的耐盐碱 、耐旱和耐寒性 ,是我国三北地区改良盐渍
土地的优良先锋植物 [ 9, 10] 。本研究组已经分离到朝
鲜碱茅 BADH基因 cDNA保守区及 3末端序列 ,在
此基础上 ,利用改良的 RT-PCR及 5′RACE法 ,成功
地获得了朝鲜碱茅 BADHcDNA5′端未知序列 ,通过
拼接得到了完整的编码区 ,并构建了植物表达载体 ,
为研究朝鲜碱茅耐盐抗旱的分子机理 ,及发掘耐盐
基因资源奠定了基础。
2期 王　磊等:朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶 cDNA 5′末端序列的克隆及植物表达载体的构建 31　
1　材料和方法
1.1　材料
朝鲜碱茅种子由吉林省农科院草地所提供 ,种
子消毒后播种于灭菌的沙土中 ,用 1 /2Hoagland营
养液培养;大肠杆菌菌株(DH5α)及 PBI121质粒为
本实验室保存;引物自行设计并由赛百盛公司合成;
试剂全部购自 TAKARA公司。
1.2　方法
1.2.1　朝鲜碱茅总 RNA的提取　待朝鲜碱茅长至
五叶一心时 ,用 300mmol/LNaCl处理 3d后取幼嫩
叶片 ,用 TRIZOL试剂盒提取 RNA。
1.2.2　cDNA第一链的合成及加尾　根据已知朝
鲜碱茅 BADHcDNA的部分序列 [ 10] ,设计一条反转
录 引 物 RT-primer:5′-CACGCTCAAGTAGTTCT-
CAAGG-3′。在总 RNA溶液中加入终浓度 1 mol/L
甜菜碱 , 94℃变性 3min,冰浴 2 ～ 5min,作为模板备
用 。RT-PCR反应体系参照 PrimeScriptTM反转录试
剂盒添加。反应条件为 55℃ 50 min, 70℃ 15 min。
使用 RnaseH37℃温浴 1 h,降解 RNA,然后乙醇沉
淀纯化 ,用脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)和 dATP
在纯化的 cDNA第一链 3′末端加上 poly(A)尾。
1.2.3　BADH基因 5′RACE扩增及测序　根据已获
得的朝鲜碱茅 BADHcDNA的部分序列 , 在 RT-
primer引物内侧设计 3条巢式引物及 1条接头引
物:GSPR1:5′-ATCAGAAATCACAGCACCACCC-3′;
GSPR2:5′-ACAGAGGATAGTTCCAGGGAGTGATG-3′;
GSPR3:5′-CCGATGGGTTCTTTGAGAATATAG-3′;接
头引物 AAP:5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTT
TTTTTTTTTT-3′。
1stPCR反应体系:为 25 μL体系:2×GCBufer
Ⅱ 12.5 μL, dNTP(10 mmol/Leach)0.5 μL, GSPR1
(10mmol/L)及 AAP(10 mmol/L)各 1 μL,加尾 cD-
NAtemplate2 μL, LATaqDNA聚合酶(5 U/μL)
0.25μL, ddH2 O7.75 μL。扩增条件为:94℃预变
性 3 min, 94℃ 30 s, 60℃ 30s, 72℃ 1.5 min, 32个
循环后 , 72℃延伸 10 min。 1stPCR产物稀释 20倍
作为模板 , GSPR2与 AAP进行 2ndPCR。 2ndPCR
产物稀释 50倍作为模板 , GSPR3与 AAP进行 3rd
PCR。 2ndPCR与 3rdPCR反应体系及条件同 1st
PCR。将 3rdPCR产物以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,
回收纯化目的片段 ,送北京天根生物公司测序 。
1.2.4　朝鲜碱茅全长 BADH基因序列拼接及分析
　使用 DNAMAN软件 ,将获得的朝鲜碱茅 5′端序列
与本室以前获得的朝鲜碱茅部分序列 [ 10]进行拼接 ,
并与 GenBank中的数据进行同源性比较 ,构建进化
树。
1.2.5　BADH基因植物表达载体构建　设计扩增
全长 BADH编码区引物:BF1:5′-CGCGGATCCATG-
GCCGCGCCCCCAGCGAT-3′;BR1:5′-TCCCCCGGG
CTACAGCTTGGATGGACGCTG-3′。
BF1和 BR1分别添加 BamHⅠ和 SmaⅠ酶切位
点。以 OligodT为反转录引物 ,获得的 cDNA第一链
为模板 , PCR扩增体系及条件同 1.2.3。 PCR产物
经 BamHⅠ和 SmaⅠ酶切 , 回收纯化后连接于经
BamHⅠ和 EcoⅠ CRⅠ双酶切的 PBI121质粒载体大
片段上 ,替换掉 GUS基因 ,而后转化至 DH5α感受
态细胞 ,在含有 Kna抗性的 LB平板上筛选。 SmaⅠ
和 EcoⅠCRⅠ均为平末端酶 ,无法酶切鉴定 ,待菌落
PCR初步鉴定后 ,提取该质粒 ,送北京天根公司测
序鉴定 ,重组质粒命名为 PBI121-BADH。
2　结果与分析
2.1　5′RACE扩增产物
3rdPCR以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,获得 1条
470 bp特异条带(图 1)。
M.DL2000;1.3rdPCR扩增片段。
M.DL2000;1.Resultof3rdPCR.
图 1　3rdPCR产物扩增结果
Fig.1　Resultofamplificationby3rdPCR
2.2　朝鲜碱茅全长 BADH基因序列拼接及分析
使用 DNAMAN软件进行序列拼接 ,获得 BADH
cDNA全长 1 781 bp, 3′端具有 AATAAA加尾信号 ,
其中编码区为 1 518 bp,编码 506个氨基酸 , BlastP
显示与大麦 BBD1甜菜碱醛脱氢酶一致性达到
90%,在推测的 259 ～ 268氨基酸序列中含有醛脱氢
酶高度保守的十肽序列 VSLELGGKSP, 以及在其后
29位点上含有与酶功能有关的半胱氨酸残基 , C端
具有 SKL信号肽(图 2)。利用 DNAMAN软件将朝
鲜碱茅 BADH氨基酸序列与菠菜(ACM67311.1)、
海榄雌(BAB18544.1)、大麦 BBD1(BAB62847.1)、
大麦 BBD2(BAB62846.1)、甘菊(AAY33872.1)、高
粱 BADH15(AAC49268.1)、辽宁碱蓬(AAL33906.
32　 华　北　农　学　报 25卷
1)、麦冬(ABG34273.1)、人参(AAQ76705.1)、三角
叶滨藜 (AAP13999.1)、水稻(ABB83473.1)、甜菜
(BAE07176.1)、细叶结缕草(BAD34957.1)、小麦
(AAL05264.1)羊草 (BAD86758.1)、异苞滨藜
(ABM97658.1)、玉米(NP-001157804.1)等 17种植
物的 18个甜菜碱醛脱氢酶构建系统发育树 ,由图 3
可见 ,朝鲜碱茅 BADH与大麦 BBD1的亲缘关系
最近 。
方框部分表示醛脱氢酶十肽保守序列及与酶功能有关的 cys位点;下划线部分表示 C端信号肽序列;双下划线部分表示 poly(A)加尾信号序列。
BoxedregionindicatestheconservedmotifofBADHandthecyssite;Theunderlinesshowthesignal
peptideofC-terminal;Thedoubleunderlineisputativepolyadenylylationsignals.
图 2　朝鲜碱茅 BADHcDNA全序列及其推导的氨基酸序列
Fig.2　ThecDNAsequenceanddeducedaminoacidsequenceofBADHfromP.chinampoensis
2期 王　磊等:朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶 cDNA 5′末端序列的克隆及植物表达载体的构建 33　
图 3　系统发育树状图
Fig.3　Phylogenetictree
2.3　朝鲜碱茅 BADH基因植物表达载体鉴定
使用引物 BF1和 BR1进行菌落 PCR初步鉴定
(图 4)。将鉴定的 PCR阳性菌落提取质粒进行测
序 ,测序结果与拼接的 BADHcDNA序列一致 ,表明
载体构建成功 ,质粒图谱见图 5。
M.DL2000;1.BF1和 BR1菌落 PCR鉴定。
图 4　PBI121-BADH重组质粒的鉴定
Fig.4　IdentificationofPBI121-BADH
图 5　PBI121-BADH质粒图谱图
Fig.5　PBI121-BADHplasmid
3　讨论
本研究从朝鲜碱茅叶片中获得了 BADH基因的
5′端 ,与已知序列拼接 ,获得序列全长 1 781 bp,包
含完整的 ORF,编码 506个氨基酸 ,含有醛脱氢酶高
度保守的十肽序列 VSLELGGKSP,以及在其后 29位
点上含有与酶功能有关的半胱氨酸残基 。在已报道
的 BADH氨基酸序列中 ,存在两种有关该酶蛋白定
位的信号肽。一种是 N端信号肽 ,它被认为是定位
于叶绿体的信号 ,其氨基酸序列为 QLFIDGE,但该
信号肽缺乏典型性 。另一种是 C端信号肽 ,氨基酸
序列为 SKL,是定位于过氧化物酶体中的信号 [ 11] 。
本试验获得的朝鲜碱茅 BADH的氨基酸序列 N端
不存在 QLFIDGE,而 C端含有 SKL信号肽序列 ,初
步将其定位于过氧化物酶体中 ,有待于进一步研究。
McCue等 [ 12]在甜菜 BADH基因的研究中提出 ,在这
一基因家族中 ,有存在组成型与诱导型成员或组织
特异性成员的可能性。
Nakamura等 [ 13] 进行 Northern杂交表明 ,大麦
的 2个 BADH基因中 , BBD1在叶片中持续以低水平
表达 ,不具有诱导性 ,而在根系中则受渗透胁迫诱
导;BBD2在根和叶中均受渗透胁迫诱导。本研究
中 ,克隆得到的朝鲜碱茅 BADH氨基酸序列与大麦
BBD1一致性达到 90%,分子进化树分析表明 ,其与
大麦 BBD1同源关系最近 ,很可能执行与大麦 BBD1
类似的功能 ,但该基因的半定量研究 [ 14]则表明 ,其
在叶片中的表达受盐渗透胁迫诱导 ,而且朝鲜碱茅
中 BADH基因是否也以基因家族的形式存在 ,也有
待于进一步研究。
由该序列可知 ,靠近 5′端 250 bp序列 GC/AT
比率大于 75%,使用普通的逆转录酶和 Taq酶均未
能扩增出该片段 。因此我们在总 RNA中加入了终
浓度为 1mol/L的增效剂甜菜碱 [ 15, 16] ,将逆转录温
度提高至 55℃。加入的甜菜碱不仅能够增加酶的
稳定性 ,防止因温度升高而变性 ,而且降低了双螺旋
DNA的稳定性 ,使二级结构容易打开 ,促进逆转录
酶在富含 GC的基因上延伸 。 94℃处理 3 min,冰浴
2 ～ 5 min也使得富含 GC的 mRNA的二级结构充分
打开 。另外 ,在巢式 PCR中 ,我们选择了 GCBufer
Ⅱ ,有助于消除 DNA的二级结构 ,适合对高 GC含
量基因的扩增 ,这也是本次试验能够成功的关键 。
甜菜碱是植物中的一类重要的渗透保护剂 ,
BADH酶是甜菜碱合成的关键酶 ,但很多农作物如
水稻 、油菜 、马铃薯和蕃茄等却不能积累甜菜碱。因
此 ,我们构建了该基因的植物表达载体 PBI121-
BADH,为下一步开展甜菜碱合成酶相关基因表达
研究 ,最终为提高重要农作物抗盐 、抗旱能力 ,有效
地利用大量荒芜的盐碱地和干旱地奠定了基础。
34　 华　北　农　学　报 25卷
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